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PRIMEIRA EDIO
RIO DE JANEIRO
2008
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Ministrio da Sade
Ministro: Jos Gomes Temporo
Presidente
Paulo Marchiori Buss
SUMRIO
APRESENTAO
Esse Manual j deveria ter sido publicado desde julho de 2007, entretanto, diversos fatores
alheios vontade da CEUA e de seus membros fizeram com que isso no tivesse sido
possvel.
Preocupados com o respeito que temos para com todos os funcionrios que utilizam
animais de laboratrio em seus trabalhos e cientes da importncia deste em um tempo onde
as presses contrrias ao uso de animais se faz presente no dia-a-dia dos pesquisadores,
decidimos, antes de imprimi-lo em papel, disponibiliz-lo em nossa pgina. As crticas
construtivas sero muito bem recebidas. A base do Manual est agora lanada, e sua
construo ser continuada a partir das idias e necessidades dos usurios de animais.
Em breve, estaremos lanando a verso impressa, mas, a digital na pgina ser sempre
mantida, em funo do dinamismo com que evoluem a cincia de animais de laboratrio e a
biotica.
PREFCIO
A idia de escrever este Manual partiu no s da nossa observao quanto aos maiores
problemas encontrados durante a avaliao dos protocolos, como tambm pelos
questionamentos por parte dos proponentes que, nos perguntavam onde conseguir uma
tabela com os anestsicos ou qual a forma de eutansia que a CEUA/FIOCRUZ indicava.
Assim, sendo, sempre que for imprescindvel o uso de animais, entendemos que estes
devem ser tratados dentro da tica, de forma que sejam respeitados como seres vivos que
esto contribuindo para o progresso da cincia. Da mesma forma que seres humanos
tambm o fazem quando participam de um estudo clnico.
Da mesma forma, estamos cientes de que esse processo dinmico e, sempre que
houver atualizaes, estas estaro disponveis na pgina da CEUA at que uma nova
reviso do Manual seja publicada. Portanto, quando for necessrio, deve-se verificar
as possveis atualizaes on line deste manual.
No posso deixar de agradecer, tambm, o esforo de todos os membros atuais que, direta
ou indiretamente, participaram deste Manual atravs da redao dos captulos, reviso dos
mesmos, ou da participao em reunies onde discutamos quais os assuntos a serem
abordados ou a melhor forma de faz-lo. Quero agradecer, em especial, a Dra. Ftima
Conceio-Silva que trouxe para si o trabalho de reunir estes textos e dar a forma final
deste Manual.
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Cabe ressaltar que uma Comisso de tica no deve ser encarada como uma instncia
punitiva ou que deseja atrapalhar o andamento das pesquisas de uma Instituio e este
trabalho ratifica uma de suas misses: a de orientar os pesquisadores, acima de tudo.
Maio de 2008.
BREVE HISTRICO
A Comisso de tica no Uso de Animais da Fundao Oswaldo Cruz
(CEUA/FIOCRUZ) foi criada em 1999, atravs da Portaria da Presidncia n 099/99-PR, de
06/04/1999 com o objetivo de que toda e qualquer atividade que envolva o uso de animais
de laboratrio no mbito da FIOCRUZ deve ser previamente submetida anlise e
aprovao por esta Comisso.
b) com pendncia quando faltam dados que interferem no contedo tico, mas que
no impedem o entendimento do projeto como um todo. Exemplo: no consta o calibre da
agulha, no informada qual a via de sangria, no citada a condio de anestesia etc;
d) reprovado quando no cumpre com os preceitos ticos, quer seja por relevncia
cientfica que caracterize a necessidade do uso de animais, ou por no cumprimento de
pendncias.
6- Caso um protocolo seja reprovado, este poder ser reapresentado, com as modificaes
sugeridas, passando por todo o trmite de um protocolo novo.
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Com base nas dvidas mais freqentes ao preencher o protocolo, seguem algumas
indicaes de pontos que devem ser observados durante o preenchimento. preciso sempre
ter em mente que o protocolo um documento legal, e como tal, deve conter todas as
informaes relevantes para a compreenso dos detalhes de sua execuo.
9- No item base terica deve ser indicado todo o conhecimento prvio existente no
assunto a ser abordado que indiquem: o estado atual do conhecimento (teoria), a
propriedade da solicitao (justificativa) e os objetivos a serem alcanados; no item
plano de trabalho deve estar especificado de forma clara todas as etapas do
protocolo e da manipulao animal assim como o tempo de utilizao, e se for o
caso as formas de manuteno (condies de biotrio), captura, soltura e eutansia.
Devem tambm constar o nmero total de animais e a necessidade de repeties,
quando bem embasadas. Solicita-se ainda organizar um desenho esquemtico do
protocolo indicando quando e como os animais sero utilizados de forma a facilitar
a verificao da manipulao completa do animal durante a fase experimental.
10- A justificativa e o objetivo devem estar bem claros. Cabe ressaltar que a relevncia
cientfica do projeto est diretamente ligada aos aspectos ticos (uso desnecessrio
de animais), sendo, portanto avaliada durante o trmite do projeto. Por exemplo, a
repetio de experimento que seja consagrado na literatura sem justificativa
plausvel, fere a tica, uma vez que no acrescenta nenhuma contribuio ao
conhecimento cientfico;
12- Na descrio dos procedimentos, detalhar todos os pontos (mesmo que j tenham
sido mencionados no plano de trabalho). Informe dose, concentrao, via de
inculos, calibre de agulhas, volume de sangue a ser coletado, intervalo entre as
coletas, via, forma de imobilizao, tempo de imobilizao etc.;
15- A CEUA solicita que, sempre que possvel, as manipulaes dos animais sejam
organizadas em relao manipulao animal e no ao protocolo em si e que isto se
reflita no ndice e detalhamento dos procedimentos solicitado no formulrio
CEUA. Por exemplo, se determinado grupo de camundongos vai ser imunizado,
depois desafiado e observado por quatro semanas para verificao de resposta
imune (coleta de sangue e bao em grupos semanais), seguida de eutansia ao final,
este pode ser considerado um nico procedimento, j que o mesmo animal estar
sendo manipulado em todas estas fases. Evitar transformar este exemplo em 4
procedimentos (imunizao, desafio, coleta, eutansia). Se por questes prticas no
for possvel, indicar no local apropriado que os animais de um procedimento esto
sendo utilizados em outros procedimentos. Isto evita problemas na verificao do
nmero de animais necessrios para o protocolo;
17- Todo procedimento que envolver cirurgia ou quando forem utilizados animais no
convencionais deve ter um veterinrio responsvel inscrito no CRMV do local onde
os experimentos sero realizados (Rio de Janeiro; Minas Gerais; Bahia etc.);
18- Nenhuma das partes do protocolo deve ser deixada em branco. Quando no couber
resposta mencionar no se aplica;
19- Sempre mencionar, quando aplicvel, o desfecho (end-point) a ser utilizado para
evitar o sofrimento animal. Neste caso, descrever quais parmetros sero indicativos
de desfecho (exemplo: perda de peso superior a 20%, hiporresponsividade).
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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
CONSIDERAES GERAIS:
Obs.: O tempo de ao destes frmacos vai depender grande parte da dose utilizada, logo
para elaborar um protocolo adequado para determinado experimento, essencial sabermos
o tempo de durao e o grau de dor do procedimento realizado em determinada espcie. As
doses fornecidas nas tabelas servem como referncia, mas no devem ser
simplesmente aumentadas visando um tempo maior de anestesia. Nestes casos
imprescindvel a presena de um veterinrio. Com estas informaes possvel montar
um protocolo anestsico e analgsico para determinado experimento, porm sendo de suma
importncia a execuo do estudo piloto para adequarmos estas doses, se necessrio. Para
avaliarmos o protocolo analgsico necessrio conhecermos a espcie que estamos
trabalhando e como podemos avaliar a dor nesta espcie, pois nestes ltimos anos houve
grande evoluo nos mtodos de avaliao de dor nos animais.
Tiletamina + 20 mg.kg-1 IM
Zolazepam (Zoletil)
Propofol 7.5-10.0 mg.kg-1 IV bolus 8-11 min
44-45 mg.kg.hora-1 IV Infuso contnua
Halotano Sob consulta Sob consulta Sob consulta
Isoflurano Sob consulta Sob consulta Sob consulta
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Acepromazina 1% - 0,1mL / Kg / IM
Xilazina 0,2mL / Kg / IM
Cloridrato de Ketamina 50% - 0,5mL / Kg / IM
3- RATO E CAMUNDONGO
Tiopental 1g diluir 5% (20mL em 1g) 0,6mL / 100g para sangria (Para manter o animal
vivo usar 0,18mL / 100g)
CMDG 30g 0,2 mL intraperitoneal
Rato 400g 2,4 mL intraperitoneal
Ketamina 50% - Xilazina 2% (mistura em partes iguais) 0,1 a 0,2 mL / 100g, caso precise
prolongar, administrar metade da dose.
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
FLECKNELL, P. A. The relief of pain in laboratory animals. Laboratory Animal, 18: 147,
1984.
ANTGENOS
-Deve ser o mais purificado possvel contendo apenas os eptopos desejados, para produzir
anticorpos de maior especificidade.
-Deve ser livre de toxicidade para o animal (lipopolissacrides e resduos qumicos)
-Possuir pH fisiolgico, estar estril.
-Estar nas concentraes adequadas para no induzir tolerncia ou outro tipo de modulao
no desejada. Segundo alguns autores, a dose usual para uma protena solvel administrada
com adjuvante de Freund completo, depende da espcie animal:assim no caso de coelhos:
50-1000 g; camundongos: 10- 200 g; cabras e ovelhas 250 a 5000 g
ESPCIE ANIMAL
ADJUVANTES
Subcutnea.
Recomendado para usar com
adjuvantes oleosos para aproveitar
o efeito depsito. Processos
inflamatrios podem ser Absorve lentamente
visualizados.Usar com e sem
adjuvante.Usar em primo
inoculao e "boosters"
Distribua em mximo 4 pontos
REINOCULAES.
Estmulos antignicos repetidos permitem a estimulao dos linfcitos de memria
que produzem anticorpos de maior afinidade. Porm algumas precaues devem ser
observadas:
4. Injeo endovenosa em animal j imune pode provocar morte do animal por choque
(imunocomplexos circulantes).
Tabela 2
VOLUME MXIMO (mL) A SER INOCULADO EM ANIMAIS SEGUNDO O TIPO
DE ADJUVANTE UTILIZADO (adaptado de Leenaars, 2005).
Camundongo
Volume (mL) 0.1 XX 0.5 XX XX 1.0 0.2
Agulha 25x5 13x4,5 13x4,5 13x4,5
Ratos -
Volume (mL) - 0,2 XX 0.5-1.0 XX XX 5.0 0.5
Agulha - 25x5 13x4,5 25x5 13x4,5
Cobaias
Volume (mL) 0.2 XX 1.0 XX XX 5.0-10 0.5-1.0
Agulha 25x5 13x4,5 25x5 13x4,5
Coelhos
Volume (mL) 0,1- 0.025- 1.5 0.05 0.2- 10-20 1.5
Agulha 0,25 0.05 13x4,5 13x4,5 0.5 25x7 13x4,5
13x4,5 25x5 25x7
Ovelhas,
cabras 0.5 0.05 - 2.0 0.05 0.2.0 XX 30
Volume (mL) 13x4,5 0,25 13x4,5 13x4,5 25x8 40x12
Agulha 25x5
Bezerros
Volume (mL) 0.5 0.05 2.0 0.05 2.0 XX No
Agulha 13x4,5 25x5 13x4,5 13x4,5 25x8 testado
Aves
Volume (mL) 0.25 0.05 0.5 0.05 1.0 XX 0.5
Agulha 13x4,5 13x4,5 13x4,5 13x4,5 25x8 25x7
XX no
recomendado
Bibliografia principal
Canadian Council on Animal Care- Guidelines on: Antibody production
http://www.ccac.ca.(consultado em Maio de 2006)
Leenaars M. ;Henrdriksen CFM 2005- Critical steps in the production of polyclonal
and Monoclonal Antibodies: Evaluation and recommendations .ILAR Journal
46(3):269-279.
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SANGRIA
INTRODUO
Diversos estudos necessitam que seja realizada a coleta de sangue para verificar
alteraes hematolgicas ou outros parmetros necessrios ao entendimento, avaliao e
concluso da pesquisa.
SANGRIA VENOSA
Volumes at 0,1 mL
Deve-se puncionar uma veia superficial. Em geral, no necessita anestesia, uma vez
que esta submeteria o animal a um estresse maior do que o causado pelo uso de uma
agulha, por exemplo.
Em geral, pequenos animais podem ser sangrados pela veia caudal (coccgea).
Camundongos, ao contrrio dos ratos, podem ter a extremidade da cauda amputada para
coleta de sangue, uma vez que no oferece risco de eliminao de vrtebra. Recomenda-se
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o corte na cauda, no mximo, duas vezes. Como alternativa, pode-se retirar o tampo
cicatricial para nova coleta.
Pequenos animais sem cauda (cobaias e hamsters) podem ter o sangue coletado pela
veia jugular ou da orelha, sendo que esta ltima necessita de grande habilidade. Em animais
grandes podem-se usar veias superficiais.
Deve-se ter especial ateno ao calibre da agulha, pois, um calibre pequeno pode
provocar coagulao e um calibre maior pode danificar o vaso. Em alguns casos, a
dilatao do vaso por obstruo suave ou aquecimento poder facilitar a coleta.
CONSIDERAES GERAIS
3) A puno cardaca dever sempre ser realizada sob anestesia. Quando se aplica este
procedimento com fim terminal, dever se assegurar o bito ps-exsanginao pela
administrao de uma sobredose de anestsico. A puno cardaca repetida no
recomendada, mas, se necessria, dever ser cuidadosamente justificada em funo
de seus efeitos adversos. Neste caso, dever se dar preferncia canulao de longa
durao.
TABELA 1 PRINCIPAIS VIAS DE COLETA DE SANGUE EM ANIMAIS CONVENCIONAIS E NO CONVENCIONAIS
EM EXPERIMENTAO.
Veia Veia / Veia
Veia Veia Marginal Veia Puno Veia Seio Artria Corte na da
Cava Ceflica da Orelha Femoral Cardaca Jugular Orbital Caudal Cauda Asa
Rato X X X X X
Camundongos X X X X
Cobaia X X X X
Coelho X X
Hamster X X X X
PNH X X
Co X X X
Gato X X X
Aves X X X
Gamb X X
Bovinos X X
Pq. Ruminantes X X
Furo X X X X
Gerbil X X X
Porco X X
Peixes X X
R X
Serpentes X
Tartaruga X X
Adaptado de Manual sobre al cuidado y uso de los animales de experimentacin, do Conselho Canadense de Proteo aos
Animais.
TABELA 2 VOLUME DE SANGUE CIRCULANTE EM ANIMAIS
CONVENCIONAIS E NO CONVENCIONAIS ADULTOS, SADIOS E
ALIMENTAO ADEQUADA.
mL/kg
Gato 47-66
Gado 60
Frango 60
Co 79-90
Furo 75
Gerbil 67
Cabra 70
Cobaia 67-92
Hamster 78
Cavalo 75
Camundongo 78-80
Porcos 65
PNH* 54
Coelho 44-70
Rato 50-70
Ovelha 60
*PNH - primatas no humanos
REFERNCIAS
Morton DB, Abbot D, Barclay R, Close BS, Ewbank R, Gask D, Heath M, Mattic S, Poole
T, Seamer J, Southee J, Thompson A, Trussel B, West C, Jennings M. (1993) Removal of
blood from laboratory mammals and birds. Laboratory Animals 27:1-22.
Canadian Council On Animal Care (1998). Manual sobre el cuidado y uso de los animales
de experimentacin. v.1 Extrado de:
http://www.ccac.ca/en/CCAC_Programs/Guidelines_Policies/GUIDES/SPANISH/toc_v1.h
tm
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EUTANSIA
PRINCPIOS GERAIS
obteno de resultados e a segurana para o operador. Desta forma, apesar de ser possvel a
utilizao de um nmero variado de mtodos de eutansia, as condies gerais devem
sempre ser observadas. A seguir resumiremos alguns detalhes sobre os agentes qumicos
mais comumente empregados e cujas especificaes podem tambm ser encontradas no
captulo sobre analgesia / anestesia.
Para a eutansia de animais de pequeno porte considerados no convencionais (ver
classificao dos animais usados em experimentao constante neste manual) como ces,
gatos, alguns animais de sangue frio e primatas no humanos, o uso de sedao (xilazina /
quetamina / diazepnicos / acepromazina) seguida por superdosagem de derivados do cido
barbitrico como o pentobarbital e o tiopental so os mais indicados devido facilidade de
aplicao, aliada a ao rpida e grande eficcia. Quetamina isolada no deve ser usada
pela dificuldade de verificao do efeito de sobredose. A ao dos barbitricos se inicia por
uma depresso profunda e rpida dos centros respiratrios levando apnia seguida de
parada crdio respiratria. De forma geral a dose para a eutansia deve ser calculada com
base no peso do animal e situa-se entre trs a quatro vezes a normalmente empregada para
anestesia / sedao (para detalhes consulte captulo referente). A via de escolha a
endovenosa e, na impossibilidade desta pode-se usar a via intraperitoneal. A exceo so
animais aquticos que, dependendo do tamanho podem receber a droga diluda na gua em
que esto sendo mantidos.
Animais de porte maior como eqinos e candeos maiores tambm so sedados e a
seguir submetidos a uma superdosagem de barbitricos (tiopental sdico). Em alguns casos,
depois de obtida a anestesia pode-se acelerar o procedimento com a injeo de soluo
saturada de sulfato de magnsio \ cloreto de potssio, sempre resguardado o bem estar do
animal e a obteno dos resultados sem interferncia das drogas para eutansia.
No se recomenda a utilizao de anestsicos inalatrios como o halotano,
isofluorano devido a potencial capacidade de produzir acidentes nos profissionais
responsveis pela manipulao.
Um dos mtodos mais empregados a inalao de gases no anestsicos. Devido
periculosidade para o operador (hepatotoxicidade, cardiotoxicidade e/ou carcinognese) e
as reaes irritativas no animal o uso de ter e clorofrmio proibido. Em adio, o ter
inflamvel e explosivo podendo causar acidentes graves. Carcaas embebidas em ter no
podem ser incineradas ou autoclavadas sem haver eliminao prvia dos resduos.
Atualmente o CO2 o gs aceito como de melhor eficcia / rapidez para a eutansia
de animais de pequeno porte como camundongos e outros pequenos roedores. Animais
maiores como coelhos, podem ser eutanasiados com CO2 contanto que recebam pr
anestesia como xilazina / diazepan, midazolan, entre outros. A forma ideal de
administrao a utilizao de cmaras apropriadas com vlvulas para controle da entrada
de gs e com vedao eficiente. A administrao deve ser lenta para que o animal entre em
narcose antes da parada cardio respiratria. Fluxos muito intensos podem causar estresse
desnecessrio levando a agitao, eliminao de urina e fezes e outros sinais de
desconforto. Concentraes em torno de 40% no interior da cmara levam a sedao
seguida de anestesia e morte neste grupo. Outros animais como ces e gatos podem
necessitar de doses maiores (60%). Este tipo de eutansia tambm pode ser empregado para
outros animais desde que resguardas as particularidades de cada um. No esquecer que
animais recm natos podem ser resistentes a esta forma de eutansia. Animais que podem
viver em condies de anaerobiose relativa como peixes e anfbios so normalmente
resistentes a este processo. Estudos j publicados tm demonstrado no haver nenhuma
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repercusso de alterao de tecidos que contra indique sua utilizao na maioria dos
experimentos realizados em laboratrios de pesquisa.
Pssaros podem ser eutanasiados por inalao de CO (monxido de carbono)
comprimido em cilindros. No so aceitas outras formas de emisso de CO. Este agente
tambm no recomendado devido potencialidade de produo de acidentes.
Outra droga no permitida o cianeto de potssio, pois sua utilizao leva ao
aparecimento de convulses e contraturas antes da morte.
Lembramos que algumas drogas podem ser extremamente eficazes num grupo de
espcies e completamente contra indicadas em outras. Deve-se tomar especial ateno a
animais que foram previamente tratados com agentes paralisantes como o curare,
succinilcolina, sulfato de nicotina etc., pois neste caso a ausncia de reflexos ou mesmo a
depresso respiratria no necessariamente significam inconscincia e por isto o animal
pode estar sensvel a estmulos dolorosos sem, contudo conseguir promover reaes que
exteriorizem esta condio.
De forma resumida, a escolha do procedimento de eutansia deve levar em
considerao a espcie animal (tipo, idade, peso etc.), as condies experimentais e a
prtica do operador. De todos os mtodos aqui exemplificados os mais aceitos so a
inalao de CO2 e a superdosagem de barbitricos.
Ao submeter um projeto em cujo protocolo seja necessria a utilizao da eutansia,
o pesquisador deve fornecer todos os detalhes para que a eficincia, propriedade e
condies do procedimento possam ser avaliadas. Sempre que necessrio, os procedimentos
podero ser questionados e alternativas propostas. Os critrios para a utilizao de
eutansia na presena de efeitos adversos devem estar claramente explicitados (end
point).
Mesmo que no tendo sido infectado por nenhum agente patognico durante a
experimentao, os animais devem ser considerados como potencialmente infectados. De
forma geral, animais de pequeno porte devem ser autoclavados para posterior descarte em
lixo biolgico destinado incinerao. Animais de porte mdio e grande devem ser
enviados a fornos crematrios, devidamente embalados e identificados de acordo com as
normas de biossegurana existentes no Campus. Alternativamente, na impossibilidade de
uso de autoclave, os animais podem ser formolizados por exposio de vsceras a aplicao
de formol 10%. No entanto, preciso frisar que este mtodo no recomendvel devido
gerao de resduos txicos e sua utilizao em nossa Instituio deve ser abolida o mais
breve possvel.
Mtodos de Primatas no
eutansia humanos
CO2 No aceitvel
Superdosagem de Mtodo de escolha
barbitricos EV
Aps sedao
Superdosagem de Mtodo de escolha
anestsicos
Aps sedao
Outros mtodos No aceito
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DETALHAMENTO
Usar sempre a via endovenosa ou intraperitoneal, com veculo na temperatura
ambiente, agulha de calibre apropriado para cada espcie assim como volumes apropriados
(ver captulo referente a inoculaes). A dosagem, se no especificada, deve ser de trs a
quatro vezes a dose usada para anestesia (vide tabelas no captulo anestesia / sedao
constante neste guia de procedimentos).
*2- animais silvestres devem ter licena do IBAMA para captura, transporte, criao e
eutansia. A no ser em casos excepcionais, avaliados um a um, animais silvestres no
podem ser introduzidos no Campus e toda a manipulao, inclusive eutansia, deve ser feita
em local apropriado prximo s reas de captura. As carcaas podem ser taxidermizadas
(para depsito em coleo) ou formolizadas e encaminhadas para incinerao. Os tecidos e
secrees obtidos devem ser condicionados e transportados de acordo com as normas de
biossegurana do Campus.
REFERENCIAS
http://www.nature.com/nature/journal/v441/n7093/full/441550a.html
http://www.nature.com/nature/journal/v441/n7093/full/441570a.html
http://www.ibama.gov.br/fauna/conhecimentos.php
DEFINIES:
CAPTULO 10
ENDEREOS IMPORTANTES
http://www.presidencia.fiocruz.br/vppdt1/com_etn_uso_anim_.php
email- ceua@fiocruz.br
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ANEXO
animais criados ou usados para fins biomdicos devem ser dispensados por
tcnico qualificado;