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CAPTULO I

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

1.1. DESCRIPCIN DE LA REALIDAD PROBLEMTICA

En la actualidad, el poblador, es propenso a adquirir ciertas enfermedades que

pueden afectar su salud y en muchas ocasiones comprometer su vida. Se viene

observando en la sociedad, tanto en las zonas urbanas y rurales, con frecuencia

verse afectada por ciertas infecciones causadas por bacterias y hongos, en especial

en personas con el sistema inmune debilitado. Siendo lo ms recurrentes los:

Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes y Candida albicans.

Es as, que el hombre, con el afn de encontrar un alivio a estas enfermedades,

recurre como opcin a la medicina tradicional. El mismo que resulta ser un

tratamientro sencillo, barato y eficaz.

1.2. FORMULACIN DEL PROBLEMA

Presenta actividad bactericida y fungicida del extracto etanlico de Bixa orellana

L., y Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry contra Streptococcus

pyogenes, Staphylococcus aureus y Candida albicans?

1.3. JUSTIFICACIN E IMPORTANCIA

Desde la antigedad el hombre utiliza las plantas con fines alimenticios y tambin

curativos, entre las cuales destaca las hojas de Bixa orellana L., (achiote) y

Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry (clavo de olor).

Son ampliamente utilizados tradicionalmente por su actividad bactericida,

antisptica y fungicida.

12
La parte utilizada de la especie en mencin son las hojas de Bixa orellana L.,

(Achiote) y botones (Flores que aun no abren) secos del rbol de Syzygium

aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry (Clavo de olor), siendo estos el objeto de

estudio para la presente investigacin.

Es muy importante constatar que metabolitos secundarios se encuentran presentes

en las hojas de Bixa orellana L., (Achiote) y botones secos del rbol de Syzygium

aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry (Clavo de olor), donde se realizar un

estudio fitoqumico lo cual es de suma utilidad para corroborar a cuales de ellos se

le atribuir las propiedades teraputicas mencionadas.

El objetivo de la investigacin es determinar la accin bactericida y fungicida in

vitro de los extractos de las hojas de Bixa orellana L., botones secos del rbol de

Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry, contra la bacteria Staphylococcus

aureus causante de infecciones como: foliculitis, forunculosis o conjuntivitis,

hasta enfermedades de riesgo vital, como celucitis, abscesos profundos,

osteomielitis, meningitis, sepsis, endocarditis o neumona. Adems tambin puede

afectar el aparto gastrointestinal, ya sea por presencia fsica de Staphylococcus

aureus o por ingesta de la enterotoxina estafiloccica secretada por la bacteria.

Asi mismo tambin contra Streptococcus pyogenes es una bacteria Gram positiva

que crece en cadenas largas.

Se asocia a muchas enfermedades, algunas muy importantes: faringitis

estreptoccica, infecciones de la piel por estreptococo (Celulitis, erisipelas,

imptigos, fascitis necrotizante). La faringitis se puede complicar con la aparicin

de un exantema difuso (Escarlatina), lo que ocurre con algunas cepas de

estreptococo. Otras enfermedades que puede causar son la bartolinitis y sndrome

de shock txico por estreptococo. Tambin puede causar enfermedad a travs de la


13
reaccin de sistema inmune, como en la fiebre reumtica y la glomerulonefritis

postestreptoccica.

Y tambin candida albicans puede ser patgena provocando la candidiasis; en ese

caso se presenta como una afeccin vaginal (Vaginitis), de la cavidad oral

(Muguet) del intestino o de la piel.

En un fsico debilitado, inmunedeprimido o convaleciente de un largo cura

antibitica, la candida se multiplica en modo anmalo y atraviesa el intestino, para

entrar al torrente sanguneo, donde libera sus propias toxinas provocando la

candidemia. Este fenmeno da lugar a algunos sntomas abdominales: Mala

digestin, intolerancia alimentaria, irritibilidad, insomio, prdida de la memoria,

dolores de cabeza y depresin.

La candidiasis induce tambin una disminucin de la absorcin de las sustancias

nutritivas por lo que se podra producir un estado de malnutricin.

1.4. OBJETIVO DE LA INVESTIGACIN

1.4.1. Objetivo general:

- Determinar la actividad bactericida y fungicida de extracto etanlico de Bixa

orellana L., (Achiote) y Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry (Clavo

de olor).

1.4.2. Objetivos especficos:

- Identificar los metabolitos secundarios del extracto etanlico de las hojas de

Bixa orellana L., (Achiote) y el extracto etanolico de los botones de Syzygium

aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry (Clavo de olor).

14
- Evaluar el efecto inhibitorio del extracto etanlico de Bixa orellana L.,

(Achiote), del extracto etanlico de Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M.

Perry (Clavo de olor), y del extracto etanlico de la combinacion de Bixa

orellana L., (Achiote) mas Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry

(Clavo de olor).

- Determinacin de la actividad bactericida del extracto etanlico de Bixa

orellana L., (Achiote), y del extracto etanlico de Syzygium aromaticum (L.)

Merr. & L. M. Perry (Clavo de olor)

- Determinacin de la actividad bactericida del extracto etanlico de la

combinacin de Bixa orellana L., (Achiote) mas Syzygium aromaticum

Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry (Clavo de olor).

- Determinacin de la actividad fungicida del extracto etanlico Bixa orellana

L., (Achiote) y del extracto etanlico de Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L.

M. Perry (Clavo de olor)

- Determinacin de la actividad fungicida de la combinacin de Bixa orellana

L., (Achiote) mas Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry (Clavo de

olor).

1.5. HIPTESIS Y VARIABLES

1.5.1. Hiptesis

El extracto etanlico de las hojas de Bixa orellana L., (Achiote) y el extracto

etanlico de los botenes de Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry (Clavo

de olor) presentan actividad bactericida y fungicida contra Streptococcus

pyogenes, Staphylococcus aureus y Candida albicans

15
1.5.2. Variables

Variables independientes.

Los extractos etanlicos de las hojas de Bixa orellana L., y botones de

Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry.

Variables dependientes.

Actividad bactericida y fungicida contra Streptococcus pyogenes,

Staphylococcus aureus y Candida albicans.

16
CAPTULO II

BASES TERICAS

2.1. ANTECEDENTES:

Existen evidencias cientficas de las especies Bixa orellana L., y Syzygium

aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry en reportes referidos, se citan a

continuacin:

Hossain et al, 2014; Joshi et al, 2010; Naveeed et al; 2013; oliveira et al, 2013;

Pandey y Singh, 2011; Park etal, 2007; Pinto etal, 2009. En diversos pases el

aceite esencial de syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry haba sido

conocido a ampliamente como un potente antimicrobiano contra diversas bacterias

y hongos, con el compuesto eugenol como el ingrediente principal.5, 6

Alma et al., (2007). Estudios realizados en Turqua dan como resultado que el

aceite proveniente del Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry (Clavo de

olor) est compuesto por diferentes constituyentes, siendo el eugenol el principal,

variando de 49-87%, - caryophyleno (421%) y acetato de eugenol (0.5 21%)

en pequeas cantidades de -humuleno, adems de otros constituyentes5, 6.

Pinto y col (2009). En Colombia determinaron la CIM (Concentracin Inhibitoria

Mnima) de Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry y de su principal

fitoqumico, el eugenol, sobre cepas de Candida albicans, de dermatofitos y de

aspergillus, dando como resultado la sensibilidad de estos microorganismos frente

al eugenol5, 6.

17
Gonzlez y col (1989). En Colombia se emple un extracto alcohlico de Bixa

orellana L., en piel daada de conejos Nueva Zelanda y se logr una recuperacin

de la lesin total a los 3 das de la aplicacin del producto6.

18
Castello et al, 2002.; Irobi el al 1996. En un ensayo clnico donde se emple una

crema a base de Bixa orellana L., al 5 y 10 % en conejos y ratas, a los

cuales se les aplic en heridas quirrgicas o accidentales, se comprob un

fuerte efecto cicatrizante.

Los resultados de varios estudios demostraron que la Bixa orellana L., tiene

efectos inhibidores sobre el Bacillus cereus, Clostridium perfringens, y

Staphylococcus aureus a concentraciones de 0,08, 0,31, y 0,16 %

respectivamente. A concentraciones de un 0,63 % inhibe el crecimiento del

Streptococcus thermophilus, Lactobacillus casei sub sp. casei, Lactococcus

lactis y Paenibacillus polymyxa, y las concentraciones para la inhibicin de

Listeria monocytogenes y Enterococcus durans fueron de 1,25 y 2,5 %

respectivamente. No se detect actividad de la Bixa orellana L., ante

Lactobacillus plantarum, Bifidobacterium bifidum, levaduras y algunas

bacterias Gram negativas. Otros estudios mostraron la actividad ante el

Cryptococcus neoformans

Tambin se detect actividad ante la Neisseria gonorrhoeae, Trichomona

vaginalis, T. faecalis, la Leishmania y mltiples hongos patgenos. De

manera general la actividad fue superior contra grmenes Gram positivos

aunque se demostr tambin contra Gram negativos3.

Gmez y col, (2012). En Colombia se realizaron estudios con resultado que los

componentes principales de la planta Bixa Orellana L., se encuentran los

carotenoides, los cuales comprenden alrededor de un 4 a 5 %, en especial

apocarotenos: Bixina y pequeas cantidades de isobixina y norbixina4.

2.2. MARCO TERICO.

19
2.2.1. Ubicacin geogrfica de Bixa orellana L., y Syzygium aromaticum (L.)

Merr. & L. M. Perry.

Bixa orellana L., conocida vulgarmente como achiote, es un rbol nativo de

Brasil, se encuentra ampliamente distribuido en casi todas las zonas

tropicales, incluyendo el sureste de Mxico. Los principales productores son

Jamaica, Ecuador y Brasil.1,4,7

Cultivado y naturalizado en las regiones tropicales y sub-tropicales del mundo, se

puede cultivar desde el nivel del mar hasta unos 1200 m.s.n.m. con una

temperatura entre los 24 30C, prosperando en diversidad de suelos con

buen drenaje. La distribucin del achiote en el Per est circunscrita a los

departamentos de Amazonas, Cuzco, Hunuco, Junn, Lima, Loreto, Madre

de Dios, San Martn y Ucayali, y otras regiones desde 0-1000 m.s.n.m. 2,3,8.

Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry pertenece a la familia Myrtaceae.

Originariamente se trata de un rbol procedente de las Islas Molucas

(Indonesia), el 70% de la produccin mundial de la semilla de clavo tiene

lugar en Indonesia, aunque en la actualidad el cultivo tambin se ha

extendido a Madagascar, Zanzbar, India y Sri Lanka 9.

2.2.2. Usos en medicina popular.

20
En Venezuela las hojas de Bixa orellana L., se aplicaban como cataplasma para

aliviar el dolor de cabeza y la decoccin en grgaras para los males de

garganta. Tradicionalmente la pulpa se aplica sobre las quemaduras, para

impedir la formacin de ampollas y llagas.

En Guatemala existen referencias de que se us Bixa orellana L.,

para evitar las cicatrices que deja la viruela en la epidermis, con magnfico.

Algunos curanderos de la Amazona peruana colocan el jugo de las hojas

frescas exprimidas del achiote en los ojos, para la inflamacin e infeccin;

para la epilepsia, el jugo es utilizado en combinacin con doce frutas y

tomado dos veces diariamente por cinco das. El achiote es usado por los

curanderos como un antdoto para las mordeduras de serpientes y se cree

que las semillas son un expectorante, mientras se piensa que las races

ayudan en la digestin y suprimen la tos.

Asimismo, el achiote tradicionalmente ha sido utilizado para desrdenes de la

prstata e inflamaciones internas, hipertensin arterial, colesterol elevado,

cistitis, obesidad, insuficiencia renal y para eliminar cido rico En Trinidad

y Tobago de acuerdo a un estudio basado en entrevistas etnobotnicas

llevadas a cabo desde 1996-2000, se hall que la Bixa orellana L., es

utilizada para la Diabetes mellitus y la ictericia. Se podran mencionar otros

usos del achiote como: Astringente, febrfugo, antidisentrico, diurtico,

afrodisaco y para el tratamiento de enfermedades venreas, erisipelas,

fiebres intermitentes y otras afecciones. Estas evidencias de uso tradicional

han sido un paso preliminar para garantizar la efectividad y la seguridad del

achiote, as como servir de sustento para los ensayos clnicos y como

informacin de sus propiedades teraputicas3, 4, 8, 10.


21
Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry, usos basados en la tradicin.

Dolor abdominal, acaricida (Un agente que destruye los caros), alergias,

afrodisaco, asma, arterioesclerosis (Endurecimiento de las arterias), pie de

atleta, mal aliento, purificador de la sangre, adelgazante de la sangre, cncer,

clico, tos, contrairritante, menor tiempo de trnsito gstrico, diabetes,

diarrea, dispepsia, saborizante (Para alimentos y cigarrillos), preservante de

alimentos, gota, hernia, lceras del herpes simplex, hipo, hipertensin,

inflamacin, insecticida, mimtico de insulina, gas, piojos, reductor de

lpidos, relajante muscular, nuseas o vmito, dolor, neurodegeneracin,

candidiasis oral, espasmo muscular, parsitos, relajante muscular (Aceite de

clavo de olor), dolor de estmago, toxicidad (Prevencin de toxicidad

inducida por arsenita), lceras, candidiasis vaginal (Prevencin y

tratamiento), vaso relajante (Aceite de clavo de olor).

En aplicacin tpica: Neuralgias, odontalgias y otras afecciones de la pulpa

dentaria (Como antisptico-analgsico), acn, artritis reumatoide11.

2.2.3. Descripcin botnica.

a. Morfologa

Bixa orellana L., rbol bajo de copa redonda, excepcionalmente alcanza hasta

los 8-10 metros de altura, corteza parda, el rbol presenta una forma muy

variada, ramas delgadas tendiendo a leosas y su coloracin vara de verde a

morado, ramificacin dicotmica y se inicia desde la base del tronco.

22
a.1. Hojas.- Simples, alternas, ovadas, tiene de 8 a 10 cm. de largo y de 4 a

15 cm. de ancho, con un pice acuminado, disminuyendo gradualmente y la

base truncada es algo acorazonada, el color del envs es algo plateada

especialmente cuando maduras, las mismas que se tornan algo coriceas.

a.2. Flores.- Son panculas terminales, la floracin es escalonada, la

apertura de las flores ocurren primero en la posicin superior y luego se

abren de la parte inferior. Las flores tienen 5 spalos, caducos, rojizos o

blancos, ovales que miden 2,4 a 2,8 centmetros de largo en el pice: El

color puede variar desde blanco hasta rosado o morado, el tamao es

variado, el bastn floral es globuloso, dando la impresin de estar

recubierto por sucesivas capas (Spalos). Las flores poseen 5 ptalos,

redondos o de forma ovalada de 1 a 2 cm de largo, rosado o blancos segn

el cultivar. Los estambres son pequeos con pednculos cortos muy

numerosos (350-400), dispuestos alrededor del pistilo, la antera contiene 8

sacos embrionarios que producen abundante polen.

a.3. El pistilo tiene un estigma en forma de boca abierta y el estilo es

alargado, erecto y llega a tener la forma de Sal madurar, termina en un

ovario de tipo elipsoidal spero recubierto por muchos pelos glandulares.

a.4. El ovario.- consta de 2 valvas, ocasionalmente 3, a cuyos costados en la

placenta alberga numerosos vulos.

a.5. Las flores son hermafroditas, regulares, bisexuales y actinomrficos.

23
a.6. Fruto.- Es una cpsula dehiscente, hemisfrica, ovoide, cnica, cubierta

por espinas largas y suaves en la mayora de los cultivares, lisa en algunas y

su color puede ser rojo, caf, verde o amarillo cuando est maduro y se

abren en dos valvas, las paredes son delgadas y en el lado interno de cada

valva hay una placenta, que se prolonga en una membrana blanca adherida

en parte a la pared del fruto, presenta placentacin parietal laminar. Cada

placenta lleva numerosas semillas recubierta por una membrana fina y

blancuzca, debajo de esta hay una capa de parnquima acuoso anaranjado

brillante o rojizo amarillento. Se puede encontrar frutos trivalvares, lo cual

puede ser una caracterstica beneficiosa para aumentar la capacidad de

produccin. Del arilo de la semilla se obtiene la bixina que viene a ser un

carotenoide, que es muy utilizado en industria alimentaria 2, 4, 7, 12.

Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry, rbol perenne de la familia

Myrtaceae, de hasta 20 m de altura, cuando el cultivo se destina a la

produccin no supera los 10 m. Su tallo es erecto y de corteza gris. Destacan

sus hojas puntiagudas, oval lanceoladas, muy aromticas y de color verde

intenso. Las hojas contienen numerosas glndulas que le dan aspecto pegajoso.

Sus flores se encuentran en inflorescencias en forma de panculas al final de las

ramas jvenes. Poseen cuatro ptalos rosas y varios pistilos amarillos. Los

frutos son de colores rojo oscuro, pequeo y alargados5.

b. Clasificacin taxonmica:

24
Las muestras vegetales fueron clasificadas en el Herbario del Museo de

Historia Natural de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, como:

Bixa orellana L., por el Bilogo Mario Benavente P. y el Syzygium aromaticum

(L.) Merr. & L. M. Perry por el Magister Asuncin Cano Echevarra; teniendo

la siguiente posicin taxonmica segn la clasificacin sistemtica de

Cronquist (1988).

DIVISIN: MAGNOLIOPHYTA

CLASE: MAGNOLIOPSIDA

SUBCLASE: DILLENIIDAE

ORDEN: VIOLALES

FAMILIA: BIXACEAE

GNERO: Bixa

ESPECIE: Bixa orellana L.,

Nombre Vulgar: Achiote

DIVISIN: MAGNOLIOPHYTA

CLASE: MAGNOLIOPSIDA

SUBCLASE: ROSIDAE

ORDEN: MYRTALES

FAMILIA: MYRTACEAE

GNERO: Syzygium

ESPECIE: Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry

Nombre Vulgar: Clavo de olor

25
2.2.4. Descripcin de los microorganismos patgenos ensayados.

Los microorganismos patgenos (Bacterias y hongo) son procedentes de muestras

clnicas humanas debidamente certificadas. Los aislados bacterianos pertenecen a

las siguientes especies:

- Staphylococcus aureus

- Streptococcus pyogenes

- Candida albicans

a. Staphylococcus aureus

26
a.1. Generalidades.

Es un coco Gram positivo, distribuido a manera de racimos, es altamente

patgeno y responsable de un amplio conjunto de enfermedades produce

lesiones superficiales de la piel y abscesos localizados en otros sitios. Causa

infecciones en el sistema nervioso central e infecciones profundas como

osteomielitis y endocarditis; infecciones respiratorias como neumonas,

infecciones del tracto urinario y es la principal causa de enfermedades

nosocomiales; el 40% a 50% de los seres humanos son portadores nasales de

Staphylococcus aureus, estas se encuentran en ropas personales de cama o

ambientes humanos. En la actualidad las cepas de Staphylococcus aureus

tienen un amplio rango de resistencia a los antibiticos y se pueden

encontrar cepas resistentes14.

a.2. Caractersticas microscpicas.

Coco Gram positivo, distribuido en grupos irregulares a manera de racimo,

tiene un tamao entre 0,5 y 5 m14.

a.3. Caractersticas macroscpicas.

Colonias pequeas y medianas, de bordes uniformes, de consistencia

cremosa, color amarillo traslcido14.

27
Figura 1: Colonias de Staphylococcus aureus.

b. Streptococcus pyogenes

b.1. Generalidades.

Es una bacteria, anaerobia facultativa, inmvil, no produce esporas. Es uno

de los patgenos de mayor importancia en el ser humano, es parte de la flora

normal de la cavidad bucal, requiere una baja tensin de oxgeno para

crecer.

28
Es un coco Gram positivo que se agrupa en cadenas, posee cpsula y su

pared est constituida por carbohidratos, protenas y cido lipoteico. Es

catalasa negativa y sensible a la bacitracina15.

A la tincin de Gram se observan cocceas Gram positivas dispuestas en

largas cadenas y ocasionalmente en pares. Es un patgeno ubicuo de

distribucin universal. Las manifestaciones clnicas son variadas abarcando

desde faringitis hasta formas graves y fulminantes, como la fascitis

necrosante o el resurgimiento como causa importante del sndrome del

shock txico. La infeccin con este patgeno est relacionada con dos

complicaciones agudas potencialmente graves: Fiebre reumtica y

glomerulonefritis aguda. Tambin se han descrito casos de meningitis que se

producen por contigidad desde un foco de infeccin, como otitis, sinusitis

o mastoiditis16, 17.

b.2. Caractersticas microscpicas.

Coco Gram positivo, se agrupa en pares o cadenas de 0,6-1.0 m de

dimetro18.

b.3. Caractersticas macroscpicas.

Streptococcus pyogenes da lugar a colonias blancas o grises, de 1 a 2 mm de

dimetro, rodeadas de zonas de lisis completa de los eritrocitos presentes en

el medio de cultivo19.

Figura 2: Colonias de Streptococcus pyogenes.

29
c. Candida albicans

c.1. Generalidades.

El gnero Candida est constituido por levaduras de desarrollo unicelular,

comprende ms de 150 especies. El medio ms utilizado para el aislamiento

de este microorganismo es el agar Sabouraud en ocasiones con cloranfenicol

para inhibir la flora acompaante

La pared celular es de espesor variable y depende de la etapa de crecimiento

celular y del medio seleccionado para su crecimiento. Uno de sus

componentes, la quitina, ayuda durante la formacin de las clulas en el

ciclo celular ya que forma la unin durante la separacin entre madre e hija

en el proceso de gemacin20.

Candida albicans es considerada un hongo patgeno oportunista en

mamferos, entre ellos el hombre, que puede causar varias formas de

candidiasis, desde infecciones superficiales en mucosas hasta enfermedades

sistmicas que comprometen la vida, predominantemente, en individuos con

el sistema inmune debilitado. Candida albicans al igual que otros patgenos

tiene la capacidad de adherirse y formar biopelculas en aparatos

implantados, especialmente catteres intravasculares lo que les confiere

mayor resistencia a antifngicos. Candida albicans es una levadura

comensal, presente en las mucosas de los de seres humanos y los animales

de sangre caliente, siendo habitualmente aislada de la cavidad oral, el tracto

gastrointestinal y urogenital, y su conversin en agente patgeno depende

principalmente de la alteracin del equilibrio entre la microbiota y el sistema

inmunitario del hospedador21.

30
c.2. Caractersticas microscpicas.

Hongo dimorfo que forma largas hifas con gruesa pared refringente (8-16

m de dimetro), tiene un tamao 3-8 x 2-7 m 6.

c.3. Caractersticas macroscpicas.

Macroscpicamente, en agar Sabouraud crece formando colonias blancas,

blandas, cremosas y lisas22.

31
Figura 3: Colonias de Candida albicans.

2.2.5. Pruebas de susceptibilidad in vitro.

Es importante mencionar que existen estudios qumicos de las especies Bixa

orellana L., y Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry que descubren

componentes fitoqumicos responsables de accin bactericida. No existen

estudios anteriores que traten especficamente sobre la actividad

antibacteriana del extracto etanlico de Bixa orellana L., Syzygium

aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry y la combinacin de ambos extractos

etanlicos, in vitro sobre microorganismos como Streptococcus pyogenes,

Staphylococcus aureus y Candida albicans.

Estos ensayos se realizan en el laboratorio y permiten medir la susceptibilidad de

microorganismos patgenos frente a una sustancia o mezcla de sustancias de

origen vegetal con potencial antimicrobiano y/o antifngico.

La evaluacin de la eficacia antimicrobiana se realiza determinando la inhibicin

del crecimiento del microorganismo en estudio, existen tcnicas para

evaluar los antimicrobianos como: Mtodo de disco difusin, difusin en

gel, mtodos de dilucin, etc14.

2.2.6. Mtodos de difusin en agar.

a. Mtodo del antibiograma disco-placa.

32
El antibiograma disco-placa basado en el trabajo de Kirby, Bauer y

colaboradores es uno de los mtodos que se recomienda para la determinacin

de la sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos. El antibiograma disco-placa

consiste en depositar, en la superficie de agar de una placa de petri previamente

inoculada con el microorganismo, discos de papel secante impregnados con los

diferentes antibiticos. Tan pronto el disco impregnado de antibitico se pone

en contacto con la superficie hmeda del agar, el filtro absorbe agua y el

antibitico difunde al agar. El antibitico difunde radialmente a travs del

espesor del agar a partir del disco formndose un gradiente de concentracin.

Transcurridas 18-24 horas de incubacin los discos aparecen rodeados por una

zona de inhibicin. El antibiograma est indicado cuando se asla una bacteria

responsable de un proceso infeccioso y no puede predecirse su sensibilidad,

especialmente si se sabe que este tipo de bacteria puede presentar resistencia a

los antimicrobianos ms habituales. Estas pruebas de sensibilidad tambin son

tiles en estudios epidemiolgicos ya que el resultado del antibiograma puede

ser considerado como el primer marcador epidemiolgico de que se dispone. El

mtodo de disco-placa es fcil de realizar, rpido y barato. Es una metodologa

aplicable a una amplia variedad de bacterias, fundamentalmente bacterias

aerobias no exigentes de crecimiento rpido como Staphylococcus spp.,

Streptococcus spp., enterobacteriaceae, pseudomonas spp., etc23.

33
b. Mtodo de dilucin.

Llamado tambin turbimtrico, consiste en hacer diluciones seriadas del

extracto en l/mL en caldo de cultivo con una suspensin calibrada del

organismo y se incuban a tiempo y temperatura determinados, finalizado el

periodo de incubacin, los tubos se examinan visualmente para comprobar la

existencia o no de turbidez.

Estos mtodos se vienen utilizando para la determinacin de la Concentracin

Inhibitoria Mnima (CIM) y la Concentracin Bactericida Mnima (CBM) de

los antimicrobianos14.

2.2.7. Tincin de Gram.

a. Generalidades.

Es una tcnica diferencial empleada en el diagnstico microbiolgico, para esta

tcnica se emplean los siguientes reactivos14:



Alcohol cetona (Decolorante)

Cristal violeta (Colorante bsico)

Lugol (Mordiente)

Safranina (Colorante de contraste)

b. Fundamento.

Las bacterias Gram positivas, debido a la estructura y composicin bioqumica

de su pared celular, retienen el complejo cristal violeta-lugol, por lo que se

observa el color prpura o violeta al microscopio.

34
Las bacterias Gram negativas pierden el colorante bsico cuando son tratadas

con el decolorante debido a que el alcohol disuelve el contenido lipdico de la

pared celular, dando como resultado el complejo cristal violeta-lugol, las

bacterias decoloradas captan entonces el colorante de contraste, razn por la

cual estas bacterias se observan de color rojo al microscopio.

2.2.8. Concentracin inhibitoria mnima (CIM).

a. Definicin.

Es la menor concentracin o cantidad del antimicrobiano en g/mL que es

capaz de inhibir el microorganismo en estudio14.

b. Principio.

En este mtodo la sensibilidad es medida por la inhibicin de las bacterias en

una serie de tubos con medio de cultivo lquido y concentraciones decrecientes

del extracto.

2.2.9. Concentracin Bactericida mnima (CBM).

a. Definicin.

Es la menor concentracin o cantidad del antimicrobiano en l/mL que mata

los microorganismos en estudio14.

b. Principio.

Es la concentracin mnima del antimicrobiano que da un subcultivo estril,

pudiendo determinarse subcultivando los cultivos en caldos empleados para la

CIM en medios slidos.

35
2.2.10. Porcentaje de inhibicin relativa (PIR): Para la determinacin del

Porcentaje de Inhibicin Relativa (PIR) se utilizaron los resultados obtenidos por

los extractos frente a los controles positivos14.

PIR (%) = A X 100


B

36
A= Promedio del dimetro del halo de inhibicin de la muestra.

B= Promedio del dimetro del halo de inhibicin de los controles positivos.

2.2.11. Resistencia microbiana.

a. Generalidades.

La resistencia bacteriana es un fenmeno creciente caracterizado por una

refractariedad parcial o total de los microorganismos al efecto del antibitico

generado principalmente por el uso indiscriminado e irracional de stos y no

slo por la presin evolutiva que se ejerce en el uso teraputico24.

En aos recientes se ha observado un aumento marcado en las infecciones

causadas por Candida spp. (Incluye Candida. albicans y otras especies de

Candida), infecciones que tienden a ocurrir especialmente en huspedes

inmunocomprometidos25, 26.

A partir de la introduccin del fluconazol en 1990, se gener una presin selectiva

a travs del uso de este agente para tratamiento o profilaxis, que pudo

generar seleccin de microorganismos resistentes. Se determinaron cambios

en la ecologa de la flora intrahospitalaria en varios estudios que

demostraron que tras el uso de fluconazol se incrementaba la colonizacin

por Candida no albicans. Esto fue claramente visible en especial con la

estrategia de profilaxis en pacientes con neoplasias hematolgicas bajo

protocolos de quimioterapia.

b. Factores.

Varios son los factores que han contribuido a su aparicin:

La presin selectiva ejercida al prescribir formal o libremente

medicamentos para uso teraputico en humanos o animales.

37
La utilizacin generalizada de antimicrobianos en pacientes

inmunocomprometidos y en la unidad de cuidados intensivos.

El uso de dosis o duracin inadecuada de la terapia antimicrobiana24.

2.3. MARCO CONCEPTUAL.

-Extracto vegetal.

Preparado que permite extraer de las plantas determinadas sustancias tiles que

pueden tener diferentes efectos.

- Metabolitos secundarios.

Se llaman as a los compuestos qumicos sintetizados por las plantas que cumplen

funciones no esenciales en ellas, de forma que su ausencia no es letal para el

organismo, al contrario que los metabolitos primarios. Los metabolitos

secundarios intervienen en las interacciones ecologas entre la planta y su

ambiente.

- Infeccin.

Invasin de un anfitrin por un microorganismo patgeno, su multiplicacin en

los tejidos y la reaccin del anfitrin a su presencia y a los de sus posibles toxinas.

Las infecciones pueden deberse a: bacterias, hongos, virus, etc. Las infecciones

pueden ser adems locales o sistmicas.

- Bacterias Gram positivas.

Se conocen como bacterias Gram positivas al grupo de bacterias que no poseen

una membrana externa capaz de proteger el citoplasma bacteriano, que tiene una

gruesa capa de peptidoglucano y que presenta acidos teicoicos en su superficie.

38
- Bacterias Gram negativas.

Son aquellas que presentan dos membranas lipdicas y entre ellas se localiza una

fina pared celular compuesta fundamenalmente por peptidoglucano.

- IN VITRO.

Se refiere a una tcnica para realizar un determinado experimento en un tubo de

ensayo o generalmente en un ambiente controlado fuera de un organismo vivo.

- Halos de inhibicin.

Zona alrededor de un disco de antibitico en un antibiograma en el que no se

produce crecimiento bacteriano en una placa de agar inoculada con el grmen. Es

una medida de la potencia del antibitico frente al grmen.

- Antibiograma.

Es la prueba microbiolgica que se realiza para determinar la susceptibilidad

(sensibilidad o resistencia), de una bacteria a un grupo de antibiticos. Las

tcnicas de antiobiogramas son utilizadas en el laboratorio de microbiologa para

estudiar la actividad de los antimicrobianos frente a los microorganismos

responsables de las infecciones.

39
CAPTULO III

METODOLOGA

3.1. MATERIAL Y MTODOS

a. Material Vegetal:

Hojas de Bixa orellana L., (Achiote)

Botones (Flores que an no se abren) secos de la planta Syzygium

aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry (Clavo de olor).

b. Microorganismos:

Candida albicans

Streptococcus pyogenes

Staphylococcus aureus

c. Medios de cultivo:

Agar Mller Hinton

. Agar Sabouraud.

Agar Sangre.

Caldo Cerebro Corazn.

Caldo Tioglicolato.

d. Control positivo.

Discos con Fluconazol 25 g.

Discos con Ciprofloxacino 5 g.

e. Control negativo.

Discos con etanol.

40
41
f. Materiales de campo.

Bolsas de plstico negro.

Costales de fibras de plstico, hilo pabilo.

Tijeras de podar.

g. Materiales de laboratorio.

Aro de soporte.

Agitadores de vidrio.

Discos de papel filtro.

Embudos.

Esptulas de metal.

Frascos esterilizados, gradillas.

Luna de reloj.

Mechero de alcohol. Pinzas de metal.

Pinzas para tubo de ensayo.

Placas Petri.

Pipetas volumtricas.

Platos de porcelana, probetas.

Propipetas.

Soporte universal.

Tubo de ensayo con tapa rosca.

Tubos de ensayo simples.

Vasos de precipitado.

Viales con tapa.

42
43
h. Equipos.

Autoclave marca GEMMY, modelo SA-232X.

Balanza analtica marca SERTORIUS BA 110S.

Cabina de seguridad biolgica marca LABCULTURE, ESCO clase II, tipo

A-II.

Cmara de secado marca BINDER fd53.

Horno microondas LG modelo SM-1948JL.

Incubadora marca OVEN BJPX mobile.

Incubadora marca HEATED INCUBATORS modelo BJPX tampa.

Micropipeta SCI LOGEX.

i. Reactivos.

Anhdrido actico.

Alcohol amlico.

cido clorhdrico al 1 %.

cido clorhdrico (Qumicamente puro).

Agua destilada.

cido sulfrico concentrado.

Ciprofloxacino 5 g.

Etanol.

Extractos etanlicos de Bixa orellana L., y Syzygium aromaticum (L.)

Merr. & L. M. Perry

Diclorometano.

Fluconazol 25 g.

44
Gelatina al 1%.

Limaduras de magnesio.

Reactivo de Dragendorff.

Reactivo de Mayer.

Reactivo de Wagner.

Tricloruro frrico al 5%.

j. Otros.

Agua destilada.

Botellas de vidrio estril.

Botellas de vidrio cortadas.

Caja de guantes.

Caja de mascarillas.

Caja de tocas.

Canicas.

Discos de papel filtro 6 mm de dimetro.

Equipos de venoclisis.

Frascos color mbar.

Frascos de toma de muestra estril.

Hisopos estriles.

Hilo pabilo.

Jeringas de diversos tamaos.

Jeringas de 20 mL.

Mandiles blancos.

45
Paos antipelusa.

Papel aluminio.

Papel kraft.

Paquete de algodn.

Plumn indeleble.

Regla de medir.

Suero Salino Fisiolgico.

Tijeras.

3.2. RECOLECCIN Y TRATAMIENTO DE LA MUESTRA.

3.2.1. Recoleccin del material vegetal.

La especie vegetal Bixa orellana L., (Achiote), fueron extradas en el Poblado de

San Benito, Distrito de Grocio Prado, Provincia de Chincha el 01 Febrero

del 2015. La altitud aproximada del lugar recoleccin es aproximadamente

90.00 m.s.n.m.

Para la recoleccin de la muestra se delimit un sector no mayor de 400 m 2

aproximadamente, el cual se dividi tomando en cuenta la distancia entre

rboles de Bixa orellana L., identificando sectores en los cuales haban

rboles con comportamientos productivos homogneos y representativos de

las reas a manejar, mediante observaciones visuales directas se evit

colectar en sectores no representativos dentro de las reas delimitadas como

uniformes. La recoleccin de hojas de Bixa orellana L., se hizo en horas de

la maana mediante cortes con tijeras de podar tratando de no daar las

hojas.

46
Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry (Clavo de olor) se compr en el

Mercado Toledo (Arenales) ciudad de Ica, teniendo en cuenta la calidad del

producto mediante valoracin cualitativa sobre la muestra (Anlisis

organolptico)

Figuras 4 y 5: Recoleccin de Bixa orellana L., y muestra de Syzygium

aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry

3.2.2. Tratamiento de la muestra:

47
a Preseleccin:

En Bixa orellana L., hecha la recoleccin se procedi a seleccionar la muestra

vegetal en buen estado y se coloc en bolsas de papel para evitar problemas de

descomposicin de dichas muestras vegetales. Luego se procedi al traslado a

la ciudad de Ica. En Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry luego de

comprarse en el mercado de la localidad, se procedi a colocarlos en bolsa de

papel para ser trasladas al lugar de seleccin.

b Limpieza:

Se limpi las hojas de Bixa orellana L., con paos hmedos antipeluza,

teniendo especial cuidado en seleccionar las mejores hojas y tratar de no

daarlas en el proceso de limpieza.

Las muestras de Bixa orellana L., y Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M.

Perry, se limpiaron de impurezas, tierra, suciedad, etc.

c. Secado: Se utilizaron 2 mtodos

c.1. Secado a la Sombra:

Se coloc sobre papel Kraft, en un lugar fresco y seco. Se realizaron

48
determinaciones de prdidas de peso cada 24 horas hasta obtener valores

constantes. El proceso dur 7 das.

c.2. Secado a la Estufa:

Se coloc en estufa a temperatura de 40 C y se realiz determinaciones de

peso cada 24 horas hasta obtener valores constantes. El material seco, se

almacen en cajas de papel, forradas internamente con papel aluminio, a

temperatura ambiente27. El proceso dur 4 das.

d. Seleccin:

Se seleccion hojas en buen estado de Bixa orellana L., y flores de Syzygium

aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry.

e. Conservacin:

Finalmente se tritur en un mortero hasta obtener un tamao adecuado y

conservado en frascos hermticamente cerrados forrados con papel Kraft.

Figuras 6 y 7: Seleccin de Bixa orellana L., y secado de

Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry

49
Figura 8: Tratamiento de la muestra vegetal Bixa orellana L., y Syzygium

aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry

50
51
3.3. OBTENCIN DEL EXTRACTO ETANLICO.

La obtencin de los extractos etanlicos tanto de Bixa orellana L., y Syzygium

aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry se realiz en el Laboratorio de

Anlisis Bioqumicos y Clnicos de la Universidad Nacional San Luis

Gonzaga de Ica.

3.3.1. Mtodo de Lixiviado o Percolacin.

a. Definicin:

Es el mtodo oficial de extraccin, descrito en la Farmacopea Americana

(USP). Es un mtodo que consiste en que el menstruo (Generalmente

alcohlico o mezcla hidroalcohlica) atraviesa la masa de droga pulverizada

siempre en un solo sentido, alcanzando concentraciones crecientes de tal modo

que el equilibrio entre el solvente dentro y fuera del marco nunca se alcanza,

por lo que la droga baada siempre por nuevas proporciones de menstruo acaba

por ceder todos sus componentes solubles de manera progresiva.

Este tipo de extraccin se realiza en recipientes (Percoladores) cilndricos o

cnicos que poseen dispositivos de carga y descarga, logrndose una extraccin

total de los principios activos.

Los extractos fluidos son extractos lquidos de materias vegetales, de tal

manera preparados, que la cantidad de extracto final en volumen es

Equivalente a la de la droga desecada al aire en peso, dicho en otras palabras,

la relacin peso de droga / volumen final de extracto es 1:1.

No es apropiado para resinas o materiales que se hinchen dado que el

disolvente no percolar. Se requiere agregar solvente constantemente.

52
Cabe recalcar que previo a la extraccin es necesario humectar la droga con el

disolvente, permitiendo su esponjamiento con el fin de facilitar la entrada del

menstruo en las membranas celulares durante la percolacin28, 29, 30, 31.

b. Tcnica: Se procedi de la siguiente manera:

b.1. Una vez secas y trituradas nuestras muestras, pesamos en tres partes:

50 g de Bixa orellana L., (Achiote)

50 g de Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry (Clavo de

Olor)

50 g de ambas (Bixa orellana L., + Syzygium aromaticum (L.) Merr. &

L. M. Perry)

Esta ltima es para comparar el efecto final (Bactericida y fungicida), con

las drogas por separado, y saber si potencia el efecto o no al combinarlas.

b.2. Se coloc estas tres pesadas en vasos precipitados por separado, se

humect cada uno con cantidad adecuada de etanol hasta formar una masa

pastosa.

Se dej humectar 2 horas. Se tap con papel aluminio para evitar la

evaporacin del lquido humectante.

b.3. Mientras tanto, se procedi a hacer el armado de nuestros percoladores.

53
Figura 9: Armado de los percoladores

54
b.4. Una vez terminado el armado de los tres percoladores y la humectacin

por dos horas de nuestra droga, se vaci la droga humectada en el

percolador luego de verter etanol, se dej macerar por 48 horas. Al igual que

el proceso previo, se cubri con papel aluminio para evitar la prdida de

metabolitos fotolbiles.

Figura 10: Droga humectada en los percoladores y vaciamiento de etanol

b.5. Luego de la maceracin, se abri la llave inferior, se dej que gotee el

extracto lquido en el vaso de precipitado a razn de 20 gotas por minuto,

restituyendo con menstruo (En este caso etanol) limpio el volumen de

salida, por la parte superior del percolador, hasta que el menstruo aclare.

b.6. Recibido el lixiviado en los vasos de precipitado, se procedi a la

filtracin para evitar obtener posibles partculas de droga que hayan pasado

el filtro de algodn.

b.7. Seguidamente, se llev el filtrado a la estufa a 39 C. (No ms de 40 C

para evitar perder metabolitos), hasta obtener extracto lquido, en relacin

con el peso de la droga 1:1 (50 g de droga debe dar como resultado 50 mL

de extracto lquido).

55
Figuras 11 y 12: Desecacin de extractos a no ms de 40 C y obtencin de

extracto lquido en relacin con el peso de droga. Proporcin

1:1.

b.8. Por ltimo, los extractos obtenidos se almacenaron en frascos color

mbar

c. Preparacin de diluciones de extractos vegetales

c.1. Preparacin de diluciones de los extractos vegetales.

En platos de porcelana se desecaron los extractos vegetales mediante

una cmara de secado marca BINDER fd53, a 39C, hasta obtener

una masa pastosa.

Figuras 13 y 14: Desecacin de extractos vegetales.

56
Luego, se coloc los extractos vegetales desecados en frascos

esterilizados con la ayuda de una esptula.

Los extractos vegetales utilizados en el proceso de desecacin fueron:

Extracto de Bixa orellana L.,

Extracto de Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry

Extracto de Bixa orellana L., + Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L.

M. Perry

Los extractos desecados y almacenados en frascos esterilizados

fueron pesados en una balanza analtica marca SERTORIUS BA

110S, obteniendo de cada extracto las cantidades a utilizar. Los

siguientes pesos a ser utilizados fueron:

Extracto de Bixa orellana L., : 2,3 g

Extracto de Syzygium aromaticum (L.)


: 2,3 g
Merr. & L. M. Perry.

Extracto de Bixa orellana L., + Syzygium


: 2,3 g.
aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry

Se diluy los extractos vegetales desecados en 5 ml de etanol.

Luego, con la ayuda de una varilla de vidrio, se mezcl hasta

homogenizar. Por ltimo, se rotul y se guard para su posterior

utilizacin.

Extracto de Bixa orellana L., : 2,3 g + 5mL (Etanol)


Extracto de Syzygium aromaticum (L.)
: 2,3 g + 5mL (Etanol)
Merr. & L. M. Perry.

57
Extracto de Bixa orellana L., + Syzygium
: 2,3 g + 5mL (Etanol)
aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry

Los extractos obtenidos (Diluidos en etanol y rotulados), pasaron a

ser las soluciones Madre. Quedando de la siguiente manera:

Extracto de Bixa orellana L., : 2,3 g/5mL (Etanol)


Extracto de Syzygium aromaticum (L.)
2,3 g/5mL (Etanol)
Merr. & L. M. Perry :

Extracto de Bixa orellana L., + Syzygium


2,3 g/5mL (Etanol)
aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry :

NOTA: Los extractos tienen que ser expresados en mg/mL, para

realizar el proceso de conversin a mg, se realiza una regla de tres

simple:

Extracto de Bixa orellana L., (Achiote): 2,3 g/5mL

2,3 g ----------------------------- 5 mL.

X . ----------------------------- 1 mL.
X= 1 mL x 2,3 g/5 mL

X= 0,46 g.

En 5 mL hay 2,3 g, entonces en 1 mL hay 0,46 g.

0,46 g/mL = 460 mg/mL (Solucin Madre" de

extracto de Bixa orellana L.,)

58
59
Extracto de Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M.

Perry (Clavo de olor): 2,3 g/5mL

2,3 g ----------------------------- 5 mL

X g ------------------------------ 1 mL
X= 1 mL x 2,3 g/5 mL

X= 0,46 g.

En 5 mL hay 2,3 g entonces en 1 mL hay 0,46 g

0,46 g/mL = 460 mg/mL [Solucin Madre

de extracto de Syzygium aromaticum (L.) Merr. &

L. M. Perry]

Extracto de Bixa orellana L., + Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry

(Achiote clavo de olor): 2,3 g/5mL

2,3 g ----------------------------- 5 mL

X g ---------------------------- 1 mL

X= 1 mL x 2,3 g/5 mL
X= 0,46 g

En 5 mL hay 2,3 g, entonces en 1 mL hay 0,46 g.

0,46 g/mL = 460 mg/mL (Solucin Madre de extracto

de Bixa orellana L., + Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L.

M. Perry).

60
Se necesit preparar 5 diluciones de la siguiente manera:

Primer vial: Con la ayuda de una pipeta esterilizada, se tom 1mL

del extracto madre, y se verti en un primer vial. Se agreg 1 mL de

etanol.

Segundo vial: Se tom del primer vial 1 mL del extracto diluido en

etanol, y se verti en el segundo vial. Se agreg 1 mL de etanol.

Tercer vial: Se tom del segundo vial 1 mL de extracto diluido en

etanol y se verti en el tercer vial. Se agreg 1 mL de etanol.

Cuarto vial: Se tom del tercer vial 1 mL de extracto diluido en

etanol y se verti en el cuarto vial. Se agreg 1 mL de etanol.

Quinto vial: Se tom del cuarto vial 1 mL de extracto diluido en

etanol y se verti en el quinto vial. Se agreg 1 mL de etanol.

El procedimiento se repite con los 3 extractos vegetales. Por lo

que se utiliz 15 diluciones.

Las cantidades en mg/mL de cada una de las diluciones fueron:

Bixa orellana L.,:

A1= 230 mg/mL

A2= 115 mg/mL

A3= 57,5 mg/mL

A4= 28,75 mg/mL

A5= 14,375 mg/mL

Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry:

B1= 230 mg/mL

B2= 115 mg/mL

61
B3= 57,5 mg/mL

B4= 28,75 mg/mL

B5= 14,375 mg/mL

Bixa orellana L., + Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M.

Perry

A+B 1= 230 mg/mL

A+B 2= 115 mg/mL

A+B 3= 57,5 mg/mL

A+B 4= 28,75 mg/mL

A+B 5= 14,375 mg/mL

3.4. IDENTIFICACIN DE METABOLITOS SECUNDARIOS.

3.4.1. Definicin:

Identificacin preliminar segn Migdalia Miranda: De acuerdo con este mtodo,

la muestra fue sometida a la accin extractiva de solventes de polaridad

creciente: ter, etanol y agua (En el presente trabajo de investigacin se

utiliz etanol como solvente) modificando el pH del medio con el fin de

obtener los metabolitos secundarios de acuerdo a su solubilidad. Luego se

realiz la identificacin de los metabolitos secundarios haciendo uso de

reactivos de coloracin y precipitacin42.

3.4.2. Tcnica.

Mediante una pipeta se retir 1 mL del extracto etanlico de cada muestra:

Extracto etanlico de Bixa orellana L.,

Extracto etanlico de Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry

62
Extracto etanlico de Bixa orellana L., + Syzygium aromaticum (L.) Merr.

& L. M. Perry

Luego, se coloc cada muestra en tubos de ensayo independientemente y ser

comparado con el patrn de referencia.

3.4.3. Procedimiento.

Se realiz de la siguiente manera:

a. Bixa orellana L., (Achiote)

a.1. Reaccin de flavonoides: Siendo el siguiente:

Se coloc con una pipeta 1 mL de extracto (Bixa orellana L.,) en un tubo

de ensayo.

Se aadi 0,5 mL de cido clorhdrico qumicamente puro y 4 limaduras

de magnesio + 1 mL de alcohol amlico.

El tiempo que se espera para la reaccin es de 10-15 minutos.

La reaccin ser positiva cuando se presente de color rosado, rojo o

anaranjado.

a.2. Reaccin de taninos: Siendo el siguiente:

Con una pipeta se coloc 1 mL de extracto (Bixa orellana L.,) en un tubo

de ensayo. Luego se aadi 1 mL de gelatina al 1%.

El tiempo de espera de reaccin es de 10-15 minutos.

Observar si presenta turbidez u opalescencia.

a.3. Reaccin de compuestos fenlicos: Siendo el siguiente:

63
Se coloc con una pipeta 1 mL de extracto (Bixa orellana L.,) en un tubo

de ensayo.

Luego se aadi 3 gotas de tricloruro frrico al 5%.


Observar coloracin azul o verde oscura.

a.4. Reaccin de triterpenos y esteroides:

Se coloc con una pipeta 1 mL de extracto (Bixa orellana L.,) a sequedad

mediante Bao Mara a 60C

Se redisolvi con 1 mL de diclorometano y se aadi 1 mL de anhdrido

actico

Se dej resbalar por las paredes del tubo cido sulfrico concentrado

(H2SO4)

Observar coloracin rosada-azul-verde.

a.5. Reaccin de alcaloides: Se realiz en 3 tubos de ensayo.

a.5.1. Tubo de ensayo 1: De la siguente manera:

Con la ayuda de una pipeta se coloc 1 mL de extracto (Bixa

orellana L.,) en un tubo de ensayo.

Luego se aadi 1mL de cido clorhdrico 1% + 3 gotas de reaccin

de Dragendorff.

Por ltimo observar la presencia de un precipitado anaranjado.

a.5.2. Tubo de ensayo 2: De la siguiente manera:

Se coloc con una pipeta 1 mL de extracto (Bixa orellana L.,) en un

tubo de ensayo.

Se aadi 1mL. de cido clorhdrico 1% + 3 gotas de reaccin de

Mayer.

Observar precipitado blanco.


64
a.5.3. Tubo de ensayo 3: De la siguiente manera:

Se coloc con una pipeta 1 mL de extracto (Bixa orellana L.,) en un

tubo de ensayo

Se aadi 1mL de cido clorhdrico 1% + 3 gotas de reaccin de

Wagner.

Observar precipitado marrn.

a.6. Reaccin de saponinas: De la siguiente manera:

Con la ayuda de una pipeta se coloc 1 mL de extracto (Bixa orellana

L.,) en un tubo de ensayo.

Seguidamente se aadi 2 mL de agua destilada.

Luego se agit vigorosamente por 1 minuto, y se dej en reposo 10

minutos.

La reaccin ser positiva si la espuma persiste.

b. Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry (Clavo de olor)

b.1. Reaccin de flavonoides: Se procedi de la siguiente manera.

Con la ayuda de una pipeta se coloc 1 mL de extracto (Syzygium

aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry) en un tubo de ensayo

Seguidamente se aadi 0,5 mL de cido clorhdrico qumicamente puro


y 4 limaduras de magnesio + 1 mL de alcohol amlico

El tiempo de espera de la reaccin es de 10-15 minutos.

Luego observamos si presenta un color rosado, rojo o anaranjado.

b.2. Reaccin de taninos: De la siguiente manera:

65
Se coloc con una pipeta 1 mL de extracto (Syzygium aromaticum (L.)

Merr. & L. M. Perry) en un tubo de ensayo.

Luego se aadi 1 mL de gelatina al 1%.

El tiempo de espera de la reaccin es de 10-15 minutos.

Por ltimo observamos si presenta turbidez u opalescencia, lo cual nos


indicar el resultado.

b.3. Reaccin de compuestos fenlicos: Se realiz de la siguiente manera.

Con la ayuda de una pipeta se coloc 1 mL de extracto [Syzygium

aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry] en un tubo de ensayo.

Se aadi 3 gotas de tricloruro frrico al 5%.

Luego observar si presenta la coloracin verde oscura.

b.4. Reaccin de triterpenos y esteroides: De la siguiente manera.

Se coloc con una pipeta 1 mL de extracto (Syzygium aromaticum (L.)

Merr. & L. M. Perry) a sequedad mediante bao Mara a 60 C.

Luego se redisolvi con 1 mL de diclorometano y se aadi 1 mL de

anhdrido actico.

Se dej resbalar por las paredes del tubo cido sulfrico concentrado

(H2SO4).

Observar coloracin rosada-azul-verde.

b.5. Reaccin de alcaloides: Se realizaron en 3 tubos de ensayo.

b.5.1. Tubo de ensayo 1:

Se coloc con una pipeta 1 mL de extracto (Syzygium aromaticum

(L.) Merr. & L. M. Perry) en un tubo deensayo.

66
Se aadi 1mL. de cido clorhdrico 1% + 3 gotas de reaccin de

Dragendorff.

Observar una precipitacin anaranjada.

b.5.2. Tubo de ensayo 2:

Se coloc con una pipeta 1 mL de extracto [Syzygium aromaticum

(L.) Merr. & L. M. Perry] en un tubo de ensayo.

Se aadi 1mL de cido clorhdrico 1% + 3 gotas de reaccin de

Mayer.

Se debe observar precipitado blanco.

b.5.3. Tubo de ensayo 3:

Se coloc con una pipeta 1 mL de extracto [Syzygium aromaticum

(L.) Merr. & L. M. Perry] en un tubo de ensayo.

Se aadi 1mL de cido clorhdrico 1% + 3 gotas de reaccin de

Wagner.

Observar precipitado marrn.

b.6. Reaccin de saponinas: Siendo el siguiente:

Se coloc con una pipeta 1 mL de extracto [Syzygium aromaticum (L.)

Merr. & L. M. Perry] en un tubo de ensayo.

Se aadi 2 mL de agua destilada. Se agit vigorosamente por 1 minuto.

Dejar en reposo 10 minutos; si persiste la espuma la reaccin es positiva.

c. Bixa orellana L., + Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry

(Achiote + clavo de olor)

c.1. Reaccin de flavonoides: De la siguiente manera.

67
Se coloc con una pipeta 1 mL de extracto (Bixa orellana L., + Syzygium

aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry) en un tubo de ensayo.

Se aadi 0,5 mL de cido clorhdrico qumicamente puro y 4 limaduras

de magnesio + 1 mL de alcohol amlico.

El tiempo de espera de reaccin es de 10-15 minutos.

Si la reaccin es positiva da un color rosado, rojo o anaranjado.

c.2. Reaccin de taninos: De la siguiente manera.

Se coloc con una pipeta 1 mL de extracto (Bixa orellana L., + Syzygium

aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry) en un tubo de ensayo.

Se aadi 1 mL de gelatina al 1%.

El tiempo de espera de reaccin es de 10-15 minutos

Observar si presenta turbidez u opalescencia.

c.3. Reaccin de compuestos fenlicos: De la siguiente manera.

Con la ayuda de una pipeta se coloc 1 mL de extracto (Bixa orellana L.,

+ Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry) en un tubo de ensayo.

Seguidamente se aadi 3 gotas de tricloruro frrico al 5%.

Luego observaremos una coloracin azul o verde oscura, el cual

nos indicar el resultado.

c.4. Reaccin de triterpenos y esteroides: De la siguente manera.

Se coloc con una pipeta 1 mL de extracto [Bixa orellana L., + Syzygium

aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry] a sequedad mediante Bao Mara a

60 C

68
Se redisolvi con 1 mL de diclorometano y se aadi 1 mL de anhdrido

actico. Luego se dej resbalar por las paredes del tubo cido sulfrico

concentrado (H2SO4).

Observar coloracin rosada-azul-verde.

c.5. Reaccin de alcaloides: Se realiz en 3 tubos de ensayo.

c.5.1. Tubo de ensayo 1:

Con la ayuda de una pipeta se coloc 1 mL de extracto [Bixa

orellana L., + Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry] en un

tubo de ensayo.

Luego se aadi 1mL de cido clorhdrico 1% + 3 gotas de reaccin

de Dragendorff.

Observar precipitacin anaranjada.

c.5.2. Tubo de ensayo 2:

Se coloc con una pipeta 1 mL de extracto [Bixa orellana L., +

Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry] en un tubo de

ensayo.

Se aadi 1mL de cido clorhdrico 1% + 3 gotas de reaccin de

Mayer.

Luego se observa precipitado blanco.

c.5.3. Tubo de ensayo 3:

Se coloc con una pipeta 1 mL de extracto [Bixa orellana L., +

Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry] en un tubo de

ensayo.

69
Se aadi aadirle 1mL de cido clorhdrico 1% + 3 gotas de

reaccin de Wagner.

Observar precipitado marrn.

c.6. Reaccin de saponinas:

Con la ayuda de una pipeta se coloc 1 mL de extracto [Bixa orellana L.,

+ Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry] en un tubo de ensayo.

Se aadi 2 mL de agua destilada, luego se agit vigorosamente por 1

minuto, dejar en reposo 10 minutos.

Si persiste la espuma la reaccin es positiva19.

3.5. ESTUDIO MICROBIOLGICO.

Fue realizado en el Laboratorio de Anlisis Bioqumicos y Clnicos de la

Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica. Para el estudio, las bacterias

fueron proporcionadas por el Laboratorio del Hospital Augusto Hernndez

Mendoza de la Ciudad de Ica. Se hicieron las siguientes pruebas:

a. Confirmacin de los microorganismos

Se certificaron los microorganismos por el Bilogo-Microbilogo Juan J.

Guillermo Albitres. Estas muestras corresponden a tres especies, de las cuales

se tiene la constancia respectiva de fecha veintids das del mes de febrero del

dos mil diecisis. Las tres especies de microorganismos son:

Staphylococcus aureus

Streptococcus pyogenes

Candida albicans

b. Medios de identificacin selectivos y diferenciales.

70
b.1. Agar Mller Hinton: El Agar Mller Hinton es un medio utilizado para

realizar las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en microorganismos

aerbicos por el mtodo de Kirby-Bauer. Este medio tambin es conocido

como Agar M-H.Bauer; Kirby, Sherris y Tuck recomendaron el agar de

Mller Hinton para llevar a cabo las pruebas de susceptibilidad a

antibiticos. El agar Mller Hinton cumple con los requerimientos de la

Organizacin Mundial de la Salud (OMS). Este medio es el seleccionado

para realizar las pruebas de susceptibilidad, por su alta reproducibilidad, su

bajo contenido de substancias inhibidoras y el crecimiento satisfactorio que

presentan la mayora de los patgenos no fastidiosos. Con este medio se han

llevado a cabo una gran cantidad de estudios sobre susceptibilidad

antimicrobiana32, 33.

b.2. Agar Sangre: Medio muy rico que permite el crecimiento de todos los

microorganismos con importancia clnica excepto el de los ms exigentes se

utiliza para el crecimiento de estreptococos. Utiliza tambin para ver la

capacidad hemoltica de los microorganismos patgenos, por lo que se

considera un medio diferencial. Para la preparacin del agar sangre se puede

utilizar el agar nutritivo enriquecido con cloruro sdico o un preparado

enriquecido con otras sustancias como el tripticase de soja. La adicin de

sangre a un medio de cultivo no proporciona las sustancias que estn en el

interior de los hemates, pero s puede aadir factores inhibidores del

crecimiento bacteriano presentes en el suero. Este es un inconveniente que

puede solucionarse calentando la sangre para romper los eritrocitos y para

que se destruyan las sustancias inhibidoras, que son termolbiles. La sangre

utilizada como aditivo a estos medios suele ser sangre de carnero diluida al
71
5%, pero en algunas ocasiones es necesario utilizar sangre de otras especies

(caballo, conejo, humana), pues facilitan las reacciones hemolticas o

contienen determinados factores de enriquecimiento o no poseen sustancias

inhibidoras del crecimiento de determinados grmenes32, 33.

b.3. Agar Sabouraud: Este medio fue desarrollado para el cultivo de hongos

patgenos, especialmente de los productores de micosis superficiales. En la

actualidad se recomienda slo para el aislamiento primario de dermatfitos,

tiende a eliminar el crecimiento bacteriano33, 34.

b.4. Caldo Tioglicolato: Es el caldo ms comnmente usado en Microbiologa

Clnica. Favorece el crecimiento de anaerobios, El cido tiogliclico

tambin acta como agente reductor disminuyendo an ms el potencial de

xido-reduccin del medio.

Con el agregado de muchos nutrientes como casena, extractos de levadura y

de carne, vitaminas y otros, el medio permite el crecimiento de la mayora

de las bacterias patgenas33.

b.5. Caldo Cerebro Corazn: La infusin de corazn y cerebro es un medio

de cultivo clsico muy utilizado en Microbiologa Clnica para el cultivo de

organismos patgenos ya que mantiene muy bien las caractersticas de

antigenicidad, virulencia y toxicidad, y adems est perfectamente adaptado

para la adicin de sangre.

Sobre este medio se obtienen excelentes resultados en el cultivo de

estreptococos, meningococos e incluso hongos patgenos34.

3.5.1. Evaluacin de la actividad bactericida y fungicida

72
a.1. Preparacin de los medios de cultivo.

Cada uno de los agares o medios nutritivos se pesaron en una balanza

analtica marca SERTORIUS BA 110S en papel previamente preparado

para el pesaje.

Luego se verti en un frasco estril y se disolvi en agua destilada la

cantidad suficiente de agar nutritivo con una varilla de vidrio, y fueron

colocados al horno microondas hasta que hierva. Se dej enfriar

Los agares preparados almacenados en frascos estriles fueron cerrados

hermticamente. Se autoclav en mquina autoclave marca GEMMY,

modelo SA-232X. Para evitar posible contaminacin. Luego se dej

reposar 10 a 15 minutos hasta enfriar.

Se almacen para su posterior utilizacin.

a.2. Esterilizacin de materiales:

Todos los materiales de vidrio y dems se envolvi en papel Kraft y

fueron llevados a la esterilizadora marca BINDER fd53 a 180 C durante

120 minutos.

Concluido el proceso los materiales estaban listos para su utilizacin.

Los materiales esterilizados fueron:

Discos de papel filtro para ser impregnadas con las diluciones de

extractos vegetales.

Hisopos.

Pinzas.

Placas petri.

Propipetas.

73
Tubos de ensayo.

a.3. Preparacin de los discos impregnados con diluciones a diferentes

concentraciones de extractos vegetales y discos impregnados con

control negativo (Etanol).

En una cabina de seguridad biolgica marca LABCULTURE, ESCO

clase II tipo A-II, con un mechero y una pinza estril, se tomaron los

discos estriles de 6 mm de dimetro.

Los discos se impregnaron con 10 L (Microlitros) de extracto con ayuda

de una Micropipeta SCI LOGEX graduada. Las diluciones de cada

extracto vegetal que fueron impregnados en los discos estriles fueron:

Bixa orellana L.,: 230 mg/mL; 115 mg/mL; 57,5 mg/mL; 28,75

mg/ml; 14,375 mg/mL.

Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry: 230 mg/mL; 115

mg/mL; 57,5 mg/mL; 28,75 mg/mL; 14,375 mg/mL.

Bixa orellana L., + Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry:

230 mg/mL; 115 mg/mL; 57,5 mg/mL; 28,75 mg/mL; 14,375

mg/mL.

Se impregn 10 L de etanol en discos esterilizados mediante

micropipeta (control negativo)

Discos de Fluconazol 25 g (Control positivo).

Discos de Ciprofloxacino 5 g (Control positivo).

74
Finalmente para detallar este proceso, se tom con una pinza estril cada

disco. Luego, con una micropipeta graduada se vierte 10 L de cada dilucin de

extracto y control negativo. Se esper para que difunda en la totalidad del disco

dejando secar por unos minutos. Se guard en una placa estril.

a.4. Preparacin de las placas con medios de cultivo:

Los agares o medios de cultivo preparados en estado semislido por estar

almacenados, se colocaron en hornomicroondas por un tiempo suficiente

para disolver. Luego se verti aproximadamente 15-20 mL de medio

nutritivo en cada placa Petri.

Se prepararon 3 tipos de agares:

Agar Sabouraud para Candida albicans

Agar Mller Hinton para Staphylococcus aureus

Agar Sangre para Streptococcus pyogenes

a.5. Preparacin de los caldos nutritivos:

Se pes caldo nutritivo en una balanza analtica marca SERTORIUS BA

110S, en papel previamente preparado.

Luego se disolvieron en agua destilada la cantidad suficiente de caldo

nutritivo, con una varilla de vidrio, en vasos de precipitado. Se vertieron

en un envase estril.

Los caldos nutritivos preparados son autoclavados en Autoclave marca

GEMMY, modelo SA 232X, para evitar posible contaminacin. Son


75
envasados hermticamente, luego se dejan reposar 10 a 15 minutos hasta

enfriar.

Se almacenaron bien cerrados para su posterior utilizacin. Se prepararon

2 tipos de caldo nutritivo:

Caldo Cerebro Corazn para Sthaphylococcus aureus

Caldo Tioglicolato para Streptococcus pyogenes

a.6. Replicacin de las bacterias:

Se tomaron con asa bacteriolgica una asada de la cepa bacteriana, luego

se colocaron en caldo nutritivo contenido en un tubo de ensayo y se

cerr. Se dej incubar durante 24 horas a 37C en Incubadora marca

OVEN BJPX mobile.

Luego de haber transcurrido el tiempo, se sembr en la placa Petri

esterilizada conteniendo el respectivo agar nutritivo para cada bacteria y

el hongo, se incub a 37 C durante 24 horas en incubadora marca

OVEN BJPX mobile.

Figura 15: Flujograma, replicacin de microorganismos.

a.7. Preparacin del inculo bacteriano

En tubos de ensayo esterilizados conteniendo 5 mL de solucin salina

fisiolgica NaCl 0,85%, mediante un asa bacteriolgica se colocaron tres

76
a cinco colonias de rplicas bacterianas y el hongo, previamente

preparadas en el proceso

Se ajust al patrn de turbidez 0,5 Mac Farland.

b. Siembra de bacterias y hongo e inculos bacterianos en placas

petri con medio nutritivo.

Se realiz utilizando el mtodo de difusin en disco.

b.1. Siembra de bacterias.

Se tomaron los inculos con bacterias y mediante un hisopo esterilizado (1

hisopo por cada siembra), se sumergi en la suspensin del inculo; se

sembr por estra y agotamiento en cada una de las placas con agar nutritivo

para cada respectiva bacteria y hongo. La siembra de cada bacteria se hizo

por triplicado y se rotularon las placas con plumn indeleble para ser

identificados y evitar posibles confusiones.

b.2. Colocacin de discos impregnados con las diferentes

concentraciones de extracto vegetal, discos impregnados con etanol

como control negativo y discos de control positivo en los medios

nutritivos.

Con ayuda de una pinza estril, se colocaron los discos previamente

esterilizados de 6 mm. de dimetro (5 discos con diferentes

concentraciones + disco como control positivo + disco como control

negativo). Los 5 primeros discos fueron impregnados con 10 L de

extracto a diferentes concentraciones y el disco para control negativo fue

impregnado con 10 L etanol. Se utiliz micropipeta marca SCI LOGEX

y puntas de micropipetas esterilizadas.


77
Como control positivo usaremos: Ciprofloxacino 5 g para las bacterias

Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes, fluconazol de 25 g

para Candida albicans y como control negativo etanol 10 L.

Figura 16: Controles positivos y control negativo.

Se presionaron suavemente sobre cada disco para asegurar un contacto


completo con la superficie de agar. Transcurridos 15 minutos, se

incubaron las placas en posicin invertida a 37C durante 24 h.

Para facilitar la rotulacin de las placas, se asign letras equivalentes a

cada una de los extractos vegetales diluidos:

A= Bixa orellana L.,

B= Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry

A+B=Bixa orellana L., + Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M.

Perry

Luego se incub durante 24 horas a 37C las placas con medio nutritivo,

previamente rotulados con plumn indeleble, en discos a diferentes


78
concentraciones de diluciones de cada uno de los extractos vegetales, y

con bacterias y hongo.

c. Determinacin de la Concentracin Inhibitoria Mnima (CIM).

Es la medida de sensibilidad de una bacteria a un antibitico. Es la mnima

cantidad de antimicrobiano que es capaz de impedir el crecimiento de un

microorganismo en unas condiciones normalizadas.

En este mtodo la sensibilidad es medida por la inhibicin del crecimiento de

las bacterias en una serie de tubos con medio de cultivo lquido y

concentraciones del extracto9.

c.1. Determinacin de la Concentracin Inhibitoria Mnima (CIM

1 Se coloc en una gradilla 10 tubos estriles, rotulados del 1 al 10.

2 Colocamos la cepa cultivada en solucin salina y comparamos con la

escala de patrn de turbidez Mac Farland 0,5.

3 Colocamos con una pipeta 0,5 mL de caldo Cerebro corazn en los

tubos rotulados de N 2 al N 10.

4 Se agreg 0,5 mL de extracto vegetal a diferente concentraciones a los

tubos 1 y 2 mediante una pipeta. Se mezcl el contenido del tubo N 2 y

se trasvas 0,5 mL al tubo N 3, continuando hasta el tubo N 9. Se retir

0,5 mL del tubo N 9; el tubo N 10 no recibe el extracto y sirve como

control.

5 Agregamos a todos los tubos 0,5 mL mediante una pipeta el inculo de

la cepa bacteriana.

6 Se tap todos los tubos enumerados y se coloc en gradilla. Se

incubaron a 37C durante 24 horas.

79
d. Determinacin de la Concentracin Bactericida Mnima (CBM).

La Concentracin mnima bactericida se define como la como la concentracin

mnima del antimicrobiano que da un subcultivo estril, poniendo los cultivos

en caldos empleados por la CIM en medios slidos14.

d.1. Determinacin de la Concentracin Mnima Bactericida (CMB).

Se prepar 3 placas petri con medio de cultivo, Agar Mller Hinton.

Se dividieron las 3 placas (1 placa para A+B, 1 placa para A y otra para

B) en 10 partes iguales y se enumeraron del 1 al 10.

Mediante un asa bacteriolgica, se cogi del tubo N 1 del CIM y se

sembr en la divisin N 1 de la placa.

Se repiti el procedimiento hasta la divisin N 10 de la placa Petri.

La siembra fue hecha por el mtodo de estra.

80
Figura 17: Flujograma de Concentracin Inhibitoria Mnima (CIM) y

Concentracin Bactericida Mnima (CBM)14.

81
CAPTULO IV

RESULTADOS y DISCUSIN

4.1. RESULTADOS

Identificacin de metabolitos secundarios

Resultado: Positivo + Patrn

Figura 18: Reaccin de flavonoides en Bixa orellana L.,

Resultado: Positivo + Patrn

Figura 19: Reaccin de taninos en Bixa orellana L.,

82
Resultado: Positivo + Patrn

Figuras 20 y 21: Reaccin de compuestos fenlicos en Bixa orellana L.,

Bao Mara Resultado: Positivo + Patrn

Figuras 22, 23,24: Reaccin de triterpenos y esteroides en Bixa orellana L.,

Resultados:

Wagner: Positivo +++

Mayer: Positivo +

83
Dragendorff: Positivo ++

Figura 25: Reaccin de alcaloides en Bixa orellana L.,

84
Resultado: Negativo Patrn

Figuras 26 y 27: Reaccin de saponinas en Bixa Orellana L.,

Patrn Resultado: Positivo +

Figura 28: Reaccin de flavonoides en Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L.

M. Perry.

Patrn Resultado: Positivo +

Figuras 29 y 30: Reaccin de taninos en Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L.

M. Perry

85
Patrn Resultado: Positivo +

Figuras 31 y 32: Reaccin de compuestos fenolicos en Syzygium aromaticum

(L.) Merr. & L. M. Perry

Bao Mara Resultado: Positivo + Triterpeno Patrn

Figuras 33, 34 y 35: Reaccin de triterpenos y esteroides en Syzygium

aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry.

Resultados:

Wagner : Negativo :

Mayer : Positivo ++

Dragendorff : Positivo +++

Figura 36: Reaccin de alcaloides en Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M.

Perry.

86
Resultado: Positivo ++ Patrn

Figuras 37 y 38: Reaccin de alcaloides en Syzygium aromaticum (L.) Merr. &

L. M. Perry.

Resultado: Positivo ++ Patrn

Figuras 39 y 40: Reaccin de flavonoides en Bixa orellana L., + Syzygium

aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry.

Resultado: Positivo ++ Patrn

Figuras 41 y 42: Reaccin de taninos en Bixa orellana L., + Syzygium

aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry


87
Patrn Resultado: Positivo +++

Figuras 43 y 44: Reaccin de compuestos fenlicos en Bixa orellana L., +

Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry.

Resultado: Positivo +++ Patrn

Figuras 45, 46, 47, 48 y 49: Reaccin de triterpenos y esteroides en Bixa orellana

L., + Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry

88
Resultado: Positivo ++ Patrn

Figuras 50 y 51: Reaccin de alcaloides en Bixa orellana L., + Syzygium

aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry

Resultado: positivo ++ Patrn

Figuras 52 y 53: Reaccin de alcaloides en Bixa orellana L., + Syzygium

aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry

89
Resultado: positivo ++ Patrn

Figuras 54 y 55: Reaccin de alcaloides en Bixa orellana L., + Syzygium

aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry.

Resultado: Positivo + Patrn

Figuras 56 y 57: Reaccin de saponinas en Bixa orellana L., + Syzygium

aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry.

90
Tabla A:

Resumen de resultados, identificacin de Metabolitos Secundarios

Bixa orellana L.,


Syzygium
+ Syzygium
Bixa orellana aromaticum (L.)
aromaticum (L.)
L., Merr. & L. M.
Merr. & L. M.
Perry
Perry
1.- Reaccin de
Positivo + Positivo + Positivo ++
Flavonoides

2.- Reaccin de Taninos Positivo + Positivo + Positivo ++

3.- Reaccin de
Positivo + Positivo + Positivo +++
Compuestos Fenlicos

4.-Reaccin de
Positivo + Positivo + Positivo +++
triterpenos y esteroides

5.- Reaccin de Alcaloides

5.1.- Dragendorff Positivo ++ Positivo +++ Positivo ++

5.2.- Mayer Positivo + Positivo ++ Positivo ++

5.3.- Wagner Positivo +++ Negativo Positivo ++


6.- Reaccin de
Negativo Positivo ++ Positivo +
Saponinas

HALOS DE INHIBICIN

91
Tabla B: Actividad antibacteriana en extracto etanlico Streptococcus
pyogenes

mg/mL
CP CN
230 115 57,5 28,75 14,375 Ci (Etanol)
5 g 10 g
Cepa
Bacteriana
Streptococcus
Pyogenes

A+B (a) 7 mm - - - - 31 mm -

A+B (b) 7 mm - - - - 29 mm -

A+B (c) 7 mm - - - - 28 mm -

B (a) 7 mm - - - - 29 mm -

B (b) 7 mm - - - - 28 mm -

B (c) 7 mm - - - - 31 mm -

A (a) - - - - - 29 mm -

A (b) - - - - - 30 mm -

A (c) - - - - - 31 mm -

A+B: Bixa orellana L., + Syzygium Ci: Ciprofloxacino.

Aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry. a,b,c: Repeticiones

A: Bixa orellana L.,

B: Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry.

CP: Control positivo.

CN: Control negativo.

92
.

Streptococcus pyogenes

93
31 31 31
29 29 29 30
28 28

35

30

25

20
0 0 0 0 0 0 0 0 0
Etanol 10 g
15
0 0 0 0 0 0 0 0 0 Ciprofloxacino 5 g
14,375 mg/mL
10 7 7 7 7 7 7
0 0 0 0 0 0 0 0 0 28,75 mg/mL
0 0 0 0 0 0 0 0 0 57,5 mg/mL
5
0 0 0 115 mg/mL
230 mg/mL
0
A+B (a) A+B (b) A+B (c) B (a) mm B (b) mm B (c) mm A (a) mm A (b) mm A (c) mm
mm mm Mm
230 mg/mL 115 mg/mL 57,5 mg/mL 28,75 mg/mL 14,375 mg/mL Ciprofloxacino 5 g Etanol 10 g

94
Figura 58: Dimetro de halos de inhibicin de extracto etanlico VS. Microorganismo.

95
Tabla C: Actividad antibacteriana en extracto etanlico Staphylococcus aureus

mg./mL
CP CN
230 115 57,5 28,75 14,375 Ci (Etanol)
5 g 10 g
Cepa
Bacteriana
Staphylococcus
Aureus

A+B (a) 18 mm 8.5 mm - - - 34 mm -

A+B (b) 15 mm 10 mm - - - 35 mm -

A+B (c) 18 mm 9 mm - - - 33 mm -

B (a) 16 mm 8 mm - - - 33 mm -

B (b) 14 mm 7 mm - - - 31 mm -

B (c) 17 mm 7 mm - - - 33 mm -

A (a) 7.5 mm 6.5 mm - - - 37 mm -

A (b) 7 mm 6.5 mm - - - 36 mm -

A (c) 7 mm 6.5 mm - - - 37 mm -
.

A+B: Bixa orellana L., + Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry

A: Bixa orellana L.,

B: Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry

CP: Control positivo.

CN: Control negativo.

Ci: Ciprofloxacino.

a,b,c: Repeticiones

96
Staphylococcus aureus

97
37 36 37
35
34 33 33 33
31

40

35

30

25

98
18 18 17
20 15 16
10 14 Etanol 10 g
15 8.5 9 8 7 7 6.5 6.5 6.5 Ciprofloxacino 5 g
10 7.5 7 7 14,375mg/mL
28,75 mg/mL
5 115 mg/mL
230 mg/mL
0
A+B (a) A+B (b) A+B (c) B (a) mm B (b) mm B (c) mm A (a) mm A (b) mm A (c) mm
mm Mm Mm

99
230 mg/mL 115 mg/mL 28,75 mg/mL 14,375mg/mL Ciprofloxacino 5 g Etanol 10 g

Figura 59: Dimetro de halos de inhibicin de extracto etanlico VS microorganismo

100
Tabla D: Actividad antifngica en extracto etanlico Candida albicans

mg/mL
CP CN
230 115 57,5 28,75 14,374 Fl (Etanol)
25 g 10 g
Hongo

Candida
Albicans
A+B (a) - - - - - - -

A+B (b) - - - - - - -

A+B (c) - - - - - - -

B (a) - - - - - - -

B (b) - - - - - - -

B (c) - - - - - - -

A (a) - - - - - - -

A (b) - - - - - - -

A (c) - - - - - - -

A+B: Bixa orellana L., + Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry

A: Bixa orellana L.,

B: Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry.

CP: Control positivo.

CN: Control negativo.

Fl: Fluconazol.

a,b,c: Repeticiones.

101
Candida albicans

Etanol 10 g
Ciprofloxacino 5 g
14.375 mg/mL
28,75 mg/mL
57,5 mg/Ml
115 mg/mL
230 mg/mL
A+B (a) A+B (b) A+B (c) B (a) mm B (b) mm B (c) mm A (a) mm A (b) mm A (c) mm
mm mm Mm

230 mg/mL 115 mg/Ml 57,5 mg/mL 28,75 mg/mL 14,375 mg/mL Ciprofloxacino 5 g Etanol 10 g

Figura 60: Dimetro de halos de inhibicin de extracto etanlico vs microorganismo. (No existen halos de inhibicin)

102
Tabla E:

Valores de la Concentracin Inhibitoria Mnima (CIM) y la Concentracin

Bactericida Mnima (CBM) de extracto etanlico a partir de 230 mg/mL.

Microorganismos Streptococcus Staphylococcus aureus Candida


pyogene
s albicans
Extractos A B A+B A B A+B A B A+B

Resultados

CIM - - - 14,4 mg/mL 3,6 mg/mL 3,6 mg/mL - - -

CBM - - - 57,5 mg/mL 7,2 mg/mL 7.2mg/mL - - -

57.5
60

50

40

30

20 14,4 7,2 7,2


10 0 0 0 3,6 3,6 0 0 0
0 0 0 0 0 0
0
A B A+B A B A+B A B A+B

Streptococcus pyogenes Staphylococcus aureus Candida albicans

CIM CBM

Figura 61: Concentracin Inhibitoria Mnima (CIM) y Concentracin

Bactericida Mnima (CBM) en el extracto etanlico.

103
Tabla F: Valores del porcentaje de inhibicin relativa (PIR) frente al extracto

a concentracin 230 mg/mL

PIR (%) Staphylococcus Streptococcus Candida


Extracto aureus Pyogenes Albicans
230 mg/Ml
A+B 50 23,86 0
B 48,44 23,86 0
A 19,55 0 0

PIR

48,44%
50%
50%
45%
40%
35% 19,55% 23,86%
30%
23,86%
25%
20%
0 0
15%
A
10% 0
B
5% 0
A+B
0%
Staphylococcus Streptococcus Candida albicans
aureus Pyogenes

A+B B A

Figura 62: Porcentaje de inhibicin relativa (PIR) de los extractos.

104
Streptococcus pyogenes: Se observ halos de inhibicin muy pequeos, pero

resultaron insignificantes. No se realizaron Concentracin Inhibitoria Mnima

(CIM) y Concentracin Bactericida Mnima (CBM). (Ver tabla B).

Staphylococcus aureus: Se observaron halos de inhibicin. Se realizaron

Concentracin Inhibitoria Mnima (CIM) y Concentracin Bactericida Mnima

(CBM). (Ver tabla C).

Candida albicans: No se observaron halos de inhibicin. No se realizaron

Concentracin Mnima Inhibitoria (CIM) y Concentracin Bactericida Mnima

(CBM). (Ver tabla D).

Resultados CIM (Concentracin Inhibitoria Mnima)

A: Se observaron que en tubo N 5 hay mayor claridad o no turbidez. El tubo

N 5 es la CIM.

B: Se observaron que en tubo N 7 hay mayor claridad o no turbidez. El tubo

N 7 es la CIM.

A+B: Se observaron que en tubo N 7 hay mayor claridad o no turbidez. El tubo

N 7 es la CIM. (Ver figura 63)

Resultados CBM (Concentracin Bactericida Mnima)

A: Se observaron que en la zona 3 no hubo crecimiento bacteriano. La zona

3 es la CMB

B: Se observaron que en la zona 6 no hubo crecimiento bacteriano. La zona

N 6 es la CMB.

A+B: Se observaron que en la zona 6 no hubo crecimiento bacteriano. La zona

6 es la CMB (Ver figura 71)

105
4.2. DISCUSIN

En la presente investigacin se trabajaron con 3 tipos de extractos:

A : Extracto de Bixa orellana L.,

B : Extracto de Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry

A+B: Extracto de Bixa orellana L., + Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M.

Perry.

Esta ltima fue para probar la accin sinrgica en la combinacin de ambos

extractos.

Los mtodos utilizados fueron simples, rpidos y de bajo costo. En la

identificacin de Metabolitos Secundarios se identificaron metabolitos bioactivos

como los Taninos, Compuestos Fenlicos, Triterpenos y Esteroides, Alcaloides y

Saponinas (Slo en B y en A+B), adems de Flavonoides. Cabe resaltar que

se encontraron mayor cantidad de metabolitos bioactivos en la combinacin de

ambos extractos (A+B), posiblemente por la suma Cuantitativa de metabolitos

bioactivos de los extractos A y B. (Ver tabla A).

Entre los metabolitos bioactivos identificados destacan los Flavonoides

responsables de acciones antimicrobianas, antiinflamatorias y antioxidantes pero

el hecho de evidenciarse accin antioxidante, antiinflamatoria y especialmente

antimicrobiana (Objeto de estudio) da lugar a procesos de aislamiento y

sometimiento a pruebas ms especficas de este compuesto35.

Los Flavonoides tienen estructura fenlica, constituyentes relacionados

directamente con la toxicidad en microorganismos, cuyo mecanismo puede estar

relacionado con la inhibicin enzimtica por los compuestos oxidados,

106
posiblemente debido a reacciones del grupo sulfhidrilo o por interacciones con

protenas36.

La comprobacin de la accin antimicrobiana se deduce por la presencia de

fenoles y flavonoides que actan en forma sinrgica en las sntesis enzimticas a

nivel nuclear y ribosomal, que produjeron cambios en la estructura de la

membrana de los microorganismos3.

Lo cual coincide en trminos generales con los resultados obtenidos siendo:

Staphylococcus aureus es el microorganismo ms afectado a concentraciones

de 230 mg/mL principalmente con A+B [Bixa orellana L., + Syzygium

aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry]; en menor medida con B y halos

muy pequeos con A. Lo mismo ocurri a concentraciones de 115 mg/ml

donde hay mayor halo de inhibicin con A+B, halos ms pequeos con B

y halos muy pequeos con A; donde el control positivo (Ciprofloxacino)

dieron como resultado los mayores dimetros de halos de inhibicin. No se

observaron halos de inhibicin a concentraciones menores.

En el caso de Streptococcus pyogenes se observaron halos de inhibicin muy

pequeos a concentraciones de 230 mg/mL en caso de A+B, lo mismo

ocurri en B e inexistencia de halos de inhibicin en A; a

concentraciones menores no se observaron halos de inhibicin; siendo

tambin el control positivo el que dieron como resultado mayores dimetros

de halos de inhibicin.

En Candida albicans no se observaron halos de inhibicin tanto en las

concentraciones decrecientes de diluciones de extractos; as como tambin, en

107
el control positivo en este caso Fluconazol. Se trataron de Candida albicans

resistente.

Las bacterias (Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes) son de tipo Gram

positivas, as como candida albicans. Estn presentes en la flora intrahospitalaria

y si no se tiene los cuidados adecuados son causantes de enfermedades de riesgo

vital. Por eso la eleccin de dichos microorganismos para el presente estudio.

Para determinar a nivel general la interaccin de los extractos vegetales (A, B

y A+B) y los microorganismos (Streptococcus pyogenes, Staphylococcus

aureus y Candida albicans) para dar como resultado halos de inhibicin, se utiliz

el paquete estadstico IBM SPSS 22; se analizaron los datos en conjunto por

ANOVA (Anlisis de Varianza), y por los tests de Tukey y Dunnett. El diseo

estadstico empleado fue de bloques con 4 factores (Extractos a diferentes

concentraciones, control positivo, control negativo y los microorganismos). Al

realizar ANOVA o anlisis de varianza se aplic prueba de comparacin de medias

de Tukey a un alfa=0.05; al comparar con el 0.05 (Si es menor que dicho valor hay

diferencia significativa y si es mayor no hay diferencia significativa).

La tabla 1 y grfico 1 se observa que existen diferentes valores del dimetro del

halo de inhibicin segn los tratamientos y microorganismos. En la prueba de

ANOVA (tabla 1 del anexo) se hall significancia estadstica, para el caso de los

tratamientos (tabla 2 del anexo), el que mayor dimetro gener es el control

positivo. Mientras que para microorganismos (tabla 3 del anexo) se observa que el

mayor afectado es Staphylococcus aureus con una media de 7,8, seguido de

Streptococcus pyogenes con 4,8, mientras que Candida no sufri ningn efecto.

108
En el grfico 2 y tabla 2, se observa que existen diferentes valores del halo de

inhibicin generado en tres microorganismos por la accin de cinco

concentraciones del extracto de Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry,

adems de un control negativo y un control positivo.

En la grfico 3 se observa los promedios del halo de inhibicin generados por

cinco extractos de Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry sobre tres

microorganismos (Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus y Candida

albicans), al realizar el ANOVA (tabla 4 del anexo), se observa que existe

diferencia significativa, por lo que al observar la tabla 5 del anexo se muestra que

Staphylococcus aureus es el que ms halo de inhibicin mostr con un promedio

de 7,905, seguido de Streptococcus pyogenes con 5,190 mm, mientras Candida

albicans no mostr efecto alguno. Las letras en la figura sealan el orden en el

cual fueron afectados, siendo a, el que mayor dimetro del halo present, ab

un valor intermedio y b el que menor valor.

El grfico 4, muestra los valores promedios del halo de inhibicin, al realizar el

ANOVA (tabla 6 del anexo), se hall diferencia significativa, por lo que al

observar la tabla 7 del anexo, se observa que el control positivo es el que tuvo

mayor efecto con un promedio de 20.556 mm (Se representa por la letra a),

mientras que el resto tuvieron menor efecto (Se los representa con la letra b). Al

realizar la comparacin mediante el test de Dunnett, las concentraciones del

extracto y el control negativo con el control positivo (tabla 8 del anexo) se

muestra que ninguno de ellos se iguala al efecto del control positivo.

109
El grfico 5 muestra los valores promedios de los halos de inhibicin causado por

cinco concentraciones del extracto de Bixa orellana L., y dos controles.

En el grfico 6 se observa los promedios del halo de inhibicin generados por los

extractos de Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry sobre tres

microorganismos (Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus y Candida

albicans), al realizar el ANOVA (tabla 8 del anexo), se observa que existe

diferencia significativa, por lo que al observar la tabla 10 del anexo se muestra que

Staphylococcus aureus es el que ms halo de inhibicin mostr con un promedio

de 7,190 seguido de Streptococcus pyogenes con 4,286 mm, mientras que

Candida albicans no mostr efecto alguno. Las letras en la figura sealan el orden

en el cual fueron afectados, siendo a, el que mayor dimetro del halo present, ab

un valor intermedio y b el que menor valor.

El grfico 7, muestra los valores promedios del halo de inhibicin, al realizar el

ANOVA (tabla 8 del anexo), se hall diferencia significativa, por lo que al

observar la tabla 11 del anexo, se observa que el control positivo es el que tuvo

mayor efecto con un promedio de 22,222 mm (Se representa por la letra a),

mientras que el resto tuvieron menor efecto (Se los representa con la letra b). Al

realizar la comparacin mediante el test de Dunnett, las concentraciones del

extracto y el control negativo con el control positivo (tabla 13 del anexo) se

muestra que ninguno de ellos se iguala al efecto del control positivo.

En el grfico 8, se observa que existen diferentes valores del halo de inhibicin

generado por el extracto de Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry y Bixa

orellana L., adems de un control negativo y un control positivo sobre tres

microorganismos.

110
En el grfico 9 se observa los promedios del halo de inhibicin generados por los

extractos de Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry sobre tres

microorganismos (Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus y Candida

albicans), al realizar el ANOVA (tabla 14 del anexo), se observa que existe

diferencia significativa, por lo que al observar la tabla 15 del anexo se muestra

que Streptococcus aureus es el que ms halo de inhibicin mostr con un

promedio de 8,595, seguido de Staphylococcus pyogenes con 5,19 mm, mientras

que Candida albicans no mostr efecto alguno. Las letras en la figura sealan el

orden en el cual fueron afectados, siendo a, el que mayor dimetro del halo

present, ab un valor intermedio y b el que menor valor.

El grfico 10, muestra los valores promedios del halo de inhibicin, al realizar el

ANOVA (tabla 17 del anexo), se hall diferencia significativa, por lo que al

observar la tabla 16 del anexo, se observa que el control positivo es el que tuvo

mayor efecto con un promedio de 21.111 mm (Se representa por la letra a),

mientras que el resto tuvieron menor efecto (Se los representa con la letra b) Al

realizar la comparacin mediante el test de Dunnett, las concentraciones del

extracto y el control negativo con el control positivo (tabla 18 del anexo) se

muestra que ninguno de ellos se iguala al efecto del control positivo.

111
CONCLUSIONES

Al trmino del presente trabajo de investigacin sobre el estudio de actividad

bactericida y fungicida de diferentes extractos vegetales frente a

microorganismos, se ha llegado a las siguientes conclusiones:

- Mediante la identificacin de metabolitos secundarios se identificaron

metabolitos como: Los Flavonoides, Taninos, Compuestos fenlicos y

Triterpenos en A (Bixa orellana L.,), en B [Syzygium aromaticum (L.)

Merr. & L. M. Perry], y en la combinacin de ambas A+B (Bixa orellana L.,

+ Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry). En las reacciones de

Wagner en B (Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry) nos dieron

negativo al igual que en las saponinas en A (Bixa orellana L.,).

- Se muestran los valores promedios de halos de inhibicin, al realizar ANOVA

(tablas 6, 9 y 16 del anexo respectivamente) se hallaron diferencias

significativas. Al realizar el test de Tukey (tablas 7, 11, 17 del anexo) se

observa que los controles positivos tuvieron un mayor efecto mientras que el

resto un menor efecto y finalmente al realizar los de Dunnett (tablas 8,13 y 18

del anexo) se muestras que ninguno de ellos se iguala al efecto del control

positivo.

- Se logr tener actividad bactericida en Staphylococcus aureus a

concentraciones de 230 mg/mL con B y poca actividad con A. Lo mismo

ocurri a concentraciones de 115 mg/ml; hay halos ms pequeos con B y

halos muy pequeos con A. En este caso, el control positivo

112
(Ciprofloxacino) dieron como resultado los mayores dimetros de halos de

inhibicin.

Para el Streptococcus pyogenes, se observ menor actividad bactericida a

concentraciones de 230 mg/mL en B y nula actividad en A.

- En la combinacin de los extractos de Ay B, el Staphylococcus aureus es

el microorganismo ms afectado a concentraciones de 230 mg/mL. Lo mismo

ocurri a concentraciones de 115 mg/ml En el caso de Streptococcus pyogenes

se detect pequea actividad bactericida a concentraciones de 230 mg/mL.

- En Candida albicans no se observ actividad fungicida para A ni B; as

como tambin, en el control positivo en este caso Fluconazol.

- En la combinacin de A y B; tampoco se detect actividad bactericida para

Candida albicans. Mucho menos en el control positivo (Fluconazol).

113
RECOMENDACIONES

1. Continuar con los estudios de los extractos A (Bixa orellana L.,) y B

(Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry); Principalmente en la

combinacin de ambosA+B (Bixa Orellana L., + Syzygium aromaticum (L.)

Merr. & L. M. Perry) por ser este ltimo el que mostr mayor dimetro de halo

de inhibicin.

2. Continuar los estudios en mayores concentraciones de extractos

vegetales como en la combinacin de ambos.

3. Investigar la accin bactericida in vivo en animales de experimentacin para

determinar su eficacia y toxicidad.

4. Realizar estudios comparativos de Bixa orellana L., y Syzygium aromaticum

(L.) Merr. & L. M. Perry en diferentes zonas del Per y en diferentes pocas

del ao.

5. Realizar estudios en molculas presentes de los extractos vegetales, para

mejorar y/o potenciar sus acciones antioxidante, antibacteriana y

antiinflamatoria, adems de otras acciones no demostradas en estudios.

6. Planear formas farmacuticas e incentivar el estudio de las plantas medicinales

por ser esta fuente de innumerables compuestos de inters farmacutico.

114
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Acetato de Etilo de la Especie Baccharis tricuneata (L.f.) Pers Taya Frente a

116
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120
ANEXO 1

Figura 63: Concentracin Inhibitoria Mnima (CIM) en Staphylococcus

aureus con extractos A, B y A+B

121
A.

B.

Figura 64: A: Inculos de los microorganismos y tubo Mac Farland 0,5

B: Siembra de microorganismos.

122
A.

B. C.

Figura 65: A: Incubadora marca OVEN BJPX mobile.

B: Autoclave marca GEMMY, modelo SA-232X.

C: Cabina de seguridad biolgica marca

LABCULTURE, ESCO clase II, tipo A-II.

123
D.

E. F.

Figura 66: D: Micropipeta SCI LOGEX

E: Balanza analtica marca SERTORIUS BA 110S

F: Cmara de secado marca BINDER fd53

124
Figura 67: Actividad antifngica (Nula) de diluciones en discos impregnado de

125
diferentes concentraciones de extracto vegetal, control positivo

(Fluconazol 25 g) y control negativo (Etanol) frente Candida

albicans.

A = Bixa orellana L.,

B = Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry

A+B = Bixa orellana L., + Syzygium aromaticum (L.)

Merr. & L. M. Perry.

a, b,c = Repeticiones

126
Figura 68: Actividad antibacteriana de diluciones en discos impregnados de

127
diferentes concentraciones de extracto vegetal, control positivo

(Ciprofloxacino 5 g) y control negativo (Etanol) frente

Streptococcus pyogenes

A = Bixa orellana L.,

B = Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry

A+B = Bixa orellana L., +Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L.

M. Perry

a, b,c = Repeticiones

128
Figura 69: Actividad antibacteriana de diluciones en discos impregnados de

129
diferentes concentraciones de extracto vegetal, control positivo

(Ciprofloxacino 5 g) y control negativo (Etanol) frente

Staphylococcus aureus

A = Bixa orellana L.,

B = Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry

A+B = Bixa orellana L.,+ Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L.

M. Perry

a, b,c = Repeticiones

130
A.

B.

C.

Figura 70: A: Diluciones a concentraciones decrecientes de extracto de

Bixa orellana L.,

B: Diluciones a concentraciones decrecientes de extracto de

Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry

C: Diluciones a concentraciones decrecientes de extracto de

Bixa orellana L.,+Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M.

Perry

131
A.

B.

C.

Figura 71: A: Concentracion Bactericida Mnima Staphylococcus aureus en

extractos decrecientes en Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L.

M. Perry + Bixa orellana L.,

B: Concentracion Bactericida Mnima Staphylococcus aureus en

extractos decrecientes en Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M.

Perry.

C: Concentracion Bactericida Mnima Staphylococcus aureus en

extractos decrecientes en Bixa orellana L.,

132
Certificado1

133
101

13
4
Certificado 2

135
102

13
6
Certificado 3

137
103

13
8
Certificado 4

139
104

14
0
ANLISIS ESTADSTICOS

Tabla 1: Promedio y desviacin estndar del dimetro de inhibicin generado

por tres tipos de extractos (Bixa orellana L., Syzygium aromaticum (L.)

Merr. & L. M. Perry y combinacin de ambas), en cinco

concentraciones sobre tres microorganismos (Streptococcus pyogenes,

Staphylococcus aureus y Candida albicans)

Microorganismos

Concentraciones Streptococcus Staphylococcus


Tratamientos Candida albicans
(mg/ml) pyogenes aureus

Desviacin Desviacin Desviacin


Media Media Media
estndar estndar estndar

14,375 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

28,75 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00


Extracto de
Bixa orellana 57,5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
L., (mg/mL)
115 0,00 0,00 6,50 0,00 0,00 0,00

230 0,00 0,00 7,17 0,29 0,00 0,00

14,375 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00


Extracto de
Syzygium 28,75 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
aromaticum
57,5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
(L.) Merr. & L.
M. Perry 115 0,00 0,00 7,33 0,58 0,00 0,00
(mg/mL)
230 7,00 0,00 15,67 1,53 0,00 0,00

14,375 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00


Extracto de 28,75 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Bixa orellana
L., + Syzygium 57,5 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
aromaticum
(mg/mL) 115 0,00 0,00 9,17 0,76 0,00 0,00

230 7,00 0,00 17,00 1,73 0,00 0,00

117
Grfico 1: Dimetro promedio de los halos de inhibicin generado por Bixa

orellana L., Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry y

combinacin de ambas sobre tres microorganismos (Streptococcus

pyogenes, Staphylococcus aureus y Candida albicans)

118
Grfico 2: Dimetro promedio de los halos de inhibicin generado por cinco

concentraciones Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry sobre

tres microorganismos (Streptococcus pyogenes, Staphylococcus

aureus y Candida albicans).

119
Tabla 2: Estadsticos descriptivos del dimetro del halo de inhibicin causado por el

extracto de Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry (mg/mL) y dos

controles sobre tres microorganismos (Streptococcus pyogenes,

Staphylococcus aureus y Candida albicans)

Halo de inhibicin (mm)


95% del intervalo
de confianza para la
Desviacin Error
Microorganismos N Media media Mnimo Mximo
Estndar estndar
Lmite Lmite
inferior superior
Streptococcus 21 5,190 10,4097 2,2716 ,452 9,929 0,0 31,0
Pyogenes
Staphylococcus aureus 21 7,905 11,6829 2,5494 2,587 13,223 0,0 33,0
Candida albicans 21 0,000 0,0000 0,0000 0,000 0,000 0,0 0,0
Total 63 4,365 9,4822 1,1947 1,977 6,753 0,0 33,0

Grfico 3: Dimetro del halo de inhibicin promedio causado por el extracto de

Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry (mg/mL) y dos

controles sobre tres microorganismos (Streptococcus pyogenes,

Staphylococcus aureus y Candida albicans).

120
Tabla 3: Estadsticos descriptivos del dimetro del halo de inhibicin causado

por cinco concentraciones del extracto de Syzygium aromaticum (L.)

Merr. & L. M. Perry (mg/mL) y dos controles sobre tres

microorganismos.

95% del intervalo de


Concentracin de confianza para la
Desviacin Error
extractos (mg/mL) y N Media Media Mnimo Mximo
Estndar estndar
Controles Lmite Lmite
inferior superior
14,375 9 0,000 0,0000 0,0000 0,000 0,000 0,0 0,0
28,75 9 0,000 0,0000 0,0000 0,000 0,000 0,0 0,0
57,5 9 0,000 0,0000 0,0000 0,000 0,000 0,0 0,0
115,0 9 2,444 3,6780 1,2260 -,383 5,272 0,0 8,0
230,0 9 7,556 6,8394 2,2798 2,298 12,813 0,0 17,0
Control negativo 9 0,000 0,0000 0,0000 0,000 0,000 0,0 0,0
Control positivo 9 20,556 15,5009 5,1670 8,641 32,471 0,0 33,0

Grfico 4: Dimetro del halo de inhibicin causado por cinco concentraciones del

extracto de Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry (mg/mL)

y dos controles sobre tres microorganismos.


121
Grfico 5: Dimetro promedio de los halos de inhibicin generado por cinco

concentraciones Bixa orellana L., sobre tres microorganismos

(Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus y Candida albicans).

122
Tabla 4: Estadsticos descriptivos del dimetro del halo de inhibicin causado

por el extracto de Bixa orellana L., sobre tres microorganismos

(Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus y Candida albicans).

95% del intervalo de


confianza para la
Desviacin Error
Microorganismos N Media media Mnimo Mximo
estndar estndar
Lmite Lmite
inferior superior
Streptococcus 21 4,286 10,7617 2,3484 -,613 9,184 0,0 31,0
Pyogenes
Sthaphylococcus 21 7,190 12,7068 2,7728 1,406 12,975 0,0 37,0
Aureus
Candida albicans 21 0,000 0,0000 0,0000 0,000 0,000 0,0 0,0
Total 63 3,825 9,9150 1,2492 1,328 6,322 0,0 37,0

Grfico 6: Dimetro del halo de inhibicin promedio causado por el extracto de

Bixa orellana L., (mg/mL) y dos controles sobre tres

microorganismos (Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus y

Candida albicans)

123
Tabla 5: Estadsticos descriptivos del dimetro del halo de inhibicin causado por cinco

concentraciones del extracto de Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry

(mg/mL) y dos controles sobre tres microorganismos.

95% del intervalo de


Desviacin Error confianza para la media
N Media Mnimo Mximo
Estndar estndar Lmite Lmite
inferior superior
14,375 9 0,000 0,0000 0,0000 0,000 0,000 0,0 0,0
28,75 9 0,000 0,0000 0,0000 0,000 0,000 0,0 0,0
57,5 9 0,000 0,0000 0,0000 0,000 0,000 0,0 0,0
115,0 9 2,167 3,2500 1,0833 -,332 4,665 0,0 6,5
230,0 9 2,389 3,5862 1,1954 -,368 5,146 0,0 7,5
Control 9 0,000 0,0000 0,0000 0,000 0,000 0,0 0,0
negativo
Control 9 22,222 16,9247 5,6416 9,213 35,232 0,0 37,0
positivo
Total 63 3,825 9,9150 1,2492 1,328 6,322 0,0 37,0

Grfico 7: Dimetro del halo de inhibicin causado por cinco concentraciones

del extracto de Bixa orellana L., (mg/mL) y dos controles sobre tres

microorganismos.

124
Grfico 8: Dimetro promedio de los halos de inhibicin generado por cinco

concentraciones de Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry y

Bixa orellana L., sobre tres microorganismos (Streptococcus

pyogenes, Staphylococcus aureus y Candida albicans).

125
Tabla 6: Estadsticos descriptivos del halo de inhibicin generado por cinco

concentraciones de Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry y

Bixa orellana L., sobre tres microorganismos (Streptococcus

pyogenes, Staphylococcus aureus y Candida albicans).

95% del intervalo de


confianza para la
Desviacin Error
N Media media Mnimo Mximo
estndar Estndar
Lmite Lmite
inferior superior

Streptococcus 21 5,190 10,4097 2,2716 ,452 9,929 0,0 31,0


Pyogenes
Sthaphylococcus 21 8,595 12,3386 2,6925 2,979 14,212 0,0 35,0
Aureus
Candida albicans 21 0,000 0,0000 0,0000 0,000 0,000 0,0 0,0
Total 63 4,595 9,8365 1,2393 2,118 7,073 0,0 35,0

Grfico 9: Promedio de los halos de inhibicin generado por cinco

concentraciones de Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry y

Bixa orellana L., sobre tres microorganismos (Streptococcus

pyogenes, Staphylococcus aureus y Candida albicans).


126
Tabla 7: Estadsticos descriptivos del halo de inhibicin generado por cinco

concentraciones de Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry y

Bixa orellana L., dos controles sobre tres microorganismos.

95% del intervalo de


Desviacin Error confianza para la media
N Media Mnimo Mximo
estndar estndar Lmite Lmite
inferior superior
14,375 9 0,000 0,0000 0,0000 0,000 0,000 0,0 0,0
28,75 9 0,000 0,0000 0,0000 0,000 0,000 0,0 0,0
57,5 9 0,000 0,0000 0,0000 0,000 0,000 0,0 0,0
115,0 9 3,056 4,5992 1,5331 -,480 6,591 0,0 10,0
230,0 9 8,000 7,4498 2,4833 2,274 13,726 0,0 18,0
Control 9 0,000 0,0000 0,0000 0,000 0,000 0,0 0,0
negativo
Control 9 21,111 15,9878 5,3293 8,822 33,400 0,0 35,0
positivo
Total 63 4,595 9,8365 1,2393 2,118 7,073 0,0 35,0

Grfico 10: Promedio del halo de inhibicin generado por cinco concentraciones

de Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry y Bixa orellana L.,

dos controles sobre tres microorganismos.

127
ANEXO 2

Tabla 1: ANOVA para comparar el dimetro de inhibicin generado por Bixa

orellana L., Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry, combinacin de

ambas y dos controles sobre tres microorganismos (Streptococcus pyogenes,

Staphylococcus aureus y Candida albicans).

Variable dependiente: Halo de inhibicin (mm)


Tipo III de suma de Cuadrtico
Origen cuadrados Gl promedio F Sig.

Tratamientos 9249,767 4 2312,442 65,382 ,000


Microorganismos 2001,484 2 1000,742 28,295 ,000
Error 6437,034 182 35,368
Total 21121,250 189
Total corregido 17688,286 188
a. R al cuadrado = ,636 (R al cuadrado ajustada = ,624)

Tabla 2: Test de Tukey para comparar el dimetro de inhibicin generado por

Bixa orellana L., Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry, combinacin de

ambas y dos controles sobre tres microorganismos.

HSD Tukeya,b,c
Subconjunto
Tratamientos N
1 2

Control negativo 27 0,000


A 45 ,911
B 45 2,000
A+B 45 2,211
Control positivo 27 21,296
Sig. ,521 1,000
Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos homogneos.
Se basa en las medias observadas.
El trmino de error es la media cuadrtica (Error) = 35,368.
a. Utiliza el tamao de la muestra de la media armnica = 35,526.
b. Los tamaos de grupo no son iguales. Se utiliza la media armnica de los tamaos
de grupo. Los niveles de error de tipo I no estn garantizados.
c. Alfa = 0,05.
128
Tabla 3: Test de Tukey para comparar el dimetro de inhibicin generado por tres

extractos sobre tres microorganismos (Streptococcus pyogenes, Staphylococcus

aureus y Candida albicans).

HSD Tukey
a,b
Subconjunto
Microorganismos N
1 2 3

Candida albicans 63 0,000


Streptococcus pyogenes 63 4,889

Staphylococcus aureus 63 7,897

Sig. 1,000 1,000 1,000


Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos homogneos.
Se basa en las medias observadas.
El trmino de error es la media cuadrtica (Error) = 35,368.
a. Utiliza el tamao de la muestra de la media armnica = 63,000.
b. Alfa = 0,05.

Tabla 4: ANOVA para comparar el dimetro promedio de los halos de inhibicin

generado por el extracto Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry tres

microorganismos (Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus y Candida

albicans.)

Halo de inhibicin (mm)


Suma de Media
Origen gl F Sig.
cuadrados Cuadrtica

Entre grupos 677,556 2 338,778 4,151 ,020


Dentro de grupos 4897,048 60 81,617
Total 5574,603 62

129
Tabla 5: Test de Tukey para comparar el dimetro de inhibicin generado por el

extracto de Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry sobre tres

microorganismos (Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus y Candida

albicans).

HSD Tukey
a
Subconjunto para alfa = 0.05

Microorganismos N
1 2

Candida albicans 21 0,000


Streptococcus pyogenes 21 5,190 5,190
Staphylococcus aureus 21 7,905
Sig. ,159 ,596

Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos


homogneos. a. Utiliza el tamao de la muestra de la media
armnica = 21,000.

Tabla 6: ANOVA para comparar el dimetro promedio de los halos de inhibicin

generado por cinco concentraciones del extracto Syzygium aromaticum (L.) Merr.

& L. M. Perry y dos controles sobre tres microorganismos.

Halo de inhibicin (mm)


Suma de Media
gl F Sig.
Cuadrados Cuadrtica

Entre grupos 3169,937 6 528,323 12,304 ,000


Dentro de grupos 2404,667 56 42,940
Total 5574,603 62

130
Tabla 7: Test de Tukey para comparar el dimetro de inhibicin generado por

cinco concentraciones del extracto Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry

y dos controles sobre tres microorganismos.

Subconjunto para alfa =


0.05
Concentraciones de extracto (mg/mL) y
controles N 1 2
HSD Tukeya 14,375
9 0,000
28,75
9 0,000
57,5
9 0,000
Control negativo
9 0,000
115,0
9 2,444
230,0
9 7,556
Control positivo
9 20,556
Sig.
,199 1,000
Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos
homogneos. a. Utiliza el tamao de la muestra de la media
armnica = 9,000.

Tabla 8: ANOVA para comparar el dimetro promedio de los halos de

inhibicin generado por el extracto Bixa orellana L., sobre tres

microorganismos (Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus y Candida

albicans).

Halo de inhibicin (mm)


Suma de Media
Gl F Sig.
Cuadrados Cuadrtica

Entre grupos 549,556 2 274,778 2,973 ,059


Dentro de grupos 5545,524 60 92,425
Total 6095,079 62

131
Tabla 9: Test de Dunnett para comparar el dimetro de inhibicin generado por

cinco concentraciones del extracto Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M.

Perry, un control negativo con el control positivo.

Variable
Halo de inhibicin
dependie
(mm.)
nte:
95% de intervalo de
Diferencia confianza
(I) Concentraciones de extracto Error
de medias Sig.
(mg/ml) y controles estndar Lmite Lmite
(I-J)
inferior superior
-
14,375 Control positivo 30,891 ,000 -28,733 -12,378
20,5556*
-
28,75 Control positivo 30,891 ,000 -28,733 -12,378
20,5556*
T de -
57,5 Control positivo 30,891 ,000 -28,733 -12,378
Dunnett 20,5556*
(bilateral) 115,0 Control positivo -18,1111* 30,891 ,000 -26,288 -9,934
-
230,0 Control positivo 30,891 ,001 -21,177 -4,823
13,0000*
Control -
Control positivo 30,891 ,000 -28733 -12,378
negativo 20,5556*

*. La diferencia de medias es significativa en el nivel 0.05.


b. Las pruebas test de Dunnett tratan un grupo como un control, y comparan todos los
dems grupos con este.

Tabla 10: Test de Tukey para comparar el dimetro de inhibicin generado

por el extracto de Bixa orellana L sobre tres microorganismos (Streptococcus

pyogenes, Staphylococcus aureus y Candida albicans).

Subconjunto para alfa = 0.05


Microorganismos N
1 2

HSD Tukeya Candida albicans 21 0,000


Streptococcus pyogenes 21 4,286 4,286
Staphylococcus aureus 21 7,190
Sig. ,325 ,593
Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos
homogneos. a. Utiliza el tamao de la muestra de la media
armnica = 21,000.

132
Tabla 11: ANOVA para comparar el dimetro promedio de los halos de

inhibicin generado por cinco concentraciones del extracto Bixa orellana L., y

dos controles sobre tres microorganismos.

Halo de inhibicin (mm)


Suma de Media
gl F Sig.
cuadrados Cuadrtica

Entre grupos 3616,135 6 602,689 13,615 ,000


Dentro de grupos 2478,944 56 44,267
Total 6095,079 62

Tabla 12: Test de Tukey para comparar el dimetro de inhibicin generado por

cinco concentraciones del extracto Bixa orellana L., y dos controles sobre tres

microorganismos.

Subconjunto para alfa = 0.05


Concentraciones de extracto (mg/ml) y controles N 1 2
HSD Tukeya 14,375 9 0,000
28,75 9 0,000
57,5 9 0,000
Control negativo 9 0,000
115,0 9 2,167
230,0 9 2,389
Control positivo 9 22,222
Sig. ,988 1,000
Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos
homogneos. a. Utiliza el tamao de la muestra de la media
armnica = 9,000.

133
Tabla 13: Test de Dunnett para comparar el dimetro de inhibicin generado por

cinco concentraciones del extracto Bixa orellana L., un control negativo con el

control positivo.

95% de intervalo
(I) Concentraciones de extracto
(mg/ml) Diferencia de Error De confianza
Sig.
y controles medias (I-J) estndar Lmite Lmite
Inferior superior

T de Dunnett 14,375 Control -22,2222* 3,1364 ,000 -30,525 -13,920


(bilateral)b positivo
28,75 Control -22,2222* 3,1364 ,000 -30,525 -13,920
positivo

57,5 Control -22,2222* 3,1364 ,000 -30,525 -13,920


positivo

115,0 Control -20,0556* 3,1364 ,000 -28,358 -11,753


positivo

230,0 Control -19,8333* 3,1364 ,000 -28,136 -11,531


positivo

Control Control -22,2222* 3,1364 ,000 -30,525 -13,920


negativo positivo
*. La diferencia de medias es significativa en el nivel 0.05.
b. Las pruebas test de Dunnett tratan un grupo como un control, y comparan todos los
dems grupos con este.

Tabla 14: ANOVA para comparar el dimetro promedio de los halos de inhibicin

generado por el extracto Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry y Bixa

orellana L., sobre tres microorganismos (Streptococcus pyogenes, Staphylococcus

aureus y Candida albicans).

Halo de inhibicin (mm)


Suma de Media
Gl F Sig.
Cuadrados Cuadrtica

Entre grupos 786,881 2 393,440 4,529 ,015


Dentro de grupos 5212,048 60 86,867
Total 5998,929 62

134
Tabla 15: Test de Tukey para comparar el dimetro de inhibicin generado por el

extracto de Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry y Bixa orellana L.,

sobre tres microorganismos (Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus y

Candida albicans).

HSD Tukeya
Subconjunto para alfa = 0.05
Microorganismos N 1 2
Candida albicans 21 0,000
Streptococcus pyogenes 21 5,190 5,190
Staphylococcus aureus 21 8,595
Sig. ,177 ,467
Se visualizan las medias para los grupos en los subconjuntos
homogneos. a. Utiliza el tamao de la muestra de la media
armnica = 21,000.

Tabla 16: Test de Tukey para comparar el dimetro de inhibicin generado por

cinco concentraciones del extracto de Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M.

Perry y Bixa orellana L., y dos controles sobre tres microorganismos.

Subconjunto para alfa = 0.05


Concentraciones de extracto (mg/mL) y controles N 1 2
HSD Tukeya 14,375 9 0,000
28,75 9 0,000
57,5 9 0,000
Control negativo 9 0,000
115,0 9 3,056
230,0 9 8,000
Control positivo 9 21,111
Sig. ,193 1,000
Se visualizan las medias para los grupos en los
subconjuntos homogneos. a. Utiliza el tamao de la
muestra de la media armnica = 9,000.

135
Tabla 17: ANOVA para comparar el dimetro promedio de los halos de inhibicin

generado por cinco concentraciones del extracto Syzygium aromaticum (L.) Merr.

& L. M. Perry y Bixa orellana L., y dos controles sobre tres microorganismos.

Halo de inhibicin (mm)


Suma de Media
gl F Sig.
cuadrados Cuadrtica

Entre grupos 3340,817 6 556,803 11,730 ,000


Dentro de grupos 2658,111 56 47,466
Total 5998,929 62

Tabla 18: Test de Dunnett para comparar el dimetro de inhibicin generado por

cinco concentraciones del extracto Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L. M. Perry

y Bixa orellana L., un control negativo con el control positivo.

95% de intervalo de
Diferencia
(I) Concentraciones de extracto Error confianza
de medias Sig.
(mg/ml) y controles estndar Lmite Lmite
(I-J)
inferior superior
Control
14,375 -21,1111* 32,478 ,000 -29,708 -12,514
positivo
Control
28,75 -21,1111* 32,478 ,000 -29,708 -12,514
positivo
Control
57,5 -21,1111* 32,478 ,000 -29,708 -12,514
T de Dunnett positivo
(bilateral)b Control
115,0 -18,0556* 32,478 ,000 -26,653 -9,458
positivo
Control
230,0 -13,1111* 32,478 ,001 -21,708 -4,514
positivo
Control Control
-21,1111* 32,478 ,000 -29,708 -12,514
negativo positivo

*. La diferencia de medias es significativa en el nivel 0.05.


b. Las pruebas test de Dunnett tratan un grupo como un control, y comparan todos los
dems grupos con este.

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