Agrobacterium tumefaciens Y SU USO EN EL MEJORAMIENTO GENTICO

Agrobacterium tumefaciens es un patgeno reconocido de plantas y tienen la capacidad

de integrar establemente parte de su material gentico dentro del genoma de su hospedero
induciendo la formacin de tumores plantas, el conocimiento de este mecanismo ha
permitido su uso como herramienta en la ingeniera gentica plantas. As mismo, esta
interaccin dado pie a formular modelos de sealizacin celular, transporte clula v
clula, importe nuclear de protenas, ADN y mecanismos de integracin genmica.
El segmento de DNA transferido es conocido como la regin T-DNA (DNA de
transferencia) y se encuentra en el plsmido residente de la bacteria llamado plsmido Ti
(inductor de tumores). Esta regin contiene genes que codifican para la biosntesis de
fitohormonas y opinas (carbohidratos nicamente metabolizables por la bacteria). Para
que se d una transferencia efectiva de esta regin es necesaria la expresin de los
"genes Vir" contenidos en la regin Vir (regin de virulencia), la cual, se encuentra en el
plsmido TI.
Mecanismo de transferencia de Agrobacterium tumefasciens
La protena de membrana VirA interacta de forma directa o indirecta con compuestos
fenlicos producidos por las plantas como lignina, precursores de flavonoides y
acetosiringona. La glucosa y galactosa tambin se unen a receptores ChvE que
interactan con Vir A. La protena citoplasmtica VirG es fosforilada por VirA y permite
la transduccin de seales que activan los genes vir. Los genes vir producen el ADN-T
ya que actan como endonucleasas, unindose al plsmido Ti en los bordes del ADN-T
relajndolo y haciendo cortes en la cadena del ADN-T sin sentido, despus de hacer el
corte, la protena VirD2 se une covalentemente al extremo 5 del ADN-T hasta su
transferencia a la planta. Al ADN-T unido a VirD2 u na vez ha llegado, tambien se unen
VirE2 formando un complejo de transferencia.
Agrobacterium utiliza un mecanismo similar a la conjugacin sistema de secrecin tipo
IV (T4SS). Este transportador exporta factores de virulencia importantes a travs de la
membrana de la bacteria como VirB1 permite disolver la membrana de peptidoglicano
de la pared bacteriana y puede participar en el contacto clula a clula. VirB3 y VirB4
promueven el ensamblaje del pili de virulencia.VirB6 media la formacin de los
complejos VirB7 y VirB9 requeridos para la biognesis del pili T y del canal de secrecin.
VirB10 se ubica transmembranalmente y su funcin es desconocida, y finalmente VirD4
es requerida para la formacin del pili de virulencia
Las protenas VirE2 y VirD2 contribuyen al direccionamiento del T-DNA hacia el ncleo
y posterior integracin en el genoma vegetal, asistido por protenas celulares del
hospedero como VIP1 que interacta especficamente con VirE2 por lo que elevados
niveles de VIP1 en el hospedero lo hacen ms susceptible a la transformacin con
Agrobacterium.
Plsmido Ti Plsmido inductor de tumor

T-DNA: es un fragmento del plsmido que es transferido de A. tumefaciens a las clulas

de la propia planta. Por lo tanto, todos los genes que se encuentren en esta zona van a
formar parte del genoma de las clulas vegetales infectadas. En esta regin encontramos
genes que promueven la divisin celular (provocando la aparicin de tumores en plantas)
y genes de sntesis de opinas (biomolculas utilizadas como alimento
por Agrobacterium).

Regin de virulencia: tiene los genes que van a intervenir en el proceso de infeccin de
la planta y de transferencia de la regin T-DNA hacia la clula vegetal (estos genes, por
ejemplo, contienen la informacin para hacer protenas que crean un canal de la bacteria
hasta la clula de la planta, como si fuera una jeringuilla). La regin vir que est
constituida por distintos genes de virulencia (hasta 25 descritos); dos de ellos (virA y
virG), de expresin constitutiva y necesaria para la activacin transcripcional de otros
genes como virB, virC, virD y virE.

TCNICA DE TRANSFORMACIN MEDIADO POR A. tumefaciens

El sistema de transformacin por A tumefaciens requiere de un vector desarmado, es
decir aquel vector al que se le ha removido algunos o todos los genes bacterianos del
ADN-T ya que slo las secuencias borde del ADN-T son requeridas para que la
transferencia se lleve a cabo, puediendo transformar clulas vegetales sin los sntomas
generales de la infeccin bacteriana.
1. Construccin de un plsmido con el gen de inters

Para ello, primero los cientficos trabajan con el plsmido Ti, en el cual
reemplazan la secuencia original de ADN-T que porta los genes responsables de
la formacin de tumores y los genes de sntesis de opinas, por otra secuencia nueva
con el gen de inters y algn gen de seleccin (de antibiticos o herbicidas).

2. Introduccin del plsmido en Agrobacterium

El plsmido obtenido llevando el transgn (sin las secuencias patognicas), se

transfiere a clulas de Agrobacterium. As, la bacteria portando el nuevo plsmido
es utilizada para transformar clulas vegetales.

En la transferencia de genes, a travs del sistema A. tumefaciens, se emplean dos

tipos de vectores:
Vectores Cointegrados. Los vectores co-integrados resultan de la integracin de
un plsmido forneo pequeo al plsmido TI de la cepa desarmada
de Agrobacterium , mediante un proceso de recombinacin. Estos vectores, se
obtienen a partir de un plsmido Ti desarmado, que contiene el borde izquierdo y
el plsmido forneo, que contiene el gen de inters flanqueado por el borde
 derecho y una regin homloga al borde izquierdo; la recombinacin se lleva a
cabo por un evento de entrecruzamiento de regiones homlogas de los dos
plsmidos, dando como resultado un solo plsmido.

Vectores Binarios. Los vectores binarios (sistemas en trans) es la estrategia ms

empleada. Estos vectores, se derivan de plsmidos que se replican en E. coli y
en A. tumefaciens, no necesitan integrarse al plsmido Ti y se mantienen como
plsmidos independientes, dentro de la clula bacteriana. Esta estrategia consiste
en el uso de dos plsmidos en la bacteria, uno de ellos, el vector binario, contiene
los bordes del T-DNA en el que se incluye el casete de expresin o genes de inters
y, el otro, el plsmido residente es el que contiene los genes "Vir", que son los
encargados de mediar la transferencia efectiva del casette de expresin hacia las
clulas vegetales.
Todos los pasos de clonaje se realizan en E. coli antes de que el vector sea
introducido en A. tumefaciens. A. tumefaciens presenta un plsmido Ti con el set
completo de genes vir pero no consta de T-DNA. As el plsmido Ti defectivo
sintetiza lo genes vir que permiten la transferencia del T-DNA del vector binario.
Se tratara de un vector binario que contiene el gen de inters y el gen marcador
seleccionable entre los bordes del T-DNA y un plsmido Ti llamado ayudante que
contiene los genes vir necesarios para que la transferencia al genoma vegetal
tenga. Este es el sistema que ms se utiliza actualmente.

3. Incorporacin del gen de inters dentro del cromosoma vegetal

La transformacin, mediada por Agrobacterium , requiere de un periodo de co-
cultivo, en el cual, la cepa de Agrobacterium , que contiene el vector con los genes de
inters, es puesta en contacto con el tejido vegetal a transformar, para que se realice
la transferencia de T-DNA a algunas de las clulas vegetales expuestas a la infeccin,
los tejidos utilizados suelen ser de fcil manipulacin y regeneracin y deben
presentar heridas. Acetosiringona
4. Regeneracin y seleccin de plntulas transformadas
Despus del co-cultivo, el tejido vegetal es transferido a un medio de cultivo que
propicie la regeneracin, por lo que se le adiciona hormonas vegetales o reguladores
de crecimiento al medio de cultivo, as como antibiticos, que permita la eliminacin
de Agrobacterium , debido a que no es requerido ms, puesto que el proceso de
transformacin ya se llev a cabo.. Luego de la transformacin, el tejido vegetal es
cultivado in vitro en un medio con un agente selector (antibiticos o herbicidas) donde
slo las clulas transgnicas sobreviven.
VENTAJAS Y DESVENTAJAS

Entre las ventajas estn: simplicidad tcnica de los protocolos; no requiere de equipos
sofisticados; pueden ser empleados diferentes tipos de tejidos vegetales; la integracin
del T-DNA es un proceso relativamente preciso; la regin de DNA a ser transferido es
definida; baja probabilidad de rearreglos; permite la introduccin de segmentos largos de
DNA; bajo nmero de copias del T-DNA transferido.

Entre las desventajas del sistema de Agrobacterium, se han reportado: el tejido a infectar
debe presentar dao fsico; los vectores estn diseado solo para infectar el ncleo; se
requiere la eliminacin de la bacteria de los tejidos infectados mediante el uso de
antibitico; el rango de hospederos est limitado a que estos sean susceptibles a la
infeccin; sin embargo, muchas de estas deficiencias han sido superadas con la
implementacin de nuevas tcnicas y procedimientos .

REFERENCIAS
VALDERRAMA AF; ARANGO R and AFANADOR LK. Transformacin de plantas
mediada por Agrobacterium: "Ingeniera gentica natural
aplicada".Rev.Fac.Nal.Agr.Medelln.2005; 58(1):.2569-2585.