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Controle de Contaminação

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Nº da Edição: 109 Maio / 2008

Nº da Edição: 109 Maio / 2008

Confira os tipos e características de divisórias e forros para áreas limpas

Materiais

Como evitar a formação

Qualidade

Autor: Lucia Clontz

Como evitar a formação Qualidade Autor: Lucia Clontz A contaminação microbiana pode causar uma redução de

A contaminação microbiana pode causar uma redução de fluxo e corrosão das linhas do sistema de água

Introdução

Microorganismos estão presentes nos ambientes ou como células livres, ou formando comunidades microbianas complexas associadas à superfícies diversas que se chamam

biofilmes. Na natureza, é raro o tipo de ecologia com células individuais crescendo livres, em suspensão, sendo o biofilme a forma mais comum de uma população microbiana. Biofilmes têm importantes papéis na natureza e são conhecidos como filtros biológicos. Nas estações de tratamento de água, biofilmes ajudam na remoção de organismos patogênicos, participam na reciclagem do enxofre oriundo de drenados de ácidos de minas e reduzem a quantidade de matéria orgânica nos efluentes. Porém, em muitas situações, o crescimento de biofilmes não é desejável e sua presença tem um impacto negativo. Biofilmes são formados naturalmente em qualquer superfície sólida quando em contato com água não esterilizada. A contaminação microbiana pode causar uma redução de fluxo e corrosão das linhas do sistema de água. Porém, o impacto negativo maior é a deterioração da qualidade da água que exerce papel fundamental nas diferentes fases do processo de fabricação de produtos farmacêuticos. A formação de biofilmes pode contaminar os produtos farmacêuticos

e consequentemente causar injúria à pacientes submetidos à aplicação dos mesmos.

Sistemas de purificação e distribuição de água contribuem para a colonização microbiana por fornecer as quatro condições necessárias para a formação de biofilmes: água, nutrientes, superfície inerte e presença de células livres (planctônicas). Por menor que seja, o processo de formação de biofilmes (“fouling”) é inevitável. Portanto, é necessário o controle rigoroso dos sistemas de purificação de água e dos processos de tratamento, incluindo cuidados especiais para os métodos de avaliação, remoção e prevenção de biofilmes.

O que são biofilmes?

Biofilmes são comunidades microbianas imobilizadas em superfícies bióticas ou abióticas e

embebidas numa matriz viscosa, composta de substâncias poliméricas extracelulares, a qual

é produzida pela própria comunidade [1]. Biofilmes podem se originar de uma ou de diversas espécies de microorganismos. As bactérias de um biofilme formam uma entidade biológica complexa e dinâmica através de um comportamento multicelular com atividades coordenadas de interação e comunicação interbacteriana (“quorum sensing”). Biofilmes são de inquestionável importância para a sobrevivência de microorganismos em

vários tipos de ambientes. Umas das mais fascinantes descobertas sobre biofilmes é o fato de que várias bactérias transferem entre si diversas características genéticas. Por exemplo,

a resistência a produtos antibióticos é transferida a outras células da comunidade através

de plasmídeos. A resistência a tratamentos com produtos micro biocidas também é possível

devido à transferência horizontal de genes, à densidade do biofilme, aos tipos de metabolismo das células e da expressão atípica de genes quando comparada ao fenótipo das células livres das mesmas espécies de organismos.

Formação e acumulação de biofilmes

Os processos de formação e acumulação de biofilmes, dependente de fatores físicos e

biológicos, são compostos de mais ou menos três etapas distintas como ilustradas na Figura 1.

1. Na primeira etapa, células livres no meio líquido são transportadas para perto de uma

superfície sólida causando sua subsequente fixação devido à participação de moléculas de adesão (fímbrias ou flagelos) presentes ao longo da superfície celular. Estudos feitos com linhagens mutantes de pseudomonas aeruginosa relataram que, quando células não

sintetizam flagelos, elas são incapazes de realizar as interações iniciais com as superfícies para formação do biofilme.

2. A segunda etapa envolve o crescimento e divisão das células fixas, a custa de nutrientes

presentes no líquido, e a produção e excreção da matéria exopolissacarídia (EPS) que passa a atuar como substrato para aderência de microorganismos colonizadores secundários. Durante esta etapa, a comunidade cresce com a fixação de outros tipos de células bacterianas e outras

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partículas flutuantes. 3. Finalmente, quando o biofilme atinge uma etapa de amadurecimento, a massa bacteriana é liberada por mecanismos como erosão e dispersão. Microorganismos liberados poderão colonizar novos ambientes causando, eventualmente, uma contaminação sistêmica do sistema

de água.

A maioria das bactérias presentes em sistemas de água são oligotróficas, podendo se

reproduzir em ambientes com conteúdo de carbono mínimo (e.g., 115 mg de carbono por litro de água). Nessas condições de deficiência nutricional, há um aumento na capacidade de aderência à superfícies, pois células microbianas têm mais acesso a nutrientes quando presentes numa comunidade imobilizada. Por isso, é importante evitar a presença de pontos mortos ou água parada em tubulações, pois estes facilitam a adesão de células às superfícies.

Arquitetura dos biofilmes

Biofilmes são estruturas tridimensionais complexas e compostas aproximadamente de 15% de uma densa massa microbiana envolta pela matriz de EPS que forma a maior parte do biofilme, sendo essa uma estrutura composta na maior parte de água (95%). Essa comunidade biológica contém áreas intersticiais vazias e vários canais de água que podem ser comparados a um sistema circulatório primitivo. Esses canais permitem a troca de nutrientes e metabólitos potencialmente tóxicos para os organismos. As células microbianas presentes num biofilme possuem vários tipos de metabolismo, estando as bactérias mais ativas (e aeróbicas) na parte exterior e as bactérias mais inertes (e anaeróbicas) na parte interior da comunidade. Bactérias residindo no interior de biofilmes são protegidas de deslocação quando expostas a uma corrente de água com alta turbulência. Tais células também estão protegidas da ação de biocidas, como o cloro, destinados a combater a expansão de biofilmes sobre superfícies industriais. Células em biofilmes são muito mais resistentes à desinfecção quando comparadas às células livres [2]. Como ilustrado na Figura 2, o mecanismo de defesa em biofilmes tem várias origens, incluindo a estrutura da matriz EPS, um micro ambiente com regiões aeróbicas e anaeróbicas e a presença de células que parecem estar numa condição metabólica de dormência (“persister cells”). Por isso, os métodos convencionais de desinfecção são ineficientes contra biofilmes e requerem, por vezes, doses elevadas do desinfetante. Quando um biofilme atinge sua capacidade máxima, as células sofrem dispersão, em geral de três tipos: (1) dispersão expansiva acontece quando células retornam à motilidade e são liberadas da comunidade; (2) durante uma dispersão de fragmentação, porções da comunidade são liberadas por erosão forçada; (3) dispersão superficial acontece quando camadas na superfície do biofilme são liberadas via “quorum-sensing.” Dispersão de biofilmes tem um repercussão extremamente negativa, pois as células liberadas mantêm suas características genéticas de resistência e eventualmente se tornam sésseis, colonizando outras partes do sistema de água.

Avaliação de Biofilmes

A presença de biofilmes em sistemas de água purificada é difícil de ser detectada, pois na maioria dos casos, as células do biofilme estão em condições viáveis mas não culturáveis (VBNC – “viable-but-non-culturable”). Sendo assim, essas células não irão se reproduzir nos meios de cultura típicos para o cultivo de bactérias (e.g., TSA e R2A). Geralmente células detectadas são planctônicas ou se soltaram do biofilme. Por isso, quando microorganismos gram negativos são detectados e os ensaios foram feitos corretamente, há uma alta probabilidade de que um biofilme existe no sistema de água, nas válvulas ou nas mangueiras usadas para coletar as amostras é importante fazer esta distinção para poder verificar a origem da contaminação. A avaliação da presença de biofilmes também oferece um dilema aos microbiologistas, pois não existe uma relação direta quanto ao número de células detectadas nas amostras e a localização ou o tamanho da comunidade microbiana. Por exemplo, um número baixo de microorganismos pode ser uma indicação de um biofilme amadurecido (células se soltam para colonizar outras partes do sistema de água). Porém, este mesmo biofilme pode soltar um número enorme de células esporadicamente (e.g., 1000 CFU UFC/mL) ou não soltar nenhuma célula. Quando este tipo de padrão de “bioburden” for observado nos resultados de monitoramento de um sistema de água, há razão para investigar a presença de um biofilme. Os métodos visuais (e.g., microscopia de contraste, microscopia epifluorescência, microscopia

eletrônica de varredura, ou uso do corante alaranjado de acridina) e não visuais (e.g., impedância

e bioluminescência) podem ser usados para avaliar biofilmes diretamente nas superfícies. A

técnica de bioluminescência, baseada no conteúdo de trifosfato de adenosina (ATP), é uma boa alternativa para detectar células de biofilmes em amostras de água. Usando essa tecnologia, células viáveis mas não culturáveis podem ser enumeradas.

Prevenção de biofilmes

Remoção de biofilmes é extremamente difícil. Por isso, a melhor solução para evitar a formação de biofilmes é a prevenção, a qual deve começar com o projeto e continuar com a manutenção do sistema. Cuidados durante a fase do projeto garantem a produção de água com boa qualidade e evitam contaminação microbiana no futuro. Em sistemas inadequados, a formação de biofilmes pode ser iniciada algumas horas após a instalação e em certos casos, em poucos minutos [3]. As áreas de maior risco de

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contaminação num sistema de água purificada são as gaxetas, cotovelos e locais onde a velocidade do fluxo é baixa (e.g., zonas mortas, trocadores de calor e tanques de armazenamento). Cuidados também são necessários para evitar vazamentos nos trocadores de calor e contaminação de blocos de carbono ativado e das membranas dos sistemas de

osmose reversa. Para a instalação do sistema é necessário utilizar tubos, válvulas, registros, gaxetas, etc. fabricados com materiais inertes, livres de pontos mortos, sem superfícies ásperas ou vazamentos. Estes mesmos devem ser facilmente limpos, drenados e sanitizados.

O uso de materiais lisos, como aço inoxidável 316L e Teflon, não só facilitam a limpeza como

também retardam a adesão de microorganismos. Cotovelos e interconexões devem ser evitados para diminuir a possibilidade de que células livres entrem em contato com superfícies.

O fluxo de circulação contínua é o método de distribuição recomendado e geralmente, sistemas

de água purificada são mantidos a uma velocidade de 1.52.5 metros por segundo, criando uma turbulência satisfatória para satisfazer as autoridades regulamentares (e.g., FDA e Anvisa). Porém, já que biofilmes podem ser formados mesmo em condições de alta turbulência [4], contar com fluxo elevado de circulação como prevenção de contaminação sem usar um tratamento biocida não é uma prática recomendada.

Sanitização e remoção de biofilmes

Os processos de tratamento e sanitização de linhas de água utilizam métodos diferentes ou

combinações de processos para garantir a produção de água com as qualidades físico-químicas e microbiológicas necessárias para uso na indústria farmacêutica. A água potável é tratada com processos como filtração primária, ultrafiltração, carvão ativado e ultravioleta. Para produção de água usada na manufatura de produtos farmacêuticos, processos como deionização, osmose reversa, destilação e ultrafiltração, além de tratamento com radiação ultravioleta são usados. Sanitização frequente é necessária para prevenir a formação de biofilmes. Quanto mais denso o biofilme, mais difícil será para que ele seja inativado ou removido. Por isso, é importante que o método de sanitização usado seja capaz de reduzir o número das células livres e de prevenir adesão das mesmas nas superfícies da tubulação.

O processo de sanitização mais eficaz envolve manutenção da água aquecida a 65-80º°C e

circulando continuamente um sistema mantido nestas condições é considerado auto-sanitizante, pois bactérias adaptadas a sistemas aquáticos geralmente não podem sobreviver em temperaturas acima de 30º°C. Para manutenção de sistemas de água purificada com circulação e temperatura ambiente (25 ± 5º°C) ou com circulação e temperatura fria (0–5º°C) é recomendado sanitização semanal de tubulações e sanitização diária dos pontos de uso. Radiação ultravioleta (UV) também é usada como sanitizante e atinge em geral uma eficiência de 99% na eliminação de células planctônicas UV não tem eficácia contra células em biofilmes. Filtração usando membranas micro retentivas em combinação com radiação ultravioleta é uma prática bem eficaz para eliminar células livres, especialmente para sistemas de água que não podem ser mantidos à temperaturas altas. Porém, deve-se ter cuidado para evitar que células

acumuladas na superfície do filtro atravessem o mesmo e contaminem o sistema. Produtos químicos, como cloro, ozônio, hipoclorito de sódio, dióxido de cloro, formaldeído e ácido peracético também são usados como sanitizantes. Porém, quando um biofilme se instala no sistema, é difícil sua remoção com produtos químicos [5]. O ozônio, frequentemente usado em sistemas de água purificada, é extremamente eficaz tendo um desempenho superior ao hipoclorito de sódio, formaldeído e ácido peracético. O formaldeído apenas desinfeta a superfície do biofilme, pois ele não penetra as camadas da massa microbiana. O hipoclorito de sódio e ácido peracético atacam o biofilme, mas vários tratamentos são necessários, e com bastante frequência, para poder eliminar totalmente as células (e.g., de uma a duas vezes por semana). Já

o ozônio é mais eficaz, podendo penetrar e desintegrar a matriz EPS, atacando as bactérias no

interior do biofilme e destruindo as endotoxinas produzidas por células gram negativas. Por isso,

dos tratamentos químicos usados, o ozônio é o mais preferido e o mais seguro. Porém, quando usar ozônio para remover biofilmes estabelecidos, é preciso aplicar uma concentração maior do que a usual e por um tempo de contato mais longo. O dióxido de cloro também é eficaz e como um gás dissolvido em água, este produto é capaz de penetrar nas camadas do biofilme e inativar as células. Como há certas dificuldades com o uso de dióxido de cloro, muitas companhias preferem usar ozônio. Além de tratamento químico e de calor, remoção de biofilmes por meios físicos deve ser utilizada sempre que possível. As células mortas, se não forem removidas, servem de nutrientes e superfície para células planctônicas, causando uma rápida re-colonização.

Conclusão

Biofilmes são comunidades microbianas extremamente resistentes à processos que normalmente seriam letais às células planctônicas. Por isso, é necessário evitar a adesão de células livres a superfícies usando meios físicos (e.g., filtração, UV, calor) e remover completamente biofilmes detectados por meios físicos (e.g. limpeza mecânica com uso de solução detergente, fluxo alto e temperatura elevada) e químicos (e.g., ozônio).

Em geral, contaminação microbiológica de sistemas de água resulta de falhas durante o projeto ou durante a manutenção. Prevenir biofilmes é extremamente importante, pois a remoção completa de um biofilme estabelecido é muito difícil. Para prevenção e remoção de biofilmes, a sanitização dos encanamentos, válvulas e mangueiras, usando métodos químicos e físicos, é um procedimento crítico.

A vigilância constante com monitoramento de amostras de água é necessária para garantir o

controle microbiológico do sistema. Por isso, os métodos usados devem ser otimizados para

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cultivar células bacterianas típicas de sistemas de água purificada. O entendimento da importância de biofilmes na qualidade da água usada na indústria farmacêutica pode levar a uma melhor manutenção preventiva dos sistemas de purificação, através da definição de protocolos de monitoramento e sanitização periódicas e frequentes, evitando o impacto negativo de biofilmes.

Lucia Clontz Diretora de Microbiologia da Diosynth Biotechnology, uma companhia da Schering-Plough, Carolina do Norte, EUA

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