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PRINCIPALES TECNICAS PARA MEDIR LOS RADICALES LIBRES

Fundamento del Test KRL


Se trata de someter una muestra de
sangre a una agresin radicalar en
unas condiciones estrictamente
controladas y estandardizadas.
Todos los sistemas enzimticos y
qumicos de la muestra se movilizan
para proteger la integridad de las
clulas hasta su lisis.
El anlisis, realizado en unas micro placas de 96 pozos, permite el tratamiento
de un numero importante de desaparicin progresiva de las clulas. La
resistencia de la sangre al ataque radicalar esta expresada por el tiempo
necesario a la lisis del 50% de las clulas sanguneas. Los resultados estn
estandardizados en E.A.R. (Eficacia Anti-Radicalar) de forma perfectamente
reproductible (CV < 2%).El programa KRL, permite obtener automticamente
vuestros resultados y tratar grficamente todos vuestros datos.
Aplicaciones
El inters mdico del test KRL es que refleja la resistencia global de un individuo
a un ataque radicalar teniendo en consideracin todos los factores positivos
(vitaminas, enzimas) o negativos (tabaquismo, alcoholismo, estrs, alimentacin
desequilibrada, polucin, edad, enfermedad). Permite entonces apreciar, de
forma preventiva, la progresin del capital de defensa hacia un estado
pre-patolgico. Se presenta entonces como un test de primera intencin para la
medicina preventiva.
El test KRL puede ser utilizado para seguir la accin de una prescripcin sobre
el estatuto de las defensas antiradicalares y para poder personalizar un
tratamiento. Se presenta entonces como una formidable herramienta de
seguimiento clnico y teraputico.Con la ayuda del test KRL, podemos
determinar in vitro et in vivo el poder antioxidante o la accin prooxidante de
numerosos compuestos y de sus metabolitos identificados o no. Es
indispensable y indisociable para el desarrollo de nuevas molculas
farmacuticas o de nutra cticos. Por eso, el test KRL de medicin global y
dinmica del potencial de defensa antiradicalar, al tener en cuenta todos les
factores de riesgos relacionados con el entorno, la higiene de vida y las
predisposiciones genticas, se utiliza tanto para la prevencin de numerosas
patologas como para el seguimiento clnico y teraputico de los enfermos.
Ensayo de DPPH
El ensayo de DPPH es una de las diversas tcnicas empleadas para estimar la
actividad secuestradora de radicales de compuestos especficos o extractos
naturales. Esta tcnica espectrofotomtrica emplea el radical 1,1-difenil-2-
picrilhidracil (DPPH), que posee un espectro de absorbancia caracterstico, con
un mximo de absorbancia a 515 nm (Figura 1). La reduccin de DPPH
provocada por un antioxidante (AH) o un radical, implica disminucin en su
absorbancia a 515 nm.

Figura 1. Estructuras y espectros del radical DDPH (lnea violeta) y de DPPH


reducido (lnea amarilla)

Se crea que el ensayo de DPPH involucraba una reaccin de transferencia de


un tomo de hidrgeno, pero Foti y colaboradores sugirieron que la reaccin que
tiene lugar corresponde a una transferencia de electrones. Los autores
determinaron que el paso determinante de la velocidad para esta reaccin
consiste en un proceso rpido de transferencia de electrones de un anin
fenxido al DPPH. Que el DPPH sustraiga un tomo de hidrgeno a partir del
antioxidante fenlico neutral resulta una va secundaria de reaccin, dado que
sta ocurre muy lentamente en solventes tales como metanol y etanol. Adems,
los autores indicaron que cidos o bases presentes como contaminantes en el
solvente pueden influenciar dramticamente el equilibrio de ionizacin de
fenoles, alterando los valores de las constantes de velocidad de reaccin
medidas.
Adems de las diferencias mecansticas entre la reaccin de transferencia de
tomos de hidrgeno que ocurre normalmente entre antioxidantes y radicales
peroxilos, DPPH es un radical nitrogenado de larga vida, que no guarda relacin
con los radicales peroxilos altamente reactivos involucrados en la peroxidacin
lipdica. Muchos antioxidantes que reaccionan rpidamente con radicales
peroxilos pueden reaccionar lentamente o, an ms, ser inertes frente al DDPH.
A pesar de estas desventajas, el ensayo de DPPH sigue siendo una tcnica
ampliamente utilizada debido a su simplicidad y a la ventaja de emplear un
radical libre estable disponible comercialmente. Es altamente reproducible y
comparable con otros mtodos como ABTS, reduccin de anin superxido e
inhibicin de peroxidacin lipdica.

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD DE XANTINA OXIDASA / XANTINA


DESHIDROGENASA

Fundamento
Se sigue un mtodo fluorimtrico descrito por Beckman y cols.(280). Este mtodo
est basado en la monitorizacin fluorimtrica de la formacin de isoxantopterina
a partir de pterina, reaccin catalizada tanto por la forma oxidasa como por la
forma deshidrogenasa. Si en el medio de reaccin no hay azul de metileno (un
aceptor de electrones), estaremos determinando la forma oxidasa, la cual utiliza
al O2 como aceptor de electrones. Si al medio de reaccin le aadimos azul de
metileno, la variacin de fluorescencia se deber tanto a la forma oxidasa como
a la forma deshidrogenasa. La formacin de isoxantopterina se sigue
fluorimtricamente a 345 nm de excitacin y 390 nm de emisin.
Reactivos
- Tampn fosfato potsico 50 mM EDTA 0.1 mM, pH 7.4
- Pterina (2-amino-4-hidroxipteridina) 1 mM.
- Isoxantopterina 1 mM.
- Azul de metileno 1 mM en agua.
- Alopurinol 1 mM en agua.

Preparacin de la muestra biolgica.


Plasma: La determinacin de la actividad xantina oxidasa y xantina
deshidrogenasa se realiza en plasma. Este se obtuvo por centrifugacin a 1300g
de la sangre heparinizada recin extrada. Una vez obtenido el plasma se puede
conservar a -20 C durante varios
meses. As pues para determinar XO/XDH en plasma humano tenemos que
purificar las muestras mediante columnas de sephadex G-25, equilibradas con
tampn fosfato, y
realizar la determinacin en el eluato.

Clculo de la actividad
Una unidad de actividad se define como la cantidad de enzima que cataliza la
formacin de un mol de isoxantopterina por minuto. En plasma la expresamos
en unidades por litro de plasma..