CUANTIFICACIN DE ACIDOS NUCLEICOS

1. OBJETIVOS
1.1 OBJETIVO GENERAL
- Conocer la calidad y cantidad del ADN obtenido en la extraccin realizada en
clase, mediante dso mtodos electroforeris en gel de agarosa y
espectrofotometra (U.V)
1.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
- Realizar la cuantificacin de ADN por espectrofotometra
-
2. METODOLOGIA
TECNICA DE CUANTIFICACION POR ELECTROFORESIS
TECNICA POR ESPECTROFOTOMETRIA

3. Determinacion cuantitativa y de la pureza del DNA

 4. RESULTADOS
GRUPO 1
IMAGEN N*1 CORRIDA ELECTROFORETICA DE UNA MISMA MUESTRAS
DE DNA EN DIFERENTES CONCENTRACIONES VISTA EN EL
TRANSILUMINADOR ( UV). LABORATORIO DE BIOLOGIA
MOLECULAR. FCFB UMSA 31-05-2017.

CARRIL 1 2 3 4 5 6

Fotografa de la corrida electrofortica en gel de agarosa

Tcnica por espectrofotometra: determinacin cuantitativa de la pureza del

DNA

Para realizar lectura al espectrofotometro como blanco utilizamos TNE y realizamos

una dilucin de 1/30 de la muestra con TNE estas fueron las absorvancias ledas:

Longitud de onda (nm) Abs de la muestra

260 0,798
280 0,597
320 0,390
Se realizaron las lecturas en diferentes absorvancias bajo siguiente detelles: a 260 nm
porque a esta longitud de onda tanto el DNA como el RNA presentan una misma
absorvancia de luz, a 280 nm es la absorvancia que se lee para las protenas y se lee a
320 para corregir la absorvancia de materiales de desecho o restos celulares que pueden
interferir en la lectura.

Clculo de la concentracin total de los cidos nucleicos: para realizar dicho

clculo se utiliz la siguiente frmula.

DNA(ug/ml) = (DO260 DO320) x (Factor de dilucion) x (50)

Sabiendo que el factor de dilucin fue de 1/30 y teniendo las absorvancias (260 nm =
0,740 y 320nm=0,458), entonces:

DNA (ug/ml) = ( 0,798 0,390 ) x (30) x (50)

DNA (ug/ml) = 612 ug/ml

Clculo de la pureza del extracto: para dicho clculo se utiliz la siguiente

relacin.
0,798
Entonces: Pureza = ________ = 1,337
0,597

Esto se debe porque las protenas (principalmente molculas contaminantes en extractos

de cidos nucleicos) tienen una mxima Absorvancia a 280 nm debido al residuos de
triptfano, y la relacin aceptable es de : 1,65 a 1,85, un valor , ms bajo representa una
alta contaminacin proteica y un valor representara una sobreestimacin de la
concentracin de DNA

GRUPO 2

RESULTADOS:
a) Tcnica de cuantificacin por electroforesis determinacin de la pureza
de DNA
En el transiluminador uv se observo
1 2 3
se observ la presencia de DNA hasta el carril
nmero 3 en las demos no se pudo evidencia
una corrida electrofortica en la banda nmero
2 se observ una banda ms brillante q en la
numero 2.
Concentracin del extracto es de 0.1ng/ul y la
concentracin inicial del extracto es y la
concentracin inicial del extracto es de 0.3ng/ul
B) tcnica de espectrofotometra

Longitud de Abs de la
onda(nm) muestra
260 0.798
280 0.735
320 0.671

Determinar la concentracin de cidos nucleicos

DNA (ug/ml) =190.5

Calcular la pureza del extracto

Pureza =1.085
5. DISCUSION
La electroforesis la cual nos permite cualificar y cuantificar las molculas, la cantidad
utilizada es subjetiva, aunque es un mtodo menos sensible y las muestras son
difciles de recuperar.

La calidad de las molculas extradas se analiza por electroforesis en gel de agarosa

ya que en la corrida se puede observar si esta se encuentra contaminada con
protenas u otros, en esta tambin se puede determinar la cantidad de DNA se puede
estimar mediante la comparacin del rendimiento de fluorescencia de las muestras
En los resultados de electroforesis se observ la presencia de DNA hasta el carril 3 y
en los dems pocitos hay prdida de banda de DNA en el poso 1 y 2 se observ poso
brillante presentando baja pureza de DNA containado con protenas para este se debi
realizar una buena extracion de DNA mejorando las etapas de desproteinizacion, en
los posos 1 y2 se realiz el z corrimiento de DNA, en el poso 3 existe poca
visualizacin de un poso brillante donde hay poca presencia de corrida de DNA , en el
poso 4 ,5 ,6 no se present corrida de DNA esto posiblemente sea por la presencia
RNasa presente en la muestra donde elimina RNasa presentes como tambien se
puede decir que hay una prdida de banda de DNA por una coomigracion de la
banda con el tapn de corrida que puede absorber el bromuro de Etidio y para
ccorregir seria hacer correr sin colorante como el azul de bromo fenol

Mediante la realizacin por el mtodo de espectrofotometra se puede cuantificar las

muestras de DNA obteniendo resultados que nos permiten verificar que la muestra
tena una mayor concentracin de DNA; aunque este por ser una mezcla ms impura
o contaminada tambin mediante espectrofotometra se realiza la comparacin de
calidad de las muestras. En la tcnica de diluciones se tiene que a mayor dilucin
existe mayor absorvancias.

Luego de la extraccin del DNA, son necesarios la cuantificacin y el anlisis de la

cantidad de las molculas obtenida. Uno de los mtodos ms utilizados para la
cuantificacin del DNA es el anlisis de la absorcin UV, ya que los nucletidos
poseen mximos de absorcin alrededor de 260 nm este mtodo proporciona una
estimacin simple y precisa de la concentracin de una muestra, pero solo si esta se
encuentra pura, sin contaminacin significativa de protenas o solventes orgnicos que
absorben a longitudes de onda cercanas.

Por el mtodo de espetrofotortria nos dio una presencia de contaminacion realizando

los calulos de purea donde on los absorvancias obtenidas nos dio 1085 de purea
presentando contaminacion de protenas comparando con el rango de 1.65 1.85 y
tambien on una concentracion de DNa de 190.5 ug ml donde es una concentracion
muy elevada tale fuera de rango .

6. CONCLUSIONES

7. CUESTIONARIO
Cuestionario

1. Determine la cantidad de DNA que tiene cada fragmento de DNA de bacterifago

lambda digerido con Hind III (anexo) considerando 50 ug totales de DNA del fago.

564 (564)(50)
a) 50
= 23139
x ug = 23139
= 1.22ug

564 (564)(50)
b) 50
= 9416
x ug = 9416
= 2,99ug

564 (564)(50)
c) = x ug = = 4,30ug
50 6557 6557

564 (564)(50)
d) 50
= 4361
x ug = 4361
= 6,47ug

564 (564)(50)
e) 50
= 2322
x ug = 2322
= 12,14ug

564 (564)(50)
f) = x ug = = 13,91ug
50 2027 2027

564 (564)(50)
g) 50
= 564
x ug = 564
= 50ug

564 (564)(50)
h) 50
= 125
x ug = 125
= 225,60ug

2. Si se siembran 10ul de cada una de las diluciones , 1/8, 1/32 de una solucin 50
mg/mL de DNA de bacterifago lambda. que fragmentos se podrn observar en
agarosa en cada dilucin?
 50/
I. 10
2 = 10/10 =1

/
II. 10
8 = 40/10 = 4

50/
III. 10
32 = 160/10 = 16

3. Se sembro en un gel, 20uL de una serie de diluciones y se pudo observar hasta el

4 carril. Calcule la concentracin de DNA del extracto.
1
Concentracin = 20 x 256 = 12,8ng/ul de DNA

4. Si el extracto del anterior problema se lee DO260, DO280 y DO320, Cules seran sus
posibles lecturas?
12.8 ng/ul = 12,8 ug/ml

50ug/ml ----------1 ABS

12, 8 ug/ml ------- x

X = 0,256 por tanto la DO260 = 0,256

DNA (ug/ml) = (DO260 DO320) X FD X (50)

12, 8ug/ml = (0,256 DO 320) x 4 x 50

12,8 ug/ml = 51,2 200 DO 320

200 DO320 = 51,2 12,8

DO320 = 38,4/ 200

DO320 = 0,192

0,256 ------- 260

X ------- 280

DO280= 0,2756

5. Discuta el resultado del problema 3 si en el gel se observan en cada carril 2 bandas.

1
Concentracin = 16 = 0,8 ng/ul de DNA
20

Se podra afirmar que mientras mas carriles recorra la muestra, ser mayor la concentracin
de DNA en la muestra en el problema tres se observa una corrida hasta el carril n 4 el cual
tiene una concentracin de 12,8 ng/ul mientras que en el carril tres hay una concentracin
menor.

8. BIBLIOGRAFIA