Anlisis transcriptmica y protemica de Oenococcus

oeni adaptacin a condiciones de estrs de vino

Mar Margalef-Catal , Isabel Araque , Albert Bordons , Cristina Reguant , y Joaqun Bautista-Gallego *

La informacin del autor notas Artculo licencia y derechos de informacin

Abstracto
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Introduccin
La fermentacin malolctica (FML) se produce en el vino de forma espontnea y,
alternativamente, puede ser inducida la inoculacin de cepas seleccionadas de bacteria de
cido lctico (LAB), principalmente Oenococcus oeni , por lo general despus de la
fermentacin alcohlica (Betteridge et al., 2015 ). La amplia gama de caractersticas
fisiolgicas y la capacidad de hacer frente a varias tensiones ambientales hacen O. oeni la
principal responsable de la FML. Este proceso consiste en la conversin de L-malato a L -
(+) - lactato y CO 2 y se requiere en el vino, principalmente de variedades de uva tinta,
porque confiere rasgos sensoriales positivos y mejora la estabilidad microbiolgica del vino
(Lonvaud-Funel, 1999 ; Mills et al,. 2005 ).
El vino es un medio hostil para O. oeni debido a sus caractersticas fisicoqumicas, tales
como pH bajo, etanol y SO 2 contenido, que pueden afectar negativamente la supervivencia
bacteriana y por consiguiente el desarrollo FML. En contraste con la diversidad de
mecanismos de respuesta de estrs descritos en Bacillus subtilis (Hecker et al., 1996 ;
Hecker y Vlker, 1998 ), el organismo modelo para las bacterias Gram-positivas, ningn
gen que codifica un factor sigma alternativo o cualquier otro regulador conocido de
respuesta al estrs, tales como HrcA, podra ser identificado en O. oeni . Grandvalet et
al. ( 2005 ) se describe en O. oeni la CTSR como regulador para la mayora de genes
chaperona molecular. Diferentes estudios han caracterizado algunos de los genes de
respuesta al estrs en O. oeni , tales como CLP, grpE, groES, HSP18, HDC, ftsH, Omra,
cfa, atpB , y trxA , entre otros (Jobin et al,. 1997 ; Guzzo et al., 2000 ;. Bourdineaud et
al, 2003 , 2004 ;. Beltramo et al, 2004 , 2006 ; Bourdineaud, 2006 ; Spano y Massa, 2006 ;.
Olgun et al, 2009 , 2010 ). Estos estudios revelaron que O.oeni ha desarrollado
mecanismos celulares que lo hacen ms resistentes a las condiciones adversas que otras
especies de BAL (Beltrn et al., 2006 ). El conocimiento de los mecanismos de respuesta al
estrs de esta bacteria es clave para entender la capacidad de adaptacin al entorno de vino
de cada cepa y seleccionar el mejor cultivo iniciador.
Gracias a la publicacin durante los ltimos aos de los genomas de diferentes oeni
O. tensiones en el Centro Nacional de Informacin Biotecnolgica (NCBI), hoy en da es
posible el estudio global de la respuesta al estrs por las tecnologas micas. Hay dos
estudios publicados de O. oeni combinando anlisis transcriptomic y protemica, la
aplicacin de microarrays de ADN y 2DE o 2D-DIGE: Olgun et al. ( 2015 ) estudiaron el
efecto de la adicin de etanol durante el crecimiento (despus de 1 h), y Costantini et
al. ( 2015 ) estudiaron el vino como la adaptacin de medios durante 24 h. El primer
estudio protemico era de Silveira et al. ( 2004 ) y mostraron que tanto el estrs etanol y
adaptacin cambiaron significativamente los perfiles de protenas de O. oeni clulas. Ms
tarde, Cecconi et al. ( 2009 ) realizaron un estudio protemico mediante 2DE examen de O.
oeni adaptacin a las condiciones del vino. Otros autores han estudiado los arrancadores
enolgicas para determinar su perfil protemico (Cafaro et al., 2014 ; Napoli et al., 2014 ).
En este trabajo, hemos combinado un enfoque transcriptmica y protemica para dilucidar
los cambios que implica la adaptacin de O. oeni PSU-1 a las condiciones parecido al vino,
evaluando el perodo comprendido entre la inoculacin y el comienzo de la FML. El
anlisis transcriptomic fue desarrollado utilizando microarrays de ADN diseadas para la
PSU-1 cepa y los resultados obtenidos fueron validados por tiempo real qPCR. Para el
estudio protemico se emplearon dos tcnicas complementarias: 2D-DIGE y etiquetado
iTRAQ. Tcnica 2D-DIGE (unlu et al., 1997 ) se basa en un etiquetado pre-electrofortico,
lo que permite la multiplexacin de la muestra en el mismo gel. Esta tcnica gel
dependiente se ha utilizado en varios estudios con otras especies de BAL (Mehmeti et
al,. 2011 ;. Koponen et al, 2012 ;. Genovese et al, 2013 ). Sin embargo, la reproducibilidad
variable de este tcnica junto con la difcil automatizacin y deteccin de protenas
hidrofbicas bajo de abundancia y de membrana han dado lugar a una amplia variedad de
metodologas off-gel para la cuantificacin de protenas. Con el fin de complementar el
anlisis DIGE, en este trabajo se utiliz una espectrometra de masas en tndem (MS / MS)
junto con las etiquetas isobricas para relativa y absoluta cuantificacin (iTRAQ) (Ross et
al., 2004 ) etiquetado para permitir la identificacin y cuantificacin de diferencialmente
expresado protenas en momentos especficos. La combinacin de cromatografa lquida
(LC) y la ionizacin por electrospray anlisis MS / MS es una metodologa potente
emergente que permite la cuantificacin y la comparacin de los niveles de protena
directamente a partir de muestras con una mayor eficiencia y precisin. Este es el primer
anlisis protemico utilizando esta tcnica libre de gel con O. oeni .
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materiales y mtodos

Las condiciones de crecimiento y monitoreo FML

La cepa utilizada en este estudio fue O. oeni PSU-1, el nico en su especie con el genoma
totalmente anotado (Mills et al., 2005 ). Los cultivos madre (mantuvo congelado a -80 C)
fueron cultivadas en medio de caldo MRS (De Man et al., 1960 ) suplementado con 4 g de
cido L-mlico / L y 5 g / L fructosa a pH 5,0 a 28 C en un 10% de CO 2 atmsfera. Las
clulas se recogieron al final de la fase exponencial (OD 600 nm= 01/04 a 01/06) y se
inocularon en el medio. A continuacin, las clulas se recogieron al final de la fase
exponencial y se inocularon (v / 2% v) en 5 L de botellas con tapn de rosca de medio-vino
como (WLM). WLM se prepar siguiendo (Bordas et al., 2015 ) que contiene etanol 12%
(v / v) a pH 3,4. Las botellas se incubaron a 20 C. Los ensayos se realizaron por
triplicado. Las mediciones de consumo de cido L-mlico se realizaron con el
multianalyser Miura Uno (ISESrl, Guidonia, Italia) y el kit enzimtico listo para usar (TDI
SL, Barcelona, Espaa) con el fin de determinar el comienzo y la evolucin de la FML.
ARN y protena de extraccin
Despus de la inoculacin en WLM, se tomaron muestras en diferentes momentos (0, 0,5,
1, 2, 4, 6 y 8 h) para el ARN y la extraccin de protenas. Para la extraccin de ARN, 20 ml
se recogieron de WLM, o 0,3 ml de cultivo MRS utilizan para la inoculacin (0 h). Las
muestras se centrifugaron a 10.000 x g durante 5 min a 4 C, el sobrenadante se retir y
pellet se lav con 10 mM de Tris-HCl preparado con agua dietilpirocarbonato-tratado
(DEPC), y luego se congel en nitrgeno lquido y se mantiene a -80 C hasta la
extraccin de ARN. Se utiliz alta Pure Kit de aislamiento de ARN (Roche, Mannheim,
Alemania) para la extraccin de ARN siguiendo las instrucciones del fabricante, con
algunas modificaciones, tales como lisis con lisozima disuelto en 10 mM Tris-HCl DEPC
tampn, a 50 mg / ml durante 30 min a 37 C. El ARN se trat con Turbo ADN-libres
(Life Technologies, EE.UU.). Las concentraciones totales de cidos nucleicos se calcularon
utilizando un espectrofotmetro Nanodrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Bremen,
Alemania).
Para la preparacin de extracto de protena, 800 ml de WLM, o 35 ml de cultivo MRS
utilizado para la inoculacin (0 h), se centrifugaron a 5000 g rpm durante 15 min. Se
elimin el sobrenadante y sedimento se lav dos veces con tampn Tris-HCl 10 a pH 8, se
congelaron en nitrgeno lquido y se mantuvieron a -80 C hasta la extraccin de
protena. Los sedimentos celulares se resuspendieron luego a una DO final 600 = 30 en una
solucin de 0,1 M Tris-HCl a pH 7,5, mezclado con cctel inhibidor de proteasa de
Roche. Las clulas se rompieron usando disruptor One-shot (Constant Systems Ltd.) a 5
C, la aplicacin de dos veces a la presin de 2,7 kbar. La suspensin de protena se
centrifug a 4.500 g durante 15 min a 4 C para eliminar los restos celulares y el
sobrenadante se congel en nitrgeno lquido hasta el anlisis de protenas.

anlisis de transcriptmica

DNA microarray descripcin, etiquetado, y la hibridacin

Microarrays (090324_ Oenococcus oeni expresin de matriz 4-plex), basado en PSU-1
genoma, fueron desarrollados por Roche NimbleGen (Madison, WI, EE.UU.) y se
analizaron muestras en el Genmica Funcional Core del Instituto de Investigacin
Biomdica (IRB, barcelona, Espaa) como se describe por Olgun et al. ( 2015 ). Los
resultados se presentaron a GEO (Gene Expression Omnibus base de datos, NCBI) bajo el
nmero de acceso GSE85137 .

Microarrays resultados de la validacin de qPCR en tiempo real

Las secuencias de nucletidos de O. oeni cepa PSU-1 ( NC_008528 ) se obtuvieron de la
NCBI. Se seleccionaron varios genes para la validacin en tiempo real qPCR de los datos
de microarrays. Los cebadores utilizados para estos anlisis se muestran en la
Tabla Tabla1.1 . Algunos genes fueron seleccionados debido a su participacin en la
respuesta al estrs de acuerdo con estudios previos (Jobin et al., 1999b ;. Beltramo et
al, 2006 ;. Olgun et al, 2009 ;. Bordas et al, 2013 ; Margalef-Catal et al. , 2017 ) y otros
fueron seleccionados al azar con el nico objetivo de la validacin de la metodologa. La
transcripcin inversa, en tiempo real qPCR y el diseo del cebador se llevaron a cabo de
acuerdo con Olgun et al. ( 2009 ). El Express Software Primer se utiliz para seleccionar
secuencias de cebador y analizar estructuras secundarias y la formacin de dmero. La
ausencia de contaminacin de ADN cromosmico fue confirmada por qPCR. Para la
normalizacin de los datos de qPCR (Vandesompele et al,. 2002 ; Sumby et al,. 2012 ;.
Cafaro et al, 2014 ) de cuatro genes ( ldhD, dpoIII, gyrA y gyrB ) se evaluaron como
controles internos, utilizando los cebadores descritos en la Tabla Tabla1.1 . De
estos, ldhD y gyrA genes mostraron la menor variacin en las condiciones experimentales
utilizadas (datos no mostrados) y se eligieron como controles internos. La eficiencia de
amplificacin se calcul como en Olgun et al. ( 2015 ).

tabla 1
Descripciones de genes y las secuencias de los cebadores correspondientes utilizados
para la validacin de resultados de microarrays por tiempo real qPCR .

El anlisis protemico

2D-DIGE
Los extractos de protena se analizaron en el Centro de Ciencias de la OMIC del Servei de
Recursos Cientficos i Tcnics de la Universidad Rovira i Virgili (Reus, Espaa). Las
protenas se precipitaron usando TCA / acetona, y el sedimento se resuspendi en 200 l de
tampn de rehidratacin (7 M urea, tiourea 2 M, 4% de CHAPS, 30 mM Tris-base) a pH
final 8,5. Las muestras se cuantificaron utilizando Bradford y se almacenaron a -20
C. Cincuenta microgramos de cada muestra de protena se marc mnimamente con 400
pmol de cualquiera de Cy3 o Cy5 (N-hidroxi succinimidilo ster-derivados de los
colorantes de cianina). Para facilitar la comparacin de imgenes y la normalizacin cross-
gel, un estndar interno se hizo la agrupacin de todas las muestras y el marcado con Cy2
en la misma proporcin (50 g: 400 pmoles). Por lo tanto, dos muestras y el patrn interno
se podran funcionar en el mismo gel y se cuantificaron en mltiples 2-DE. Las reacciones
de marcaje se realizaron en hielo y la oscuridad durante 30 min y se inactivaron usando un
exceso de libre L-lisina.
Isoelectroenfoque (IEF) se llev a cabo utilizando 24 cm Immobiline Dry-tiras (intervalo de
pH 4-7, no lineales, GE Healthcare), y la muestra se carg por dos pasos de rehidratacin
(pasivamente a 5 h a 20 C, y activamente a 50 V durante 12 h en un sistema Ettan
IPGphor 3 de GE Healthcare). Programa de migracin IEF comenz a concentrarse 500 V
durante 7 h, el aumento gradual hasta 1 KV durante 4 h y el aumento gradual de nuevo
hasta 10 KV durante 3 h, y finalmente un paso mantuvo a 10 KV para llegar a 70 KVH. Las
tiras se equilibraron despus durante 15 min en una mM Tris-HCl 50 (pH 8,8) 6 M urea,
30% de glicerol y tampn de SDS 2%, aadiendo primero DTT al 1%, y en un segundo
tiempo suplementado con 4% iodoacetamine (Grg et al., 2004 ).

procesamiento de imgenes y datos

Los geles fueron escaneados utilizando un PharosFX Plus Molecular Imager y se

analizaron usando prognesis mismos puntos v4.5 Software de Anlisis (TotalLab). Spots
que muestran un aumento 1 media veces o disminucin en la abundancia con un p <0,05
fueron seleccionados para la identificacin de protenas. Caractersticas detectadas a partir
de fuentes no proteicas (por ejemplo, partculas de polvo y fondos sucios) se separaron por
filtracin. Anlisis de la cosecha se realiz cargando 720 g de la mezcla estndar interno sin
etiquetado en un gel 2DE tal como se describe anteriormente. Los geles se tieron con
Coomassie G250 azul y utilizando imgenes de Pharos FXTM Plus Molecular Imager de
BioRad usando Cantidad Una versin de software 4.6.9.

En la digestin en gel con tripsina y la identificacin de protenas basado en MS

Spots de inters se escindieron de forma automtica a partir de 2-DE geles utilizando el

ExquestTM del punto de corte con el v8.0.1 Anlisis 2D PDQuestTM avanzada Software
ambos de Bio-Rad. manchas escindidos se de-hidratados de extensos lavados con
bicarbonato de amonio 25 mM y acetonitrilo. Todas las piezas de gel se incubaron con 15
ng l de tripsina / de calidad para secuenciacin en bicarbonato de amonio 50 mM a pH 7,9
durante la noche a 37 C. Despus de la digestin, los pptidos se desalaron usando C18
zip-punta (Millipore), y se eluyeron con cido 75% de ACN + 0,1% trifluoroactico.
Los pptidos fueron vistos en un 384 objetivo HTP BigAnchor (Bruker) usando -ciano-4-
hidroxi-cinmico cido como matriz y se analizaron en un MALDI TOF / TOF
(Ultraflextreme, Bruker Daltonics, Bremen, Alemania) instrumento operado en el ion
positivo modo. Todos los espectros de masas se calibraron externamente con el pptido
estndar de calibracin de I a partir de Bruker. El intervalo de masa analizado fue 600 a
3500 Da. anlisis MS y MS / MS se llevaron a cabo de forma automtica. Para el anlisis
de MS, 3100 disparos satisfactorios se acumularon mediante el registro de los pasos 100-
shot en 20 posiciones aleatorias usando fuzzy atenuacin lser de control entre 40 y 100% a
la potencia inicial y mxima respectivamente. Para MS / MS 3100 disparos satisfactorios se
acumularon mediante el registro de los pasos 100-shot y 4000 para los espectros de iones
fragmento.
MS y tndem MS / MS espectros fueron registrados por protena Scape v: 3.0.0 446
utilizando MASCOT (Matrix Science Inc., MA, 2.4.0) contra la base de datos de NCBInr
(46742655 entradas) restringido a las bacterias (Eubacteria). Los parmetros de bsqueda
se fijan a: MS precisin 20 ppm, MS / MS precisin 0,5 Da, dos perdi la escisin por la
tripsina permitido, carbamidometilacin de cistena modificacin como fijo y la oxidacin
de la metionina y la conversin de aminocidos N-terminal de Glu y Gln en cido
piroglutmico como modificacin variable. xitos de protena significativas (por pptido
masa de huellas dactilares p 0,05 y para MS / MS al menos dos pptidos con p 0,05, y
las puntuaciones de protenas mayores que 30) se consideraron significativas.

etiquetado iTRAQ
La digestin de protenas y etiquetado iTRAQ

En un gel de SDS-PAGE (12% gel de resolucin y 4% de gel de apilamiento) a 20 mA / gel

40 g de protena total por muestra se realizaron. La electroforesis se detuvo cuando el
colorante frente apenas haba pasado a partir del gel de apilamiento en el gel de resolucin,
y se obtuvo una banda concentrada nica para cada muestra, que se tieron usando Azul
Brillante de Coomassie G-250, extirp, se cort en trozos pequeos y se almacena a 4 C
en agua ultrapura.
La digestin de protenas se realiz de acuerdo con Shevchenko et al. ( 1996 ) con
pequeas variaciones, como se describe antes. Las protenas se redujeron usando tris 5 mM
(2-carboxietil) fosfina (TCEP) en 50 mM de trietilamonio pH 7,9 bicarbonato durante 1 h a
60 C y se alquil con methanethiosulfate metilo 10 mM (MMTS) en el mismo tampn
durante 30 min a temperatura ambiente . Para digerir las muestras, se incubaron con 15,4 ng
/ l de tripsina de calidad para secuenciacin en 50 bicarbonato de trietilamonio mM a pH
7,9 durante la noche a 37 C. Despus de la digestin, los pptidos se extrajeron de gel
mediante elucin en una mezcla de 50% de acetonitrilo cido frmico al 5%. Los pptidos
trpticos se secaron por SpeedVac y re-suspendieron en 30 l TEAB 0,5 M a pH 8,5.
Se aadieron reactivos de marcaje iTRAQ-8plex (AB SCIEX) para cada muestra de pptido
de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se incubaron a temperatura ambiente
durante 120 min. Las mezclas de muestras marcadas se lavaron a partir de reactivos que no
han reaccionado utilizando columna SCX (Strata SCX 55! M, 70 , Phenomenex) en 10
mM de cido fosfrico, 25% de acetonitrilo, tampn a pH 3 y 5% de hidrxido de amonio
como de unin, 25% de acetonitrilo para la elucin. Despus de la elucin, las muestras se
secaron a vaco y re-suspenden en agua para el siguiente paso.

fraccionamiento de la muestra y el anlisis de espectrometra de masas (LC-MS / MS)

pptidos agrupados se separaron en un Agilent 3100 OFFGEL fraccionador (Agilent

Technologies, Santa Clara, CA) a travs de 24 pocillos tiras IPG (gradiente lineal de pH 3-
10) segn el protocolo del proveedor. Despus de la separacin, las fracciones se desalaron
y se concentraron a travs de la columna C18 Sep-Pak (Waters, Bedford, MA) previamente
a la deteccin de LC-MS / MS.
Un nano LC II acoplado a un analizador Pro masa LTQ-Orbitrap Velos, ambos de Thermo
Scientific (Bremen, Alemania), se utiliz para el anlisis de pptidos. La separacin
cromatogrfica se consigui usando un nanoLC C 18 columna trampa (100 micras ID; 2 cm
de longitud; 5 dimetro m de partcula, Thermo Fisher Scientific) acoplado a un nanoLC
C 18 columna analtica (75 micras ID; 15 cm longitud; 3 m de partculas dimetro, Nikkyo
Technos Co. LTD, Japn) en condiciones de elucin de gradiente. Agua ultrapura con 0,1%
de HCOOH (disolvente A) y acetonitrilo con 0,1% de HCOOH (disolvente B) fue la fase
mvil y el gradiente consisti en 0-5% de B durante 5 min, 5-35% de B 30 min, 35-80% B
15 min y 80-100% de B 12 min, y finalmente se mantiene a 100% de B durante 10
min. Una velocidad de flujo de 300 Nl / min para eluir pptidos para ionizacin tiempo real
en una fuente de iones de electrospray Nanoflex de Thermo Fisher Scientific.
Mediciones MS detectaron pptidos intactos en un anlisis completo (m / z 350 a 2000),
con la Orbitrap en espectro FT-resolucin (R = 30.000 FHMW), seguido de datos
dependiente de MS / MS escanear desde 10 iones primarios ms intensos con una carga
rechazo estado de uno. El umbral de seal para activar un evento MS / MS se fij a 10.000
recuentos. El punto de corte de baja masa se estableci a 100 m / z. Se utiliz la exclusin
dinmica de 30 s y el tiempo de activacin de 0,1 s. Para la fragmentacin y la deteccin de
los iones informadores iTRAQ eficiente, HCD normalizado energa de colisin de 45 se
utiliz. Todos los fragmentos de iones se detectaron en el Orbitrap ( R = 7,500
FHMW). Calibracin interna se llev a cabo utilizando la seal de ion de (Si (CH3) 2O) 6H
+ a m / z 445,120025 como una masa de bloqueo. Maximal tiempo de acumulacin de
iones permitidos en la LTQ Orbitrap fue de 1 s para todos los modos de escaneo; control
automtico de ganancia se utiliza para evitar el exceso de llenado de la trampa de iones.

bsquedas de bases de datos y el anlisis del proteoma cuantitativa

Tandem espectros de masas se extrajeron y estado de carga deconvoluted por Proteoma

descubridor v1.4.0.288 (Thermo Fisher Scientific). Todas las muestras de MS / MS se
analizaron usando Mascot (v 2.4.1.0) como nodo de motor de bsqueda. Mascota fue
creada para buscar en la base de datos NCBInr (46,742,655 entradas), tras la aplicacin de
la restriccin de Firmicutes taxonoma. Dos divisiones perdidas se permiti para la
digestin de tripsina, y un error de 0,80 Da para masas de iones fragmento y 10,0 ppm para
un ion padre se toleraron. La oxidacin de la metionina, la acetilacin de N-terminales y
iTRAQ modificaciones 8-Plex se especifica como modificaciones variables, mientras que
la metilacin de cistenas se estableci modificacin como esttica. La tasa de falso
descubrimiento (FDR) y las probabilidades de protena se calcula por Target Decoy PSM
Validador de trabajo entre 0,01 y 0,05 para la estricta y relajada, respectivamente. Para las
protenas identificadas con slo un nico pptido cumplimiento de estos criterios, que
requiere la puntuacin de la mascota que sea al menos 30, y fue hecho la verificacin visual
de los espectros de fragmentacin. protenas identificadas se agrupan por el software para
minimizar la redundancia. Para el anlisis cuantitativo seales reportero de iones iTRAQ
centroided se calcularon y slo los pptidos nicos se utilizaron para la cuantificacin
relativa de protenas. intensidades de iones informadores iTRAQ se normalizaron a la
muestra 113, que se replica en las dos mezclas de iTRAQ.
El anlisis estadstico se llev a cabo en el perfil de masas de software profesional v. 12.6
de Agilent Technologies. Para encontrar protenas diferenciales, se utiliz una prueba de
ANOVA de 1 va emparejado seleccin de un p <0,05 y doble cambio> 1,5 como valores
de corte. Se utiliz el anlisis de componentes principales (PCA) para evaluar las
variaciones en la cantidad media de puntos.

herramientas bioinformticas
Bases de datos en lnea como informacin NCBI de cada gen, la biologa computacional en
el Laboratorio Nacional de Oak Ridge (ORNL; http://compbio.ornl.gov/public/section/ ),
base de datos DAVID (https://david.ncifcrf.gov/ ), KoBas 2,0 (Sistema KEGG Orthology
Based Anotacin; http://kobas.cbi.pku.edu.cn/ .) (Xie et al, 2011 ) se utilizaron para evaluar
todos los grupos de Orthologous Grupos (engranajes) se describe para el O . oeni genes y
las protenas y las vas metablicas. Se analizaron los datos de expresin de matrices con
MEV (Multi Experimento Vista) software de clster utilizando herramientas de calidad
Umbral Clustering (QTC) (Heyer et al., 1999 ). Correlacin de Pearson y una poblacin
mnima de clster del nmero de genes representativos de 10% se utilizaron y un dimetro
mximo de agregado de 0,9. Para la construccin de diagramas de Venn, Venny (una
herramienta interactiva para comparar las listas con los diagramas de
Venn, http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html se utiliz).
Ir:

Resultados y discusin
El anlisis funcional usando transcriptmica comparativos y protemica puede
proporcionar visin ms profunda de los mecanismos moleculares de adaptacin de O.
oeni a condiciones de estrs de vino. El objetivo de este trabajo fue evaluar cules son los
genes y las protenas se ve afectada durante el periodo de adaptacin que ocurren antes del
inicio de la FML. El estudio se realiz con la cepa de referencia PSU-1 utilizando medio-
vino como (WLM) a pH 3,4 y con 12% de etanol (v / v). En estas condiciones, PSU-1
mostr un perodo de adaptacin de 8 h desde la inoculacin hasta el comienzo de la
FML. Una vez iniciado el consumo de L-malato, FML se termin con xito en 72 h. La
viabilidad de PSU-1 no disminuy durante el perodo de adaptacin, lo que indica que no
hubo muerte celular detectable de la poblacin inoculado (6,87 10 7 1,70 10 7 UFC /
ml).

Anlisis global de las funciones afectadas durante la aclimatacin a WLM

En el anlisis transcriptomic 1611 se detectaron etiqueta de secuencia expresada
(EST). Entre los EST que se expresa de forma diferente durante la adaptacin, 27 se
clasificaron como genes interrumpidas o seudo en NCBI, y no se incluyeron en el
anlisis. Entre los genes analizados que muestran cambios significativos a lo largo del
ensayo, 314 fueron sobre-expresado, mientras que 308 genes se redujeron reguladas. Se
pueden consultar en la Tabla S1 en los datos suplementarios. Vale la pena sealar que 52
genes sobreexpresados y 51 genes regulados hacia abajo fueron anotados como protenas
hipotticas (Tabla S2 en los datos suplementarios).
Estos 622 genes expresados de forma diferente se clasificaron en grupos Grupos
Orthologous (engranajes) con el fin de identificar los principales procesos biolgicos
influenciados por adaptacin a las condiciones de vino (Figuras 1A, B ). Adems, el
anlisis QTC agrup los genes expresados diferencialmente en seis perfiles de transcripcin
(Figura (Figura 2).2 ). Las principales funciones transcriptionally activado debido a la
inoculacin en WLM en O. oeni PSU-1 eran traduccin, ribosomal estructura y biognesis
(J) y el transporte de aminocidos y el metabolismo (E) (Figura (Figure1B).1B ). El anlisis
QTC (Figura (Figura 2)2 ) mostr dos perfiles de expresin, I y III (65,9 y 13,6% de exceso
de genes expresados, respectivamente), en el que la traduccin (J) fue la funcin ms
representado. Estos dos perfiles son indicativos de una respuesta adaptativa desde
transcripcin del gen aumenta progresivamente a lo largo de proceso de adaptacin. El
perfil de II (17,5% de exceso de genes expresados) incluido en su mayora genes del
metabolismo de aminocidos que muestran un aumento de su nivel de transcripcin entre
0,5 y 1 h, que se redujo ms tarde. Este comportamiento es indicativo de una respuesta
temprana a condiciones de estrs WLM. En cuanto a los genes que muestran una
transcripcin inhibido, metabolismo de los carbohidratos (G) fue la principal funcin
regulada negativamente en PSU-1 durante la adaptacin a WLM
(Figura (Figure1B).1B ). Los genes relacionados con este metabolismo principalmente
mostraron una baja regulacin constante y estaban presentes en el perfil IV (Figura (Figura
2),2 ), lo que representa el 62,2% de los genes regulados hacia abajo totales. Menos genes
se agruparon en perfil V (15,3%), que muestra la represin transcripcional slo al principio
del ensayo (0,5-1 h). Por ltimo, el perfil VI agrupan 19,8% de reguladas por los genes que
tenan una represin progresiva durante el perodo de adaptacin.

Figura 1
(A) grupos de Orthologous Grupos (engranajes) Definiciones. (B) Porcentaje de genes de
cada COG representante significativamente sobre o bajo-expres segn el anlisis
transcriptomic. (C) Porcentaje de protenas de cada COG representativo que muestra
significativa ...

Figura 2
La expresin del gen Representante perfiles de acuerdo con la calidad de umbral
Clustering (QTC) basado en los datos transcriptomic . Se muestra un ejemplo de cada
perfil. Perfil I: (ligasa UDP-N-acetylmuramoyl-tripptido-D-alanil-D-alanina)
OEOE_RS07930; Perfil II: ...
El anlisis protemico de O. oeni PSU-1 adaptacin a las condiciones WLM se llev a cabo
usando dos tcnicas: 2D-DIGE y iTRAQ. El PCA analiza para evaluar la variabilidad entre
las muestras indic claramente la presencia de tres poblaciones diferentes de protenas 0, 1
y 6 h (datos no mostrados). Los resultados 2D-DIGE mostraron entre 27 y 62 manchas de
protenas a lo largo del ensayo exhibe abundancia diferencial con significacin estadstica
( p 0,05). Se observaron las diferencias mximas comparacin de las muestras de 1 y 6 h
despus de la inoculacin frente a 0 h. Por esta razn, la identificacin de protenas se llev
a cabo slo para estas muestras y se analizaron tambin estas muestras usando etiquetado
iTRAQ a fin de complementar los resultados 2D-DIGE. Uso de 2D-DIGE, 33 protenas
diferentes se pudieron determinar que no se encontraron con iTRAQ. Por otro lado, la
tcnica off-gel detect 71 protenas exclusivamente. En 1 h se detectaron ms protenas
hasta regulado que a las 6 h, revelando una respuesta protemico estrs rpido de la clula
contra el nuevo entorno. Todo identificacin protemico y clasificacin COG de 2D-DIGE
y anlisis iTRAQ se pueden consultar en la Tabla S3 (de datos).
Un alto porcentaje de la (Figura protenas significativamente baja regulado (Figure1C)1C )
perteneca a la COG asociada a la traduccin, ribosomal estructura y biognesis (J). Esto
est de acuerdo con estudios anteriores que describen la menor abundancia de protenas
implicadas en la sntesis de protenas durante el estrs cido en Lactobacillus especies
(Koponen et al,. 2012 ; Heunis et al,. 2014 ). Por otro lado, algunas protenas ribosmicas
de subunidades 50S y 30S mostraron un aumento de la abundancia en O. oeni PSU-1
despus de la inoculacin en WLM. Este aumento en la concentracin de protena fue
coincidente con un plano regulada la transcripcin de genes (Tablas (Tables2,2 , ,
3).3 ). Huang et al. ( 2011 ) y Koponen et al. ( 2012 ) tambin describen el aumento de la
abundancia de 50S y / o protenas ribosomales 30S en Lactobacillus especies como un
mecanismo de respuesta al estrs cido. Por lo tanto, ciertas protenas ribosomales que
participan en la regulacin de la traduccin pueden desempear un papel en la respuesta al
estrs como sugiere Dressaire et al. ( 2010 ).

Tabla 2
La seleccin de genes relacionados con el metabolismo o funciones pertinentes,
diferente regulado despus de la inoculacin en WLM desde el anlisis de
microarrays .

Tabla 3
Seleccin de protenas relevantes detectados por 2D-DIGE y anlisis iTRAQ diferente
regulado despus de la inoculacin WLM en 1 y 6 h .
Un nmero correspondiente de protenas relacionadas con el cido y el metabolismo de
hidratos de carbono (E, G) amino mostr variaciones significativas en la abundancia
(Figura (Figure1C)1C ) tanto aumentando o disminuyendo, siendo algunos de ellos de
acuerdo a la respuesta transcripcional (Tablas (Tables2 ,2 , , 3).3 ). Por otro lado, las
protenas relacionadas con el mecanismo de defensa (V) y metabolitos secundarios (Q)
detectada mostr principalmente un aumento de la abundancia (Figura (Figure1C1C ).

Principales metabolismos modificados por las condiciones parecido al vino

Malate y el metabolismo de citrato

Tres de los cinco genes relacionados malato anotados en O. oeni PSU-1 genoma se sobre-
expres: una de las permeasas ( mLep ), el transportador OEOE_RS06985 -que tena una
expresin de 4 veces en 1 h despus de la inoculation-, y la malato deshidrogenasa ( Mae )
(tabla (Tabla 2).2 ). La activacin de la transcripcin observado de los transportadores de
malato en condiciones relacionadas con el vino eran de acuerdo con estudios anteriores
(Labarre et al., 1996 ) y eran indicativos de la induccin de la FML como parte de la
respuesta al estrs. En Augagneur et al. ( 2007 ) un aumento significativo se observ en la
abundancia de ARNm que codifica mLep derivado de las clulas incubadas en presencia de
L-malato a pH 4,5 y 3,2. Del mismo modo, mLep era sobreexpresada en el microarray
realizado por Costantini et al. ( 2015 ) debido a la adaptacin (1 da) a etanol 8 y 12%.
En este trabajo se detect la expresin ms del opern citrato liasa, la observacin de la
ms alta expresin 1 h despus de la inoculacin en WLM (tabla (Tabla 2).2 ). La
activacin transcripcional de O. oeni citrato liasa en respuesta a etanol estrs se ha
informado anteriormente por Olgun et al. ( 2009 ). El transcripcional regulacin del
transporte de malato y el consumo de citrato podra ser indicativo de la utilizacin de L-
malato y citrato asociada a la respuesta al estrs y como fuente de energa alternativa al
metabolismo del azcar. Los cambios significativos se observaron tambin para los genes
implicados en la utilizacin de diacetilo. El diacetilo es el compuesto aromtico principal
asociado a MLF y se deriva de consumo de citrato. Diacetil reductasa mostr una
inhibicin de la transcripcin, mientras que su abundancia de protenas aument 6 h
despus de la inoculacin en WLM. Por otro lado, la reductasa de acetona se inhibi tanto
en el gen y el nivel de protena. Diacetilo y acetona reductasas estn involucrados en dos
reacciones de transformacin de diacetilo, primero en acetona y luego en 2,3-butanodiol
como el producto final. Estas dos reacciones implican la oxidacin de NAD (P) H y
participaran en el mantenimiento del equilibrio cofactor redox. Metabolismo diacetil ha
sido descrito como dependiente de la cepa (Bartowsky y Henschke, 2004 ). En las
condiciones estudiadas con PSU-1 de deformacin, diacetilo y acetona reductasas pudiera
ser inhibido inicialmente, sin embargo los datos protemicos mostraron el aumento de la
abundancia de la reductasa de diacetilo hacia el comienzo de la FML, lo que podra ser
correlacionada con la activacin de consumo de citrato y la consiguiente produccin de
diacetilo.

actividad ATPasa
La actividad de ATPasa se ha asociado a MLF (Salema et al., 1996 ). Cox y Henick-Kling
( 1989 ) propusieron un mecanismo quimiosmtico donde la energa es producida por el
flujo de salida de L-lactato a partir de la degradacin de L-malato. Fortier et al. ( 2003 )
describieron el aumento de F 0 F 1 -ATPasa subunidad mRNA en respuesta a un pH
bajo. Sin embargo, en este trabajo varios genes codificando para otras subunidades ATPasa
(, , , y ) se redujeron reguladas antes del comienzo de la FML (tabla (Tabla
2).2 ). Aunque, en el estudio protemico la subunidad fue inicialmente reducido regulado
(1 h), su abundancia aument a 6 h. Esto podra indicar que cuando las clulas son ms
largos aclimataron a WLM (6 h despus de la inoculacin), y ms cerca del inicio del
consumo de L-malato, se aumenta la actividad de ATPasa.

el transporte de aminocidos y el metabolismo

Vale la pena sealar la activacin de varios genes relacionados con la actividad peptidasa y
el transporte de aminocidos (tabla (Tabla 2).2 ). Adems, cinco peptidasas fueron
identificados en el anlisis protemico, pero su abundancia vara en funcin de la protena y
el tiempo analizado. Liu et al. ( 2010 ) informaron de que muchas de las peptidasas parece
ser esencial para el crecimiento bacteriano o la supervivencia, ya que se codifican en todos
los genomas de laboratorio, tales como PEPC, PepN, y PEPM, y peptidasas prolina PepX y
PEPQ. Actualmente en PSU-1 genoma no estn anotadas 29 peptidasas. Asimismo, con
relacin a la absorcin de nitrgeno, tres permeasas implicadas en el transporte compuestos
de nitrgeno son fuertemente sobre-expresado (tabla (Tabla 2)2 ) despus de la inoculacin
en WLM, llegando a la activacin mxima a 2 h. Puesto que los pptidos representan la
mayor proporcin de nitrgeno total en el vino (Feuillat et al., 1998 ), estos resultados
sugieren la relevancia de la composicin de nitrgeno vino y la capacidad de O. oeni para
hacer frente a su entorno segn lo informado por Manca de Nadra et al . ( 1999 ) y Ritt et
al. ( 2008 ).
Algunos genes y protenas relacionadas con la sntesis de glutamina y glutamato, que
participan en la asimilacin y re-distribucin de nitrgeno dentro de la clula, fueron
reguladas revelando el papel clave de la absorcin de nitrgeno por O. oeni en un pobre
medios nutrientes, tales como WLM. La glutamina sintetasa fue hasta regulado tanto en el
gen y el nivel de protena. El gen de aminotransferasa 4-aminobutirato (OEOE_RS01860),
que transforma GABA en semialdehdo succinato y L-glutamato, era triple sobre-expresado
durante la 8 h de O. oeni PSU-1 adaptacin a WLM. GABA puede ser asimilado como
nitrgeno y / o fuente de carbono en bacterias tales como Escherichia coli (Bartsch et
al., 1990 ) y Corynebacterium glutamicum (Zhao et al., 2012 ), pero no hay informacin
disponible acerca de LAB a este respecto.
Seis genes implicados en el transporte de espermidina / putrescina se sobre-expresan
(Tabla (Tabla2).2 ). La absorcin de estos dos poliaminas se ha asociado con un potencial /
membrana estado de produccin de energa de la clula en E. coli (Kashiwagi et
al., 1997 ). Tanto putrescina y espermidina protegen contra el estrs oxidativo (Tkachenko
et al., 2001 ). Olgun et al. ( 2015 ) informaron de que este mecanismo de proteccin
tambin puede ser un objetivo de dao etanol en una descarga etanol, que inhibira la
absorcin de estas poliaminas. En este caso, la adaptacin a las condiciones de WLM dio
lugar a una sobre-expresin de seis de los ocho transportadores de estas poliaminas
anotados en PSU-1 genoma.

el transporte y el metabolismo de carbohidratos

Microarrays de datos revelaron que el transporte de azcar fue reprimida (tabla (Tabla 2)2 )
en respuesta a las condiciones WLM. En particular, con fosfato de glicerol-3 de unin a
ATP se redujeron reguladas cassettes de transportadores ABC y transportadores
fosfotransferasa de manosa (PTS). Esta inhibicin es probablemente debido a la menor
disponibilidad de azcares en WLM con respecto al medio de crecimiento rico en el que se
prepararon inculos. Una fuerte inhibicin de la transcripcin del metabolismo del azcar y
el transporte en respuesta a etanol tambin se observ por Olgun et al. ( 2015 ).
Enolasa, entre otros, fueron fuertemente hasta reguladas a pH bajo en comparacin con el
crecimiento ptimo a pH 6,8 (Lee et al., 2008 ). En este ensayo, la protena enolasa
aument en abundancia 1 h despus de la inoculacin. Por el contrario, los datos
transcriptomic reportados en este trabajo y por Costantini et al. ( 2015 ) muestran la
inhibicin del gen de enolasa en condiciones de vino similares. Esto sugiere que la enolasa,
podra ser de hasta reguladas a nivel de traduccin en respuesta al estrs. Esta protena,
adems de ser involucrado en la fermentacin de azcar, se ha relacionado con el anfitrin
de la adhesin de tejidos en bacterias probiticas incluyendo Lactobacillus
plantarum (Castaldo et al., 2009 ).

el transporte de lpidos y el metabolismo

La regulacin en genes y protenas nivel de metabolismo de los lpidos era escasa y, en la
mayora de los casos, se haba reducido regulado. Por ejemplo, el
gen cfa (OEOE_RS05660) que est implicada en la conversin de cidos grasos
monoinsaturados a ciclopropano cidos grasos (CFAs) se inhibi en 1 h. El aumento
de cfa se observ la transcripcin en clulas a cido y etanol crecido (Grandvalet et
al,. 2008 ;. Olgun et al, 2010 ) despus de un perodo de exposicin al estrs ya que en este
trabajo, una vez MLF haba comenzado.

pared / membrana celular biognesis / envoltura

Varios genes y protenas relacionadas a la celda biognesis envolvente se sobre-
expresado. Uno de los genes anotado como D-alanil-D-alanina carboxipeptidasa
(OEOE_RS03435) fue 6 veces sobre-expresado en 2 h y su fuerte sobreexpresin
comenzado 0,5 h despus de la inoculacin en WLM. Este gen y OEOE_RS06975 (por
peptidoglicano protena formacin de puentes interpeptdicos) eran tambin sobre-expresa
en anlisis transcriptomic por Costantini et al. ( 2015 ), tanto despus de la adaptacin con
12% de etanol. Sin embargo, en el presente estudio, otro D-alanil-D-alanina
carboxipeptidasa (OEOE_RS07530) mostr un comportamiento opuesto, siendo el
regulado tanto en el gen y el nivel de protena. El peptidoglicano (PG) es un componente
esencial de la envoltura celular bacteriana, requerido para la forma celular y la estabilidad
(Vollmer et al., 2008 ). Un suministro de D-aminocidos es esencial para la sntesis del
peptidoglicano; Por otra parte, D-Ala es el constituyente principal de los cidos teicoicos de
la pared y cidos lipoteicoicos, que son polmeros polianinicos que se encuentran
exclusivamente en las bacterias Gram-positivas (Wecke et al., 2009 ). Otra funcin
activada, tanto en el gen y el nivel de protenas, era de glucosamina: aminotransferasa
fructosa-6-fosfato, que tambin est implicado en la biosntesis de la pared celular. Cecconi
et al. ( 2009 ) encontraron una concentracin importante de glucosamina aminotransferasa
6-fosfato en oeni O. clulas aclimatadas al etanol que en las clulas no aclimatadas. Estos
resultados sealan la especificidad y la pertinencia de algunas enzimas que intervienen en
la proteccin de la envoltura celular contra el desafo estrs.
Se redujeron reguladas Tres protenas relacionadas a la celda biognesis pared. Entre ellos,
la protena varilla de forma determinante (MreB), con un papel de actina-como, fue menos
abundante en 1 y 6 h. Estos resultados se correlacionan con la informacin reportada para
las protenas MreB1 y B2 que determinan la forma celular de L. plantarum 423 que eran
menos abundantes en las clulas-cido subrayado (Heunis et al., 2014 ) y la inhibicin de la
transcripcin debido a etanol de otra forma que determina la varilla protenas, tales como
MreB, en O. oeni (Olgun et al., 2015 ). Adems, el anlisis de microarrays revel la
inhibicin de tres genes (OEOE_RS07265, OEOE_RS03340, y OEOE_RS07010)
implicados en la biognesis de la pared celular, que codifica uno de ellos una protena de la
biosntesis de polisacrido capsular, el gen que fue descrito como bien por Dimopoulou et
al. ( 2012 ) como WZD . Todas estas funciones reguladas abajo seran dianas de los daos
causados por factores tales como el etanol y el pH bajo.

La traduccin, ribosomal estructura y biognesis

Una de las categoras que muestran cambios ms significativos en O. oeni PSU-1
transcriptoma y proteoma debido a las condiciones WLM era funciones relacionadas con la
traduccin. Vale la pena sealar que varios 30S y 50S ribosomal genes se expresaron sobre-
al igual que sus protenas correspondientes. Varias protenas ribosomales son regulados
hasta en Lactobacillus rhamnosus bajo estrs cido (Koponen et al., 2012 ). Adems, en O.
oeni de acuerdo con estas observaciones, Cecconi et al. ( 2009 ) informaron de que la
adaptacin en el medio-vino como medio de fuerza se correlaciona con la regulacin hacia
arriba de algunas protenas de transcripcin / traduccin como factor de elongacin Ts y
30S protena ribosomal. Un gen que codifica para una protena ribosomal era
diferencialmente sobre expres entre 0 y 1 h despus de la adicin de etanol en O.
oeni PSU-1 (Olgun et al., 2015 ). Como bien en muestras de O. oeni adaptados a 12% de
etanol, una protena ribosomal fue hasta reguladas (Costantini et al., 2015 ). Los estudios
con Lactococcus lactis sugieren que la regulacin de la traduccin tiene un papel
importante en la respuesta al estrs (Dressaire et al., 2010 ). De acuerdo con nuestros
resultados esto tambin sucedera en O. oeni .

respuesta al estrs
Como era de esperar, se observ la activacin de la funcin de acompaante en respuesta a
condiciones de estrs WLM. Algunos genes, tales como grpE, dnaJ y dnaK , y las
protenas, como GroEL y GroES (Hsp10), mostraron regulacin en PSU-1 despus de la
inoculacin en WLM (Tablas (Tables2,2 , , 3).3 ) . Este ltimo chaperona, Hsp10, se
conserva a lo largo de LAB (Sugimoto et al., 2008 ). Sin embargo, Hsp20, la protena de
estrs ms caracterizado O. oeni (Guzzo et al., 1997 , 2000 ), mostr una inhibicin de la
transcripcin en nuestro ensayo y no hay cambios en la concentracin de protenas. Esto
est de acuerdo con Costantini et al. ( 2015 ), que describe la activacin transcripcional
de HSP20 slo en estrs leve etanol (8%), pero la escasa expresin de este gen con 12% de
etanol, como se encuentra en nuestro trabajo. Una protena de choque fro
(OEOE_RS06620) mostr un aumento de la abundancia 1 h despus de O. oeni PSU-1 de
la inoculacin, pero su expresin gnica se inhibi a lo largo del ensayo. Esta protena
podra desempear un papel en la respuesta temprana al estrs relacionado con el vino, pero
no en el proceso de adaptacin a largo plazo.
Nuestros datos revelaron que las condiciones de vino como causaron un aumento de las
protenas implicadas en la proteccin del estrs oxidativo, relacionado con los sistemas de
tiorredoxina y glutatin. Dos de los tres tiorredoxinas ( TrxA ) anotados para PSU-1,
OEOE_RS07835, y OEOE_RS08215, son regulados hasta 6 h despus de la
inoculacin. Tambin la tiorredoxina reductasa ( trxB ), OEOE_RS02695, y un gen
ferredoxina reductasa ( FDR : OEOE_RS00770), anotada en NCBI como trxB hasta febrero
de 2015, se activaron bajo condiciones de estrs vino. El glutatin reductasa (GSHR) fue
significativamente ms abundantes en O. oeni PSU-1 despus de la inoculacin en
WLM. Sin embargo, transcriptomic datos revelaron que algunos de estos genes se
inhibieron; lo que indica que la regulacin de traduccin de estas funciones sera prevalente
en las condiciones estudiadas. Nuestros resultados apoyan la importancia de los sistemas de
tiorredoxina y glutatin en la adaptacin de O. oeni al estrs relacionado con el vino. Hay
pocos estudios con respecto a la tiorredoxina en O. oeni (Jobin et al,. , 1999a ; Guzzo et
al,. 2000 ;. Margalef-Catal et al, 2017 ), por lo que el papel de este sistema de mecanismo
y glutatin contra el estrs de vinos es bastante desconocido .
Entre los genes sobreexpresados en relacin con el mecanismo de defensa que haba ocho
genes de transporte a mltiples frmacos. Transportadores ABC son una parte importante
de los sistemas de eflujo involucradas en el transporte de nocivos-compuestos y
desintoxicacin celular (Leverrier et al., 2004 ).

Evaluacin de la correlacin de datos OMIC

qPCR validacin en tiempo real

Con el fin de validar los resultados obtenidos del anlisis de microarrays, en tiempo real
qPCR se realiz con el mismo ARN a partir del experimento de microarrays
originales. Veintids genes, algunos relacionados con el estrs respuesta, se seleccionaron,
tomando la muestra de ARN de tiempo en el mximo de expresin ms o de menos se
haba observado en los microarrays (Tabla (Tabla 1).1 ). Hubo un acuerdo general entre
microarrays y qPCR datos en tiempo real para todos los genes ensayados. De los 22 genes,
17 fueron claramente correlacionadas usando ambas tcnicas. Para HSP18 gen se
obtuvieron los valores ms altos de qPCR que para datos de microarrays. Finalmente los
cuatro genes restantes (diacilglicerol quinasa, azcar PTS, cfa y trxA2 ) muestran valores
numricos inferiores mediante qPCR, lo que indica cambios significativos utilizando esta
tcnica, mientras que con microarray que eran ligeramente inhibido. En general, la
correlacin entre el tiempo real qPCR y microarray era bueno, lo que sugiere que las
mediciones de microarrays de expresin gnica eran vlidas. Por otra parte, la validacin de
dos tiorredoxinas ( trxA2 y trxA3 ) era til para la identificacin protemico.

Integracin de anlisis transcriptomic y protemica

Se ha informado en gran medida que la correspondencia de los datos transcriptomic y
protemica es bajo debido a los numerosos y complejos mecanismos reguladores
implicados en la transcripcin de genes y la sntesis de protenas (Dressaire et al,. 2010 ;
Haider y Pal, 2013 ). En este trabajo, 19 genes presentan una correlacin con los resultados
de protemica (Tablas (Tables2,2 , , 3).3 ). El ms relevante, en trminos de
entendimiento O.oeni respuesta al estrs, ya se han discutido en el texto. Diagrama de Venn
muestra en la Figura Figura 33 muestra el nmero de modificaciones coincidentes de genes
y protenas en diferentes momentos analizados frente al tiempo cero. Vale la pena sealar
se observ el mayor nmero de coincidencias de genes arriba / abajo regulados (166 y 158,
respectivamente) 1 y 6 h despus de la inoculacin en WLM. Esto indica que la mayor
parte de los cambios transcripcionales se mantuvieron a lo largo del ensayo de 8 h, antes de
empezar la FML. Sin embargo, algunos genes slo se modificaron en uno de los tiempos
analizados, lo que indica su papel especfico en temprano (1 h) o de adaptacin (6 h) de
respuesta, respectivamente. En cuanto a cambios en las protenas, el patrn observado era
diferente y muchas protenas mostr modificaciones slo en uno de los dos tiempos
analizados. Sin embargo, algunas protenas mantienen la regulacin hacia arriba o abajo a
lo largo del ensayo. En conjunto, los datos reportados ilustra la complejidad de oeni
O. regulacin celular y la dificultad de encontrar los genes marcadores especficos y / o
protenas asociadas a la respuesta al estrs.

figura 3
Diagrama de Venn de la cantidad de protenas y genes que muestran cambios
significativos en abundancia y de expresin, respectivamente, de acuerdo con
transcriptomic, y el anlisis protemico 1 y 6 h despus de la inoculacin de O.
oeni PSU-1 en WLM. (A) exceso de genes expresados ...
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conclusiones
El estudio transcriptomic y protemica combinado fue til para identificar los
metabolismos mayormente alterados debido a las condiciones de vino similares. El uso de
dos tcnicas protemicas complementarios permiti la deteccin de un mayor nmero de
protenas influidos por factores de estrs. Nuestros resultados revelaron la importancia de la
regulacin de la traduccin y la absorcin de nitrgeno como metabolismos clave
involucrados en la adaptacin de O. oeni PSU-1 al estrs relacionado con el
vino. Biosntesis de la pared celular y los mecanismos de mantenimiento redox parecen
jugar tambin un papel relevante en la proteccin de O. oeni contra el dao celular. Por
ltimo, el metabolismo del azcar se inhibe en contraste con la activacin transcripcional
de transporte L-malato y el consumo de citrato antes del comienzo de la FML.
La mayora de las modificaciones moleculares que ocurren durante O. oeni adaptacin al
vino depender de las condiciones de deformacin y / o de fermentacin. Sin embargo,
la OMIC anlisis permite la identificacin de las funciones ms relevantes afectadas por el
estrs relacionado con el vino, sobre la que se debe centrar la investigacin futura.
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Contribuciones de autor
MM, IA: realiz los experimentos, particip en la adquisicin, anlisis e interpretacin de
los datos, aprob la versin final del documento. AB, CR, JB: supervis el trabajo de
laboratorio, particip en el anlisis e interpretacin de los datos, redact el manuscrito y
aprob la versin final del documento.

Declaracion de conflicto de interes

Los autores declaran que la investigacin se llev a cabo en ausencia de cualquier relacin
comercial o financiera que puedan interpretarse como un posible conflicto de intereses. La
EET revisor y editor de manejo declararon su afiliacin compartida, y el editor de manejo
indica que el proceso, sin embargo, se reuni con los estndares de una revisin justa y
objetiva.
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Expresiones de gratitud
Este trabajo fue apoyado por becas AGL2009-07369ALI y AGL2012-34866ALI del
Ministerio de Economa y Competitividad espaol. MM agradece a la beca pre-doctoral de
la Rovira Universitat i Virgili. JB agradecer al Gobierno espaol por su contrato de
investigacin Ayuda para la Formacin Posdoctoral.
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notas
Este trabajo fue apoyado por la subvencin (s) siguiente:
Ministerio de Economa y Competitividad 10.13039 / 501100003329 AGL2009-
07369ALIAGL2012-34866ALI.
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Material suplementario
El Material complementario para este artculo se puede encontrar en lnea
en: http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2016.01554
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