Lisozima de clara de huevo y su potencial

uso como ingrediente de pptidos

bioactivos
Maritsa Prez Hernndez
Centro de Investigacin de Biotecnologa Aplicada CIBA-IPN Tlaxcala.
Tepetitla de Lardizbal , Tlaxcala 19 de Junio del 2016

Abstract

La lisozima es una protena enzimtica que contiene una cadena

polipeptidica de 130 aminocidos .Esta enzima ha sido objeto de
estudio debido a su poder antimicrobiano que presenta en forma
natural por lo cual tiene un gran campo de aplicacin en la industria
alimentaria como farmacutica .Su estudio se ha llevado a cabo en las
lisozimas presentes en la clara de huevo su aplicacin va desde la
industria lctea hasta su uso en vinos , adems de sus uso en
empaques antimicriobianos.El objetivo de este trabajo es presentar a
lisozima de clara de huevo como un ingrediente potencial de los
alimentos.

Palabras Clave: Lisozima , antimicrobiano , clara de huevo

,ingrediente , conservador .

1.Introduccin

1.1.Descripcin

La lisozima fue descubierta por casualidad por Alexander Fleming en 1922.

Nombr a la lisozima de la protena, lyso debido a su capacidad de lisar bacterias
y zyme porque era una enzima.
La lisozima humana es una protena de 130 residuos. Esta protena est presente
en alta concentracin en diversos tejidos y fluidos incluyendo hgado, cartlago
articular, saliva y lgrimas(Merlini & Bellotti, 2005).

La lisozima (N-acetilmuramil-hidrolasa E.C. 3.2.1.17) es una enzima de bajo peso

molecular (14.400 Da)(Cegielska-Radziejewska, Lesnierowski, Szablewski, &
Kijowski, 2010). La lisozima se clasifica como una muramidasa .Esta protena
enzimtica consiste en una nica cadena polipeptdica de 129 aminocidos . La
lisozima de clara de huevo de gallina es una enzima que acta como glucsido
hidrolasa. Esta pequea protena globular consiste en dos dominios funcionales
situados en cada lado de la hendidura del sitio activo y contiene tanto hlices
como regiones de hoja , junto con regiones de bucle y puentes disulfuro ,su
estructura se muestra en la figura 1(Siddique, Sharma, & Naqvi, 2016).

Ciertos aminocidos presentes en el sitio activo, Asp-52 y Glu-35, son vitales para
la accin cataltica de la lisozima. Estos residuos interactan con las unidades de
azcar 4 y 5, rompiendo el enlace carbono-oxgeno entre ellos insertando una
molcula de agua en esta ubicacin (hidrlisis).

As mismo enzima est contenida en casi todas las secreciones, fluidos

corporales y tejidos de organismos animales(Kutter, 2013). Tambin se ha aislado
de algunas plantas, bacterias y bacterifagos, la clara de huevo es una importante
fuente de muramidasa. De hecho, la clara de huevo de gallina es la principal
fuente comercial de lisozima. La lisozima hidroliza la pared celular de las
bacterias, como las bacterias Gram-positivas, lo que aumenta su permeabilidad y
provoca la ruptura de las clula(Liburdi, Benucci, & Esti, 2014) .

La lisozima de la clara de huevo de gallina es eficaz contra ciertas bacterias

Grampositivas, incluyendo LAB, que a menudo causan deterioro o
fermentacin(Bartowsky, 2009).

La lisozima represent desde su descubrimiento una molcula prototipo para

comprender la complejidad de la estructura y funcin de la protena en la fisiologa
y en las enfermedades .Fue una de las primeras protenas utilizadas como
marcador de las enfermedades(Merlini & Bellotti, 2005)..

Adems la lisozima ha sido ampliamente estudiada en las operaciones de

precipitacin y cristalizacin que son operaciones unitarias utilizadas para
concentrar y purificar protenas a partir de soluciones acuosas los cristales de
protena se utilizan en muchos campos de la industria qumica, incluyendo las
industrias de cosmticos y alimentos, as como en la industria farmacutica(Lopez
Velez, Azzoni, & Pessoa Filho, 2017)

La lisozima acta como agente antimicrobiano (Ibrahim et al., 2001), agente

antiinflamatorio (Ogundele, 1998), y agente anti-VIH (Lee-Huang et al., 1999) y
posee actividad tumoricida (Le Marbre et al. , 1981).

pueden lisar la pared celular de ciertas especies de bacterias a travs de la

hidrlisis del (1 4) glucosdicos del peptidoglicano. Sorprendentemente, las
lisozimas muestran efectos antibacterianos incluso despus de la inactivacin
irreversible. Las lisozimas pueden encontrarse en la leche y en la clara de huevo
de pollo, pero diferentes fuentes llevan a distintos espectros
antibacterianos.(Ramos & Malcata, 2011)

Figura 1. Estructura tridimensional de la protena lisozima. Los

dominios beta y alfa coinciden con la formacin de la hendidura
cataltica.
2.Lisozima y su uso como ingrediente para conservar alimentos

Las enzimas antimicrobianas estn presentes en la naturaleza, donde

desempean papeles relevantes en los mecanismos de defensa de los
organismos vivos contra Infecciones por, por ejemplo, bacterias o hongos. Por
otro lado, los alimentos son intrnsecamente perecederos, debido principalmente a
la posibilidad de contaminacin microbiana. Por lo tanto, varios compuestos
qumicos con accin antimicrobiana han sido utilizados rutinariamente por los
alimentos Industria, en los intentos de prolongar la vida til de los alimentos. Las
enzimas antimicrobianas se han ganado un inters porque son naturales y
pueden ser bastante eficientes en las estrategias de conservacin de alimentos.
Algunas enzimas de grado alimenticio con funciones antimicrobianas ya estn en
uso, pero slo a una escala limitada(Ramos & Malcata, 2011).

La eficacia de la lisozima como conservante en diversos productos alimenticios ha

sido bien establecida ; En particular, la lisozima se ha utilizado con xito para
evitar el soplado tardo de gas de quesos duros, que es causado por el
crecimiento de Clostridium tyrobutyricum. La lisozima es, de hecho, especialmente
activa contra la germinacin de esporas clostridiales; Sin embargo, tambin
muestra actividad contra otras bacterias patgenas o toxingenas, tales como
Bacillus y Listeria spp(Fuglsang, Johansen, Christgau, & Adler-Nissen, 1995).

Las propiedades bacteriostticas y bactericidas de la lisozima han sido

ampliamente utilizado en las industrias alimentaria y farmacutica como en la
medicina. La lisozima se utiliza como conservante para leche y productos lcteos,
carne y productos crnicos as como para las frutas y hortalizas (Cegielska-
Radziejewska et al., 2010).

La lisozima demuestra actividad antimicrobiana contra un espectro limitado de

bacterias y hongos; Sin embargo, su actividad. Puede ser potenciado por otros
conservantes, especialmente nisina.
La lisozima de huevo est catalogada como aditivo de uso alimentario
en Vegetales frescos, pescado, carne, frutas, langostinos y otros
alimentos han sido preservados por contacto de la superficie del
alimento con la lisozima. Esta protena tambin es usada para
conservar otros alimentos como pepinillos Kimuchi, sushi y fideos
chinos. Entre sus usos encontramos la proteccin en los quesos frente
a bacterias dainas como el Clostridium tyrobutyricum que provoca la
hinchazn de los quesos. Varias patentes garantizan que la lisozima a
bajas concentraciones controla el crecimiento de microorganismos en
quesos durante ms de 24 meses. Recientemente se han creado
plsticos que contienen la lisozima adherida fuertemente a un
biopolmero, estos biofilms son utilizados como conservantes por
contacto del alimento con los biopolmeros (Mine & Zhang, 2013).

La lisozima tambin est adquiriendo gran importancia en la

elaboracin del vino. El dixido de sulfuro es comnmente usado
como conservante en enologa. Acta como un antioxidante para
proteger de la oxidacin a los compuestos fenlicos. Adems el SO2
inhibe las oxidasas endgenas y previene la fermentacin indeseable
como fermentacin actica y malolctica(Delfini et al., 2004)

3. Lisozima de clara de huevo.

La lisozima se clasifica en seis tipos como se muestra en el esquema

1. De todas las lisozimas existentes, la lisozima de huevo de gallina ha
sido la ms estudiada, por encontrarse en alta concentracin (1-3 g/L
de clara de huevo), su fcil manejo y la posibilidad de purificacin por
cristalizacin en NaCl al 5% a pH 9,5. La lisozima de huevo es una
protena que puede representar cerca del 3,4% de las protenas de la
clara de huevo. Su masa molecular es 14.307 Da y est compuesta
por una secuencia de 129 residuos de aminocidos. Es una protena
muy catinica, con un punto isoelctrico (pI= 10,7), con 19
aminocidos en su secuencia que se encuentran cargados
positivamente. Posee cuatro puentes disulfuro que le confieren una
alta estabilidad, en ellos se encuentran las ocho cistenas presentes
en la molcula(You, Udenigwe, Aluko, & Wu, 2010)

Lisozima de gallina
Lisozima de Ganso
tipo C(lisozima de Lisozima de plantas
(tipo G)
estomago )

Lisozima de
Lisozima del fago
Lisozima bacteriana Invertebrados (tipo
T4
I)

Esquema 1. Clasificacin de Lisozimas . Cuatro de estas lisozimas: tipo-C, tipo-I, tipo-G y lisozima
T4 tienen la estructura tridimensional muy parecida(recuadros verdes)

Se han desarrollado muchos mtodos de aislamiento para la lisozima de clara de

huevo de gallina desde cromatografa de intercambio catinico o ultrafiltracin
hasta llegar a mtodos como cromatografa de intercambio inico con columnas y
membranas microporosas.
Funciones biolgicas de la lisozima

La lisozima es de la clase de enzimas que destruye las paredes celulares de

ciertas bacterias Gram-positivas por ruptura del enlace (1-4) entre el cido N-
acetilmurmico (NAM) y N-acetilglucosamina del peptidoglicano (NAG) [Figura 2],
debilitando as la pared celular. El resultado es la penetracin de agua en la clula
que se hincha y acaba por estallar, un fenmeno denominado lisis(Cegielska-
Radziejewska et al., 2010)

Estructuras Repetitivas del peptidoglicano de la pared celular de bacterias .Se

muestra el sitiode corte de la lisozima.

4. Peptidos Biactivos de lisozima de clara de huevo

Muchas investigaciones se han llevado a cabo sobre pptidos bioactivos derivados

de hidrolizados de protenas alimentarias debido a sus potenciales nutracuticos
en relacin con el desarrollo de alimentos funcionales (Hyun,2000). Los pptidos
no son activos dentro de la protena de origen, pero pueden liberarse y activarse
despus de la digestin enzimtica (Phelan, Aherne, FitzGerald, & OBrien, 2009).
Los pptidos bioactivos se incorporan ahora en forma de ingredientes en
alimentos funcionales, nuevos alimentos y nutracuticos ((Lee et al., 2009).

Las protenas de huevo y sus derivados son grupos principales de compuestos

considerados como inhibidores potenciales ECA. La lisozima de clara de huevo de
gallina (HEWL), que comprende el 3,4% de las protenas totales de clara de
huevo, fue hidrolizada para la produccin de pptidos bioactivos obtenido a partir
de la combinacin de tripsina y papana de acuerdo a las investigaciones
realizadas por (Memarpoor-Yazdi, Asoodeh, & Chamani, 2012) mostr las
mayores actividades inhibidoras y antioxidantes de ACE cuando se compar con
los hidrolizados preparados por tripsina o papana. Por lo tanto, el hidrolizado
preparado por una combinacin de las dos enzimas puede ser una fuente rica de
pptidos bioactivos multifuncionales, que son liberados por digestin enzimtica.

Conclusin

La lisozima es una protena que puede encontrarse forma natural en nuestro

organismo adems de que esta tiene aplicaciones tanto en la industria
alimentaria como farmacutica como antimicrobiano .Por otra parte hay otras
fuentes donde podemos obtener estas protenas como lo es la clara de huevo que
es rica en esta adems que podemos darles un tratamiento enzimtico para
obtener sus pptidos y as poder tener nuevas aplicaciones de esta protena que
podran ser utilizadas como un ingrediente funcional al ser aadido a los alimentos
y no solo limitar sus uso como antimicrobiano . De acuerdo a la revisin realizada
aun no se reportan pptidos bioactivos de la protena lisozima de cascara de
huevo que presenten actividad antioxidante que puedan ser aplicados como
ingredientes funcionales.

Metodologa: Preparacin de Hidrolizados , Separacin y purificacin

,simulacin de digestin

Propuesta.

Obtener pptidos bioactivos antioxidantes de lisozima de clara de huevo.

 Metodologa

Centrifugar Hidrolizados Preparacin de Hidrolizados Agregar enzimas

10,000 g por 95 10 min Muestra (50 mg/mL)a pH 10
(Alcalasa y Pancreatina )

Realizar pruebas de

Grado de Hidrolisis
DPPH ensayo de actividad de
eliminacin de radicales.
Ensayo de actividad de
eliminacin de radicales OH
Determinacin de la actividad
de eliminacin del radical O2

El hidrolizado (0,5 g) se
disolver en 10 ml de
Cromatografa de intercambio de iones
tampn Tris-HCl 10 mM (pH
7,6) y se cargara en una
columna de intercambio
inico a 240 nm

fraccin A de 100 mg / ml se
La adicin de los carg a una velocidad de
Resina de adsorcin macroporosa
hidrolizados se detendr , flujo de 60 ml / h en la
cuando el valor de columna de cromatografa
absorcin alcance ms de inico a 240 nm
0,1.

las muestras se digerirn en

Composicin de aminocidos de solucin de HCl 6 M que
hidrolizados contena fenol al 1% a
105C durante 24

Se inyectara una dosis (10

Determinacin de la masa molecular por lL) se detect usando
ESI-MS. espectrometra de masas
 Digestin simulada del tracto
gastrointestinal

Resultados

Se espera que con este mtodo sea el idneo para obtener pptidos
biactivos antioxidantes y simulando la digestin gstrica estos se vea
como un ingrediente potencial para la industria alimenticia

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