TD : clonage/ADN recombinant

Dfinition du clonage:
Multiplication in vitro d'un organisme, d'une cellule souche ou
d'un gne, en grand nombre d'exemplaires identiques
 Les techniques de lADN
recombinant
But: isoler des fragments dADN de gnomes
complexes et les recombiner dans des
gnomes plus petits et faciles manipuler et
analyser.
Des outils de bricolage: utilit des enzymes
Structure des vecteurs de clonage en
fonction de leurs htes
Comment dfinir un schma de clonage?
Couper: les enzymes de restriction
 Enzymes de restriction
AluI AG/CT Arthrobacter luteus

CfoI GCG/C Clostridium formicoaceticum

EcoRV GAT/ATC Escherichia coli B946

EcoRI G/AATTC Escherichia coli RY13

EcoRII /CCWGG Escherichia coli R245

SfiI GGCCNNNN/NGGCC Streptomyces fimbriatus

Coller: la ligase
Copier: les polymrases
Marquer: kinase
Eviter lauto-ligation:
phosphatase
Synthse partir dARN:
Reverse transcriptase
 Les vecteurs de clonage
et leurs htes
Hte = bactrie

- une molcule capable

daccepter un ADN tranger Hte = bactriophage

- une molcule capable de se

rpliquer dans un hte Hte = levure

- une molcule possdant des

marqueurs de slection
Hte = cellule dinsecte
ou uf de Xnope
Exemple: Plasmide
Schma dune manipulation de
clonage type
Schma dune manipulation de
clonage type
 Les stratgies de clonage:
1. Slectionner les clones recombinants

Insertion dans un autre gne de rsistance aux antibiotiques

 Les stratgies de clonage:
1. Slectionner les clones recombinants

Complmentation dune souche

bactrienne possdant une mutation dans
le gne LacZ

Insertion dans la partie LacZa de lopron lactose

 Les stratgies de clonage:
1. Slectionner les clones recombinants

Le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D
galactoside (X-Gal) est cliv par la -
galactosidase pour donner une substance
bleue insoluble et en prsence dIPTG
(colonies bleues)

Si on introduit un ADN tranger dans le

polylinker, on dtruit la grille de lecture:
pas de -galactosidase active
(colonies blanches)

Insertion dans la partie LacZa de lopron lactose

 Les stratgies de clonage:
2. Eviter la recircularisation du vecteur

Clonage directionnel Dphosphorylation du vecteur

 Les stratgies de clonage:
3. Faire en fonction des possibilits

Bouts collants possibles

Clonage directionnel possible si 2 enzymes diffrentes
Possibilit dutiliser des enzymes extrmits
compatibles
Addition de bouts collants
Ajout de nuclotides en 3 par la terminal transfrase
Liaison de bouts francs
Digestion par la nuclase S1
Utilisation de lADN ligase de T4
 Les stratgies de clonage:
4. Comment cloner un gne particulier?

1re mthode:
Clonage du gnome entier: banque de gnes
Dtection du gne par hybridation molculaire
ou PCR
Proba de trouver une squence donne dans une
collection de N transformants: P = 1 (1-f)N
f: fraction du gnome effectivement clone
dpend de la taille du fragment et de la complexit du gnome
 Les stratgies de clonage:
4. Comment cloner un gne particulier?

2me mthode:
Reprer le gne par hybridation molculaire
(Southern)
Rcuprer le fragment repr sur le gel
dagarose et le cloner dans un vecteur