PRCTICA N5

EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA EN PRODUCTOS

ALIMENTARIOS

1. INTRODUCCIN

Las enzimas son de gran importancia para el funcionamiento del metabolismo

de un organismo. Estas son encargadas de acelerar o de contribuir de una u otra forma

en las reacciones qumicas como desdoblar molculas ms grandes. Al realizar la

prctica se comprueba cmo se inhibe el funcionamiento de la enzima. Adems de

esto, se evidencia como el tiempo que se demora una reaccin puede mejorar la

calidad y el desarrollo de la misma, ya que al ver si una enzima tiene ms tiempo para

actuar, tendr un mejor desempeo en su labor como catalizador. Por otra parte, la

concentracin de la enzima tambin afecta el producto final de la reaccin, ya que

puede ser directa o inversamente proporcional a la velocidad de la misma. Finalmente

se concluye que las enzimas tienen una actividad que se puede ver afectada por

diferentes factores tales como la temperatura, la concentracin de la enzima y el

tiempo de accin de la misma.

2. OBJETIVOS

- Evaluar y controlar la actividad enzimtica responsable del pardeamiento en los

alimentos.

- Determinar las condiciones que afectan la velocidad de pardeamiento enzimtico.

Una vez determinados estas condiciones, proyectar tratamientos que controlen el

oscurecimiento de la muestra a bajo costo y sin producir efectos secundarios

indeseables (como por ejemplo la destruccin del aroma, textura o el uso de

sustancias toxicas para el organismo).

3. MARCO TERICO

Las enzimas son protenas que funcionan como catalizadores bilgicos. Cada

clula y cada tejido tienen su actividad propia, lo que comporta continuos cambios en

su estado bioqumico, en la base de la cual estn las enzimas, que tienen el poder de

catalizar, facilitar, y agilizar determinados procesos sintticos y analticos. Los

propios genes son reguladores de la produccin de las enzimas; por tanto, genes y

enzimas pueden considerados como las unidades fundamentales de la vida.

Por otro lado, las enzimas se clasifican de acuerdo a su complejidad las cuales

pueden simples las cuales estn formadas por una o ms cadenas polipeptdicas o

conjugadas que contiene un grupo no proteico enlazado a la cadena polipeptdica

estando conformada por la apoenzima que es la parte polipeptdica de la enzima y el

cofactor que es la parte no proteica y la unin de estos dos ltimos forman la

holoenzima. (Kimball, 1986).

Las enzimas poseen varias caractersticas en este aspecto tiene una gran

influencia los factores externos que permiten que se den. Las enzimas se inactivan por

el calor esto sucede ya que por ser protenas pueden desnaturalizarse completamente

si se someten a temperaturas altas, otra de las caractersticas es que las enzimas

funcionan ms eficientemente, a ciertas temperaturas optimas, es decir, a ciertas

temperaturas las enzimas realizan una actividad catalizadora, de tal manera que

permiten la continuacin de la reaccin catalizada a la mayor velocidad. A

temperaturas por encima o por debajo de la temperatura ptima para la actividad de

la enzima esta disminuye o se detiene. De esta manera la enzima trabaja con mayor

eficiencia a una temperatura de 37C (Baker, 1972).

Cada enzima funciona de una manera ms efectiva a cierta temperatura y pH

y, como consecuencia, su actividad disminuye cuando alcanza valores por encima o

por debajo de dichos puntos. Los enlaces de hidrogeno son fcilmente destruidos por

el aumento de la temperatura lo cual, a su vez, puede perjudicar la estructura terciaria

de la enzima que son de gran importancia para la unin con el sustrato. Los cambios

de pH alteran el estado de ionizacin de los aminocidos con carga elctrica.

De esta manera las enzimas adems de que necesitan ciertas condiciones

ambientales, como la temperatura adecuada, el pH, de la concentracin de la enzima

que aumenta la velocidad enzimtica hacia cierto lmite, la concentracin del sustrato

se obtiene la velocidad mxima. Tambin necesitan de la presencia de otras ciertas

sustancias antes de poder actuar; un ejemplo claro es la amilasa salivar solo podr

actuar sobre la amilasa si estn presentes iones de cloro (Kimball, 1986).

Por ltimo, las enzimas son de gran importancia es todos los aspectos de los

organismos vivos pues nos dan la facilidad de acelerar o facilitar las reacciones que

se producen en el interior del organismo y teniendo grandes propiedades como el ser

reutilizable. Las enzimas ayudan a funciones de nuestro organismo como: favorecen

la digestin y absorcin de los nutrientes, efecto antiinflamatorio, reduce el dao que

produce las toxinas, favorece la fertilidad, entre otras.

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

El pH: Todas las enzimas tienen en su estructura primaria aminocidos

con grupos radicales ionizables. Dependiendo del pH del medio en el que se

encuentren pueden no tener carga, o por el contrario estar cargados, bien

positiva o negativamente. Estas cargas sirven para estabilizar la conformacin

natural de la protena y cuando el pH las cambia, tambin se modifica la

estructura, llevando en ltimo extremo a la desnaturalizacin de la protena, y

en el caso de las enzimas a la prdida de actividad.

 Dependiendo del medio dnde deba ejercer su accin cataltica, cada

enzima tendr su conformacin ms adecuada, y por lo tanto su mxima

actividad, alrededor de un valor concreto de pH, que recibe el nombre de pH

ptimo. El cambio, bien sea hacia valores ms altos o ms bajos provocar una

disminucin de la actividad.

En el caso de la pepsina gstrica, una enzima digestiva, su pH ptimo

est alrededor de 2 ya que el medio estomacal es un medio de gran acidez;

mientras que otra enzima digestiva como la tripsina, cuyo lugar de accin

cataltica es el intestino delgado, presenta su pH ptimo aproximadamente a

8.

La mayor parte de las enzimas son muy sensibles a las variaciones de

pH, con algunas excepciones, como es el caso de la amilasa salival, capaces

de mantener la actividad en un amplio rango de valores de pH. Esta adaptacin

garantiza su funcionamiento independientemente del valor del pH del

alimento ingerido.

El medio interno de los seres vivos est siempre tamponado, lo cual

hace que los pH fisiolgicos de las soluciones corporales varen poco, el

plasma sanguneo presenta valores prximos a la neutralidad (7,4), y la

desviacin de unas pocas dcimas provoca alteraciones muy graves. Tan slo

existen algunas zonas del organismo que se mueven en valores muy alejados

de la neutralidad, como el caso descrito de las soluciones digestivas; o, ya en

el interior celular los lisosomas, que contienen enzimas cuyo pH ptimo se

encuentra en valores muy cidos.

La temperatura: Este factor presenta dos efectos contrapuestos, por

un lado, el aumento de temperatura produce, de forma general, un aumento en

 la velocidad de cualquier reaccin qumica; pero, por otro lado, las enzimas

experimenta desnaturalizacin y prdida de actividad al superar una

determinada temperatura. En este caso resulta ms difcil determinar como en

el pH una temperatura ptima, y las curvas de actividad presentan un

incremento inicial de actividad ms pronunciado para posteriormente al irse

desnaturalizando, decrecer la velocidad de reaccin. Se denomina

pardeamiento enzimtico a la transformacin enzimtica en sus primeras

etapas de compuestos fenlicos en polmeros oxidativos, frecuentemente

pardos o negros. Es muy comn en fruta y vegetales (manzanas, pltanos,

palta, berenjenas, etc.) que han sufrido daos fsicos y/o exponen su tejido

interno al aire y la luz. Frecuentemente es considerado como perjudicial (con

excepciones) y debe tratarse de controlarse. (Merino y Noriega)

El oscurecimiento del tejido se debe a la oxidacin enzimtica de los fenoles

oligoquinasas, que a su vez polimerizan rpidamente para formar pigmentos pardos

o melaninas, el oxgeno acta como receptos de hidrgeno.

Para que esta reaccin ocurra deben estar presente tres factores:

(1) Sustrato fenlicos adecuados

(2) Feniloxidasas activas

(3) Oxigeno

La enzima que cataliza esta oxidacin es una oxido reductasa que oxida el

fenol, se conoce como fenol asa, polifenol oxidasa, tirosina. Contiene cobre como

grupos prosttico, por tanto, su actividad se pone de manifiesto cuando est presente

oxgeno y cobre. Carece de un pH ptimo definido, pero, en general se activa entre

pH 5 y 7.
 Existen numerosos mtodos para prevenir el pardeamiento enzimtico, sin

embargo, en la prctica para el control de este solo se utilizan algunos de ellos que se

fundamentan.

a. La inactivacin de la enzima (blanqueo, uso de inhibidores)

b. La eliminacin o minimizacin del contacto con el oxgeno

c. La creacin de condiciones desfavorable para la actividad enzimtica

(descenso del pH, reduccin de la Aw)

d. El tratamiento con antioxidantes (Ac. Ascrbico, Dixido de azufre, entre

otros)

Para la eleccin de mtodos adecuado a ser utilizado hay que tener en cuenta:

el grado de toxicidad, los efectos que pueden ser desfavorables para la calidad del

producto, las reglamentaciones existentes y los costos.

Reacciones qumicas y bioqumicas

Muchas reacciones dan lugar al deterioro de la calidad del alimento o de su

inocuidad.

Tabla 1: Reacciones qumicas y bioqumicas que llevan al deterioro de la calidad o

seguridad alimentaria.

Tipo de reaccin Ejemplos

Pardeamiento no enzimtico Alimentos horneados

Pardeamiento enzimtico Frutas cortadas o golpeadas

Oxidacin Lpidos, degradacin de vitaminas,

decoloracin de pigmentos, protenas

Hidrolisis Lpidos, protenas, vitaminas,

carbohidratos
 Interacciones con metales Formacin de complejos, oxidacin

cataltica

Ciclacin de lpidos cidos grasos mono cclicos

Desnaturalizacin proteica Coagulacin de la clara de huevo,

inactivacin enzimtica

Fuente: Libro (Qumica de los alimentos Fenema)

En cada reaccin puede estar implicados distintos reaccionantes o sustratos,

dependiendo del alimento especfico y de las condiciones particulares de manipulacin,

procesado y almacenamiento. Se estudian, como reacciones tipo, porque en todos los

alimentos los reaccionantes o sustratos tienen la misma naturaleza general.

As, el pardeamiento no enzimtico implica reacciones de los compuestos

carbonilos, que pueden derivar de los azcares reductores existentes o de diversas

reacciones previas, como la oxidacin del cido ascrbico, la hidrlisis del almidn o la

oxidacin de los lpidos

Tabla N2: clasificacin de los cambios perjudiciales que aparecen en los alimentos

durante su manipulacin, procesado y almacenamiento.

Atributo Alteracin

Textura Prdida de solubilidad

- Perdida de la capacidad de

retencin de agua

- Endurecimiento

- Ablandamiento

Sabor Desarrollo de

- Rancidez

- Flavor a cocinado o a caramelo

 - Otros flavores extraos

- Flavores agradables

Color Oscurecimiento

- Empalidecimiento

- Desarrollo de otros colores

extraos

- Desarrollo de colores agradables

Valor nutritivo Perdida de degradacin y alteracin de la

biodisponibilidad de protenas, lpidos,

vitaminas y minerales

Seguridad Desarrollo de sustancias txicas

- Produccin de sustancias

protectoras de la salud

- Inactivacin de sustancias txicas

Fuente: Libro (Qumica de los alimentos Fenema)

PARDEAMIENTO ENZIMTICO

Cuando pelamos y/o troceamos frutas como la manzana o la pera,

observamos que su superficie se tie enseguida de un color marrn cada vez ms

oscuro. Este fenmeno se debe a unas enzimas protenas que ejecutan reacciones

qumicas llamadas polifenol oxidasas.

Las polifenol-oxidasas de las frutas oxidan ciertos fenoles introduciendo

tomos de oxgeno en su composicin. De esta manera los transforman en

quinonas, las cuales se polimerizan dando lugar a pigmentos marrones, rojos y

negros. En frutas ntegras, las polifenol oxidasas y los fenoles estn en

compartimentos celulares separados (en cloroplastos,

otros plsticos y citoplasma las primeras, y en vesculas los segundos) por lo que

su color no se ve alterado.

Cuando las frutas estn sobre maduradas o son sometidas a cortes u otras

agresiones, las membranas de los compartimentos celulares se destruyen. Ello

permite que las polifenol oxidasas contacten con los fenoles y con el oxgeno

atmosfrico. La conjuncin de estos tres elementos conduce a la formacin de las

quinonas y a la posterior aparicin de los mencionados pigmentos. El resultado es

lo que se denomina pardeamiento enzimtico.

Este oscurecimiento acarrea importantes prdidas postcosecha en

vegetales (como las peras, las manzanas, los melocotones, los pltanos, las

lechugas, etc.) y hongos (como los championes).

Es por ello por lo que se han desarrollado diversos mtodos para combatirlo:

Evitar el contacto del oxgeno atmosfrico con la superficie:

a. El efecto protector se aprecia preparando una simple gelatina con

pedazos de manzana. Los trozos inmersos en el gel no se pardearn,

ya que ste impide el paso del oxgeno.

Disminuir la temperatura:

a. Cuando sta baja lo suficiente, la accin de las polifenol-oxidasas se

frena, llegando a detenerse por completo a temperaturas de

congelacin.

Reducir el pH:

a. Las polifenoloxidasas tienen un pH ptimo de actuacin en torno a 5-

6.

b. A partir de ste, la accin oxidante se retarda segn acidificamos el

medio, hasta alcanzar un punto en el cual las enzimas se desnaturalizan

 (se descompone la configuracin espacial) de manera irreversible,

perdiendo su funcionalidad. El efecto del pH se observa fcilmente

comparando el pardeamiento de un trozo de manzana cubierto con

vinagre rico en cido actico con otro carente de dicho recubrimiento.

Aumentar la temperatura:

a. En aquellos casos en los que no se dae el alimento, cabe la posibilidad

de incrementar la temperatura hasta desnaturalizar las

polifenoloxidasas. Por ejemplo, mediante un tratamiento de escaldado

a vapor.

El pardeamiento enzimtico se produce cuando se corta el tejido vegetal, lo

cual produce ruptura celular y liberacin de la enzima polifenoloxidasa, la cual

cataliza la reaccin entre el oxgeno y las molculas libres de polifenoles, causando

el pardeamiento del tejido (Bretch, 1995; Wiley, 1997; Hiwasa et al., 2003;

Changwen et al., 2009). El pardeamiento enzimtico consiste en la oxidacin de

substratos fenlicos a O-quinonas, molculas muy reactivas que condensan

rpidamente combinndose con otros grupos amino o sulfhidrilo de las protenas y

con azcares reductores, dando lugar a polmeros pardos, rojizos o negros, de alto

peso molecular y estructura desconocida (Prez, 2003; He y Luo, 2007).

La alta actividad de agua en las frutas es una de las causas principales de su

corta vida til, en un banano maduro se tiene que el contenido de agua es alrededor

del 75% de su masa (Robinson y Galn, 2010), en el secado o deshidratacin se

reduce el contenido de agua de los alimentos al adicionar energa como calor o un

agente absorbente o adsorbente, previniendo as reacciones bioqumicas o

microbiolgicas (Fernndez et al., 2015).

 La enzima peroxidasa (POD) es indicadora del deterioro de calidad (prdida

de sabor y reacciones de biodegradacin) y est relacionada con el pardeamiento

enzimtico, puesto que los difenoles pueden funcionar como sustrato reductor en una

reaccin de esta enzima, promoviendo el pardeamiento de la fruta o vegetal durante

su procesamiento y preservacin (Jang y Moon, 2011).

El pardeamiento enzimtico es considerado uno de los principales causantes

del deterioro de las frutas en la poscosecha, junto con la degradacin de pigmentos y

la actividad de POD (Falguera et al., 2012). Adems, el proceso de pardeamiento

afecta la calidad nutricional y la apariencia, reduciendo la aceptabilidad del

consumidor, ocasionando un significativo impacto econmico negativo sobre

productores de alimentos e industrias procesadoras de alimentos (Queiroz et al.,

2008).

4. MATERIALES Y MTODOS

MATERIALES Y REACTIVOS

o Muestra: Manzana, papa y pltanos.

Materiales:

o Vasos de precipitado 250 ml

o Placas o vidrio de reloj

o Termmetro

o Bao mara

o Tubos de ensayo

o Pipetas graduadas

o Cronometro

o Tabla de picar
Reactivos

o Agua destilada ablanda de pH distintos

o Solucin de Ac. Ascrbico al 1%

o Solucin de bisulfito de Na al 0,6%

o Solucin de Ac. Ctrico 1%

o Solucin de fenol al 1%

MTODOS

A. Efecto de pH sobre el pardeamiento enzimtico

o Preparar 100 ml de soluciones de diferente pH, incorporar rodajas de papa

y evaluar el tiempo que demora en pardearse la superficie de la papa.

Figura 1. Resultados de aplicar una solucin de zumo de limn a cada muestra

B. Inactivacin trmica del pardeamiento enzimtico

o Llevar diez rodajas de papa a un vaso con agua a 100C. Retirar cada 30

seg. Una rodaja y evaluar aquel tiempo en el que no se produce

pardeamiento. Dicho tiempo corresponder al tiempo de inactivacin

trmica a 100C. Repetir la prueba con cada una de las muestras.

Figura 2. Muestras en inactivacin trmica de enzimas.

Figura 3. Resultados de inactivacin trmica de enzimas.

C. Efectos de aditivos inhibidores de pardeamiento enzimtico

o Llevar diez rodajas de papa, manzana o pltano a soluciones diferente de

Bisulfito de Na (0,6%), Ac. Ctrico al 1% y Ac. Ascrbico al 1%, retira

cada 30 seg y evaluar el tiempo de inversin donde no se produce

pigmentacin alguna. En cada prueba deber tener como referencia un

testigo.

Figura 4. Soluciones de Fenolftalena 1%, Bisulfito de sodio y Ac. ctrico

1%, de izquierda a derecha, respectivamente.

Figura 5. Resultados de inmersin en aditivos inhibidores.

5. RESULTADOS

A. Efecto de pH sobre el pardeamiento enzimtico

o Se realiz en muestra de papa, se le adiciono jugo de limn con un pH de

2, con diferentes concentraciones de 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 ml en cada

muestra excepto el patrn.

o En ninguna muestra de papa se observ pardeamiento enzimtico

B. Inactivacin trmica del pardeamiento enzimtico

o Se coloc diez rodajas de papa y pltano, en agua a 100C

o Luego de 4 minutos, se observa que la muestra patrn y las muestras

octava y novena mantienen el color, mientras las dems se observan signos

de pardeamiento.

C. Efectos de aditivos inhibidores de pardeamiento enzimtico

o Se sumergi diez trozos pequeos de papa, pltano y manzana en

soluciones de fenolftalena con un pH de 6 donde se encontraba la

manzana, bisulfito de sodio con un pH de 6 donde se encontraba la papa y

cido ctrico con un pH de 2 donde se encontraba el pltano.

o Se not que en todos los casos se inhibi la actividad enzimtica ya que

no se evidenciaron signos de pardeamiento.

6. DISCUSIONES

- Segn (Bretch, 1995; Wiley, 1997; Hiwasa et al., 2003; Changwen et al., 2009).

El pardeamiento enzimtico se produce cuando se corta el tejido vegetal, lo cual

produce ruptura celular y liberacin de la enzima polifenoloxidasa, la cual cataliza

la reaccin entre el oxgeno y las molculas libres de polifenoles, causando el

pardeamiento del tejido. Es decir, el pardeamiento es provocado por la presencia

de polifenol oxidasa, oxgeno y compuestos fenlicos, que forman compuestos

 incoloros llamados quinonas que reaccionan formando un color pardo . lo que nos

indica que en la papa amarilis, manzana royal y pltano de seda hay presencia de

polifenol oxidasa.

- Segn (Merino y Noriega) Todas las enzimas tienen en su estructura primaria

aminocidos con grupos radicales ionizables. Dependiendo del pH del medio en

el que se encuentren pueden no tener carga, o por el contrario estar cargados, bien

positiva o negativamente. Estas cargas sirven para estabilizar la conformacin

natural de la protena y cuando el pH las cambia, tambin se modifica la

estructura, llevando en ltimo extremo a la desnaturalizacin de la protena, y en

el caso de las enzimas a la prdida de actividad. En el efecto de pH sobre el

pardeamiento, la muestra patrn se vio afectada por no contener zumo de limn a

diferentes concentraciones como las otras muestras que no se vieron afectadas.

- Segn (Baker, 1972). Las enzimas se inactivan por el calor esto sucede ya que

por ser protenas pueden desnaturalizarse completamente si se someten a

temperaturas altas, otra de las caractersticas es que las enzimas funcionan ms

eficientemente, a ciertas temperaturas optimas, es decir, a ciertas temperaturas las

enzimas realizan una actividad catalizadora, de tal manera que permiten la

continuacin de la reaccin catalizada a la mayor velocidad. A temperaturas por

encima o por debajo de la temperatura ptima para la actividad de la enzima esta

disminuye o se detiene. De esta manera la enzima trabaja con mayor eficiencia a

una temperatura de 37C . En la inactivacin trmica de pardeamiento, vemos que

en la muestra patrn y las ultimas muestras de mayor tiempo sumergidas en el

agua no muestran pardeamiento que las primeras muestras si muestran

pardeamiento, ya que ms tiempo nos ayuda a inactivar enzimas, y la muestra

 patrn no se oxida debido a que no hay mucha circulacin de aire dentro del

laboratorio por eso se conserva.

- Orrego, C. et al.,2016 menciona que se han desarrollado e implementado

numerosas tcnicas para inhibir el pardeamiento enzimtico, desde la adicin de

sulfitos o diferentes cidos hasta tratamientos trmicos, encontrando que la

mayora de estas tcnicas conlleva modificaciones de sabor no deseados o prdida

de vitaminas y micronutrientes. Por ello los aditivos inhibidores utilizados en esta

prctica tienen un efecto positivo al inactivar enzimas pero quitan al alimentos

propiedades y caractersticas esenciales.

7. CONCLUSIONES

- Se logr evaluar los diferentes mtodos para evitar la actividad enzimtica en las

muestras de papa, manzana y pltano.

- Se concluye que el escaldado tambin puede acelerar el proceso de pardeamiento

si se le dan tiempos cortos de tratamiento al producto.

- Se concluye que el zumo de limn es un cido fuerte, y que afecta el sabor del

alimento.

- Se concluye que los aditivos inhibidores son eficaces para inactivar enzimas, el

bisulfito de sodio no afecta mucho las caractersticas del producto.

- Se concluye que una manipulacin excesiva daa tejidos del producto y causa una

aceleracin del proceso de pardeamiento enzimtico.

8. REFERENCIAS

- Fenema, O. (2000) Qumica de los alimentos Ed. Acribia Zaragoza- Espaa

- Kimball, John. (1986). Biologa. Editorial: Addison - Wesley Iberoamericana, S.

A. Cuarta Edicin.

- Baker, J. y Allen, G. (1972) Materia, Energa y Vida. Editorial: Fondo Educativo

Interamericano S.A.

- Brecht, J. 1995. Physiology of lightly processed fruit vegetables. HortScience 30:

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- Changwen, L.; V. Cureatz and P. Toivonen. 2009. Improved quality retention

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release technology. Postharvest Biology and Technology 51: 378-383.

- He, Q. and Luo, Y. 2007. Enzymatic browning and its control in fresh-cut

produce. Stewart Postharvest Review 6:1-7.

- Hiwasa, K., Kinugasa, Y., Amano, S., Hashimoto, A., Nakano, R., A. Inaba,

and Y. Kubo. 2003. Ethylene is required for both the initiation and progression

of softening in pear (Pyrus communis L.) fruit. Journal of Experimental Botany

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- Prez, L. 2003. Aplicacin de mtodos combinados para el control del desarrollo

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procesada. Tesis Doctoral. Universidad Politcnica de Valencia, Departamento de

Tecnologa de Alimentos. Instituto de Ingeniera de Alimentos para el Desarrollo,

Valencia, Espaa. 256 p.

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Acribia. Zaragoza, Espaa. 360 p.

- Orrego, C., Vallejo, D., Manrique, D., Gonzlez, J. and Ocampo, J. 2016.

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trmico y ultrasnico. Disponible en: http://iicta.com.co/wp-

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- Merino, J. and Noriega, J. (s.f.). Fisiologa General. ENZIMAS. Universidad de

Cantabria. 13 p.