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EXTRACCION Y

PURIFICACION
DE METABOLITOS

DOWNSTREAM PROCESSING

Introduccin
Downstream processing, conjunto de operaciones unitarias, empleadas
para la recuperacion de los productos dentro del proceso biotecnologico

Metabolitos intra y extracelulares

Se requiere de operaciones cuidadosas y efectivas desde un punto de vista de


la calidad (lbiles o sensibles) y economia del proceso

Generalmente se requiere de una secuencia de operaciones:


Centrifugacin Extraccin
Sedimentacin Cromatografia
Filtracin Concentracin
Filtracin tangencial Destilacin
Deshidratacin

1
ESQUEMA DE LA PRODUCCION E INTEGRACION
DE LAS TECNICAS BIOTECNOLOGICAS

Cultivo de clulas Optimizacin de los


TECNICAS DE ANALISIS
animales fenmenos de transferencia Cromatografa:HPLC, CPG
Clulas vegetales Automatizacin Sondas
Microorganismos, Desarrollo de nuevos Anticuerpos
etc... sensores Electroforsis

FERMENTADOR
EXTRACCION Y
PURIFICACION
BIO-REACTOR
PRE-CULTIVO PRODUCTOS
CELULAS Alimentarios
Farmacuticos
Energa
Qumicos

Microfiltracin
Optimizacin

Clulas y enzimas
Manipulacin

tangencial
inmovilizadas

Ultrafiltracin
gentica

Cromatografa
liquida
preparativa,
HPLC.

2
TYPICAL TYPES OF DOWNSTREAM PROCESSING OPERATIONS

SOLID/LIQUID SEPARATION PRECIPITATION


Filtration Salting out
Membrane filtration Isoelectric precipitation
Centrifugation Heat denaturation
Sedimentation Solvent precipitation
CELL DISRUPTION Soluble polymer addition
Bead mills Polyvalent metal ions
High pressure homogenizers ELECTRICALLY ENHANCED
Enzymatic SEPARATIONS
CHROMATOGRAPHY Electrophoresis
Ion exchange Electrodialysis
Size exclusion LIQUID/LIQUID EXTRACTION
Affinity Solvent
Hydrophobic interaction Aqueous two-
two-phase
Reverse phase

The choice of recovery process is based on the


following criteria:

1. The intracellular or extracellular location of


the product.
2. The concentration of the product in the
fermentation broth.
3. The physical and chemical properties of the
desired product (as an aid to selecting
separation procedures).
4. The intended use of the product.
5. The minimal acceptable standard of purity.
6. The magnitude of bio-hazard of the product or
broth.
7. The impurities in the fermenter broth.
8. The marketable price for the product.

3
Relationship between the product concentration
in the starting material and the selling price.
[From Dwyer, J. L. (1984). Biol. Technol.

II

III

SECTORES DEL MERCADO DE BIOPROCESOS

CARACTERISTICA SECTOR I SECTOR II SECTOR III

Nivel de produccin Alto 106-109 Medio 103-105 Bajo 10-1-102


(Kg/ao)

Organismo Microor. Selecionado Microor.mutado y Microor.mutado y


DNA recombinantes DNA recombinantes

Pureza requerida Baja (70-90 %) Media (90-99 %) Alta (99.5-100 %)

Eficiencia de recuperacin 90-100 % 50-90 % 5-50 %

Margen de ganacia 10-50 %, dependiendo 50-80 %, dependiendo Sobre 95%


% del precio de venta del precio de la materia del precio de la materia
prima prima

Costo de recuperacin/ 0.1-0.2 0.3-0.7 0.5-0.9


costo de produccin

Costo de recuperacin/ 0.1-0.2 0.1-0.5 0.01-0.2


C. de produccin+
C. de desarrollo

4
Separation of cells and medium

Recovery of cells and/or medium (clarification)

For intracellular enzyme, the cell fraction is required

For extracellular enzymes, the culture medium is required

On an industrial scale, cell/medium separation is

almost always performed by centrifugation

Industrial scale centrifuges may be batch or continuous

5
Separation of Cells

Precipitation/flocculation
Filtration
Centrifugation

Cell Disruption
Chemical: alkali, organic solvents, detergents
Enzymatic: lysozyme, glucanases, chitinase
Physical: osmotic shock, freeze/thaw
Mechanical: sonication, homogenization,
wet milling, French press

6
METODOS EMPLADOS PARA LA RUPTURA
CELULAR

In essence the objectives of cell disruption are as


follows:

1. To solubilise the maximum amount of the product


present in the cell whilst still maintaining maximum
biological activity.

2. To avoid secondary alteration of the product that


will render it useless e.g denaturisation and
oxidation

3. To limit the detrimental effects of the disruption


stage on the following separation steps

7
Procedimientos Mecnicos

a) Ultrasonidos. La aplicacin de ultrasonidos en un medio lquido


provoca la aparicin de zonas de compresin y descompresin
(formacin y desaparicin de burbujas). Este fenmeno conocido
como cavitacin, las burbujas son comprimidas a varias centenas de
atmsferas lo que lleva a la ruptura de las paredes celulares. Este
mtodo es adecuado para pequeos y medianos volmenes.

b) Congelacin-descongelacin. Despus de un enfriamiento


rpido, la formacin de cristales dentro y fuera de las clulas
implica la ruptura de estas. Sin embargo esta tcnica es limitada en
cuanto al rendimiento (salvo para las ezimas periplsmicas) y a
prdidas de actividad por desnaturalizacin de la protena
enzimtica.

Procedimientos
Procedimientos Mec
Mecnicos

c) Agitacin con materiales abrasivos. La agitacin violenta en


presencia de perlas de vidrio, desintegra la pared celular de los
microorganismos lo que permite liberar los constituyentes
citoplsmicos. El grado de desintegracin depende de la agitacin
(velocidad y duracin), de la concentracin de microorganismos y
de la cantidad y tamao de las perlas.

d) Desintegracin a alta presin. Una suspensin de


microorganismos, congelada a -25C, es sometida a una presin de
1 a 2,5 ton/cm utilizando una prensa hidrulica; que obliga la
suspensin a atravesar un disco perforado, cuyas perforaciones
tienen un dimetro de 1,5 a 2,5 mm. Esto provoca la ruptura de las
clulas. La temperatura de -25C es mantenida gracias a un bao de
alcohol.

8
Chemical Disruption
Detergents such as Trition X-
100 can permeabilize cells by
solubilizing membranes.

Detergents can be expensive,


denature proteins, and must
be removed after disruption

High Pressure Homogenizers.

High pressure homogenizers were


adapted from the milk processing
industry for disruption of cells.

These devices consist of a high


pressure positive displacement
pump and a homogenizing valve.

9
.High Pressure Homogenizers.
Homogenizers.

Disruption is caused by impact of a high velocity jet of


suspended cells against a stationary surface in the
homogenizing valve.
This is a continuous process but may require multiple
passes through the valve to achieve the desired level of
disruption.
Product cooling is critical since the process generates a
temperature increase of about 10C per 42 MPa
operating pressure.
Typical operating pressures for disruption range from 80
to 100 MPa.
Increasing operating pressure substantially increases the
amount of disruption achieved in one pass.

Homogenization
Cells are placed in a closed
vessel (usually glass). A tight
fitting plunger is inserted and
rotated with a downward
force. Cells are disrupted as
they pass between the plunger
and vessel wall.

10
Bead Mills
Bead mills have been adapted from industry where they are used for
fine grinding of materials.

They consist of a grinding chamber enclosing a central agitator shaft


on which impellers are mounted.

The chamber is partially filled with glass beads. During operation, the
beads are agitated by high-speed rotation of the impellers.

These systems also can be operated with continuous flow.

Much of the energy imparted by the impellers is dissipated as heat so


product cooling is necessary.

The amount of disruption achieved is affected by agitator design,


agitator speed, bead size, volume fraction occupied by beads, flow rate,
and concentration of cells in the feed.

French Press

Cells are placed in a


stainless steel container.
A tight fitting piston is
inserted and high
pressures are applied to
force cells through a
small hole.

11
Otros Procedimientos no Mecnicos

Deshidratacin. Se trata de la atomizacin. Las suspensiones


celulares son atomizadas bajo presin en forma de pequeas gotas
donde la evaporacin es acelerada por la llegada de aire caliente. El
polvo deshidratado es sometido a una extraccin en solucin
acuosa.

Lsis Qumica y Fsica


Diversos mtodos son utilizados:
a) Detergentes. Los detergentes inicos (sodio-laurilsulfato) o no
inicos (Tweens, Tritron), bajo ciertas condiciones de pH y a baja
fuerza inica se combinan con las lipoprotenas, presentes en las
membranas celulares, para formar micelios. La membrana se
permabiliza de esta manera.

Otros Procedimientos no Mecnicos

b) Shock osmtico. Una modificacin brusca de la concentracin


de sales o de sacarosa es utilizada para extraer enzimas
periplsmica.

Lsis Enzim
Enzimtica

La lisozima cataliza la hidrlisis de uniones (14) glucosdicas


de ciertos pptidos glicosilados, responsables de la rigidez de la
clula bacteriana (Gram + y Gram -), puede en presencia de EDTA
(que libera lipopolisacridos de la covertura de bacterias Gram -)
permitir la extraccin de enzimas, debido a la destruccin de la
pared celular en un medio hipotnico.

12
CHOICE OF DISRUPTION METHODS

Methods will vary depending on the type of cell and


its particular cell wall structure. The method selected
for large scale cell disruption will be different in
every case, but will depend on:

* Susceptibility of cells to disruption


* Product stability
* Ease of extraction from cell debris
* Speed of method
* Cost of method

En resumen

Disrupted Cells Cell Lysate

Pellet Centrifuge
(discard)
Cell-
Cell-Free Lysate
Supernatant Proteins, Nucleic Acids,
Small Molecules

Unwanted
Molecules
Multiple
Purification Steps

Pure Protein

13
DEFINICION
Es una tcnica utilizada en la separacin de los componentes de un
fluido, que fluye bajo presin sobre la superficie de la membrana
(separacin tangencial).
Comprende un grupo de procesos, que incluyen:
Microfiltracin, Ultrafiltracin,
Osmosis inversa y Nanofiltracin.

Alimentacin Retentado






Los compuestos





pequeos pasan a travs

de la membrana,
Permeado

mientras que los ms


grandes son retenidos

14
MICROFILTRACIN: RETENTADO
Rango de filtracin: 0.1 - 10 m
Presin: 0.2 - 2 bar
PMS: Sobre 1000,000 Da ALIMENTACION
Retiene: Virus,bacterias, coloides PERMEADO
slidos en suspensin

ULTRAFILTRACIN: RETENTADO
Rango de filtracin: 0.001 - 0.1 m
Presin: 1-10 bar (10 - 20 bar,
posible)
PMS: 500 - 500,000 Da ALIMENTACION
PERMEADO
Retiene: Macromolculas, Virus,
bacterias, coloides, slidos en
suspensin

RETENTADO
OSMOSIS INVERSA:
Rango de filtracin: 0.0001-0.001 m
Presin: 20-80 bar
ALIMENTACION
PMS: Bajo 50n Da PERMEADO
Retiene: Micro y macromolculas
Virus, bacterias, coloides, slidos en
suspensin

Schematic representation of membrane


fractionation in cross flow

15
Classification of membrane separation
processes for liquid systems

PS (PSO) Polysulfone (either polyethersulfone or polyarylethersulfone).


LMWC Low Molecular Weight Component, such as NaCl.
PVDF Polyvinylidenedifluoride.
CA Cellulose acetate, most often di- or tri-acetate.

16
Type of membrane process for several
products

COMPARACION ENTRE FILTRACION CONVENCIONAL Y


FILTRACION TANGENCIAL

Durante el flujo perpendicular los


slidos suspendidos son capturados
en el filtro lo que eventualmente
disminuye el flujo de filtraci
filtracin por
lo que es necesario detener el
proceso para limpiar o reemplazar
el filtro.

La filtraci
filtracin tangencial es m
ms
eficiente.

17
TIPOS DE MEMBRANA

De primera generacin, poco usadas


actualmente en razn de sus limitaciones a la
Membranas celulsicas
temperatura (max. 50 C), pH (entre 3-8) y sus
sensibilidad a los desinfectantes. Son de muy
alta permeabilidad y muy selectivas; pero
susceptibles a la hidrlisis qumica y enzimtica

De segunda generacin, ms resistentes a la


Membranas de polmeros temperatura (max. 75 - 80 C), pH (entre 2-12) y
orgnicos de sntesis poca resistencia a los desinfectantes clorados. Las
ms conocidas son: las polisulfonas, polisulfonas
modificadas, poliacrilonitrilos y poliamdas
aromticas

De tercera generacin, alta resistencia trmica


Membranas minerales
(hasta 400 C), pH (toda la escala) resistencia a
todos los desinfectantes. Se utilizan las de xido
de circnio y almina

18
CARACTERISTICAS DE LAS MEMBRANAS

Permeabilidad
Selectividad
Resistencia: qumica, trmica y mecnica
PERMEABILIDAD

 Depende de diversos factores, est relacionada con el flujo a travs de la


membrana
 El rendimiento reportado por los fabricantes puede variar por las siguientes
razones:
Resistencia hidralica, relacionada con el efecto de polarizacin y
depsitos de gel lo que incrementa la resistencia
El flujo de permeado depende de factores ajenos a la membrana:
geometra interna del mdulo, velocidad de paso y naturaleza del
producto.

SELECTIVIDAD

 La porosidad de una membrana se caracteriza por su PUNTO DE


RUPTURA (masa molecular mnima de las molculas totalmente
retenidas).
 La selectividad no depende nicamente de la masa molecular sino
del tipo de molcula, adems la irregularidad de las mallas de las
membranas hace que el 100 % de las molculas (cuya masa es
superior al punto de ruptura o inferior a dicho punto) queden
totalmente retenidas o sean totalmente eliminadas. Por esta razn
se utiliza el concepto de ZONA DE RUPTURA indicando que la
membrana retiene parcialmente las molculas cuya masa
molecular se encuentra entre uno y otro valor.

19
Para molculas cuya masa se
encuentra en la zona de ruptura, se
define La tasa de retencin o tasa
1.2
de rechazo, dada por :
1.0
R = 1 - Cp/Ca 1 2
0.8
Retencin total: R = 1, Cp = 0

R
0.6
Retencin nula: R = 0, Ca = Cp
0.4

0.2
Mientras ms estrecha sea la zona 0.0
de ruptura, mayor es la selectividad 0 1000 10000 100000
M

Dependence of rejection coefficient on molecular


weight for ultrafiltration membranes

20
NWMC

Filtros y membranas se caracterizan por un tamao de corte

segn la masa molecular en base a solutos solubles (NMWC,


Nominal Molecular Weight Cut-Off ) que es retenido en un 90%
por la membrana.

El NWMC vara entre 500-1.000.000 Da o 1-10.000 nm.

Materiales de construccin de las membranas


Esteres de celulosa
Nylon
Cloruro de vinilo
Acrilonitratos

RESISTENCIA

Qumica: Debe ser neutra respecto a los solventes habituales (usados


en la separacin y operaciones de limpieza) y tolerar una
amplia zona de pH.

Trmica: Deben resistir altas temperaturas como la de esterilizacin


caso de las membranas minerales.

Mecnica: Puede limitar la zona de presin de trabajo, prin-


cipalmente en la smosis inversa

21
POLARIZACION Y DEPOSITO DE GEL SOBRE LAS MEMBRANAS

En OI y UF siempre se observa una


acumulacin masiva de molculas retenidas, Alimentacin Retentado



cerca de la membrana, que estn atrapadas en un










rgimen laminar y slo pueden salir por




difusin. Esto se traduce en un aumento de la


viscosidad (UF) y presin osmtica (OI) que

Permeado
disminuyen el flujo a travs de la membrana. La
concentracin en soluto sobre la membrana
puede ser tan elevada que origina precipitacin
de sales y formacin de geles que pueden
colmatar la membrana.

FACTORES QUE INFLUYEN SOBRE EL FLUJO


DE PERMEADO

Presin diferencial transmembrana

Caudal de alimentacin

Concentracin del producto en extracto seco

Temperatura

22
Tubular membranes

Tubular membranes

23
CONFIGURACION
DE PLATO Y
CARCASA

Hollow Fiber Supported Liquid Membrane

24
ESQUEMA DE PRODUCCION DE PROTEINA Y LACTOSA A PARTIR DE
SUERO, UTILIZANDO ULTRAFILTRACION Y OSMOSIS INVERSA

SUERO PRE-TRATADO

RETENTADO
OI

AGUA RETENTADO
UF

PASTEURIZACION

PERMEAD
O
LACTASA SECADO POR
ATOMIZACION
LACTOSA
CONCENTRADA OI
HIDROLISIS PROTEINA DE
SUERO
JARABE LACTOSA
HIDROLIZADO

25
COMPARACION ENTRE LOS SISTEMAS DE CONCENTRACION DE SUERO POR
OSMOSIS INVERSA Y EVAPORACION AL VACIO

PARAMETRO OSMOSIS INVERSA EVAPORACION


250-550 kg / 1000 L de agua
Consumo de vapor 0
evaporada
10 kW/ 1000 L de agua eliminada
Aproximadamente 5 kW / 1000 L de
Consumo de electricidad (continuo); 20 kWh/1000 L de agua
agua evaporada
eliminada (discontinuo)
3.6 (6- 12 % de slidos) 387 (un efecto, 6 50 % de slidos)
Consumo energtico
8.8 (6- 18 % de slidos) 90 (dos efectos, 6 50 % de slidos)
(kWh)
9.6 (6- 20 % de slidos) 60 (siete efectos, 6 50 % de slidos)
Dos operarios para todo la instalacin
Mano de obra 4 horas al da
(sala de calderas y evaporadores)
29,300 kJ por 1000 L de agua eliminada 6
Consumo de agua de 1.2 5.2 X 10 kJ por cada 1000 L de
(continuo); 58,600 kJ por 1000 L de
enfriamiento agua evaporada
agua eliminada (discontinuo)
Dimensin econmica de
Mnimo 6000 L/da, sin lmite superior 80,000 100,000 L/da
la planta
Concentracin final del
Mximo 30 % de slidos totales Hasta 60 % de slidos totales
producto

INSTALACION DE FUNCIONAMIENTO CONTINUO CON


BUCLE DE RECIRCULACION

RETENTADO
ALIMENTACION
TANQUE DE

MODULO DE
FILTRACION

P1 P2

PERMEADO

26
PERMEADO

ALIMENTACION
TANQUE DE

MODULO DE
FILTRACION
P1 P2

Instalacion de funcionamiento
controlado mediante
captores de nivel PERMEADO
ALIMENTACION
TANQUE DE

MODULO DE
FILTRACION
P1 P2

Instalacion de funcionamiento
discontinuo
con bucle de recirculacion PERMEADO

27
DIAFILTRACION

Purificacin por
cromatografa

28
ASPECTOS A CONSIDERAR PARA LLEVAR A CABO UN
PROCESO DE PURIFICACION

Dis poner de un mtodo para determinar actividad enzimtica,


Conocer las caractersticas de la materia prima: naturaleza (lquida,
slida), procedencia (vegetal, animal microbiana), naturaleza biolgica
(celular, tisular, )
Localizacin del producto: extracelular, intracelular (mito-condria,
membrana, citoplasma,...)
propiedades estructurales y bioqumicas: PM, PI, estabilidad (pH, T),
activadores, inhibidores,
En general se trabaja a baja temperatura (+- 4C), medios tamponados y
con agentes protectores (EDTA, mercaptoetanol, sustrato,.....)

ESQUEMA DEL PROCESO DE AISLAMIENTO Y DE


PURIFICACION DE UNA ENZIMA

MATERIA
PRIMA

ETAPA 2
FRACCIONAMIENTO
ANIMAL VEGETAL MICROBIANA

EXTRACTO
BRUTO

ETAPA 1
ETAPA 3
EXTRACCION
PURIFICACION

EXTRACTO ENZIMA
TOTAL PURA

29
Disposici
Disposicin de un sistema de cromatograf
cromatografa en columna

ALGUNOS CRITERIOS PARA LA PURIFICACION DE ENZIMAS

Sobrenadante de la fermentacin o Extracto celular

Ultrafiltracin Precipitacin fraccionada

Desalado

C. de intercambio C. de filtracin
de iones C. de adsorcin
sobre gel

Ultrafiltracin

Protena Diferentes pesos Fraccin proteica


Afinidad fcil
inestable moleculares compleja

C. de filtracin C. de intercambio
C. de afinidad C. sobre hidroxiapatita sobre gel de iones

C. de filtracin C. de filtracin C. de filtracin


sobre gel sobre gel sobre gel

30
ESTRATEGIA GENERAL PARA LA PURIFICACION DE ENZIMAS

Concentracin

Volumen pequeo Volumen grande

Dilisis

C. de intercambio de iones

Concentracin
C. de filtracin sobre gel
C. de filtracin sobre gel

C. de filtracin sobre gel

C. de intercambio de iones C. de afinidad

Concentracin y dilisis

C. de intercambio Isoelectro- C. de interaccin


C. de afinidad Electroforsis
de iones focalizacin hidrofbica

C. de intercambio de iones o filtracin sobre gel

TECNICAS DE PURIFICACION DE ENZIMAS

ULTRAFILTRACION - ISOELECTROFOCALIZACION
DIALISIS
C. DE INTERCAMBIO - CROMATOFOCALIZACION
FILTRACION EN GEL DE IONES

P. MOLECULAR PUNTO
CARGA
ISOELECTRICO
ULTRACENTRIFUGACION
CENTRIFUGACION

- PRECIPIT. FRACCIONADA
DENSIDAD ENZIMA SOLUBILIDAD CON SALES O SOLVENTES
- PRECIPIT. ISOELECTRICA
- PARTI. LIQUIDO-LIQUIDO

PROPIEDADES DE
SUPERFICIE ESTABILIDAD

- C. DE ADSORCION
- ACCION DE LA TEMPERATURA
- C. DE AFINIDAD
- ACCION DE ACIDOS Y BASES
- C. HIDROFOBICA

31
CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO

 Se basa en la competencia entre la fase mvil y la muestra


por los sitios o grupos activos de una resina intercambiadora
de iones.

 La matriz est asociadareversiblemente a contraiones, los


que pueden ser intercambiados con otros iones sin alterar la
matriz

+
CARGA NETA DE LA PROTEINA

PUNTO
UNION A
ISOELECTRICO
INTERCABIADORES
ANIONICOS

2 4 6 8 10 pH
UNION A
INTERCABIADORES
CATIONICOS

32
1. Intercambiador en equilibrio con sus contraiones, muestra inyectada
2. Los contra-iones son tercambiados por compuestos de la muestra, se inicia la separacin utilizando
un gradiente.
3. Se separa uno de los compuestos de la mezcla, la que es separada por los contra-iones del buffer
4. El otro compuesto de la muestra es separado al aumentar la fueza inica del eluente (gradiente)
5. Se inicia la regeneracin y lo iones del eluente son intercambiados por los contra-iones

INTERCAMBIO INICO

33
GRUPOS FUNCIONALES USADOS EN
INTERCAMBIADORES DEIONES

+
+
+

-
-
-

Gradient or step elution.

34
CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE EXCLUSION

Conocida como cromatografa de permeacin o


exclusin, permite la separacin en funcin del
tamao molecular.

La diferencia entre permeacin y filtracin est en la


resistencia de los materiales empleados.
Emplea materiales rrgidos
CROMATOGRAFIA
DE PERMEACION
que pueden resistir presiones
muy elevadas

CROMATOGRAFIA Emplea materiales blandos


DE FILTRACION que no resisten presiones
mayores de 4 atmosferas
......

......

 Denominada tambin separacin por tamices moleculares. Est constituida por


partculas insolubles que forman una red tridimensional dependiendo la
accebilidad de las molculas de las dimensiones de la malla

 Las molculas muy grandes que se encuentran por encima del rango de separacin,
son eluidas primero, sin penetrara en la red. las otras molculas son eluidas por
orden de talla decreciente.

 Por debajo de un cierto peso molecular el tamiz pierde su poder de separacin y


todas las molculas son eluidas al mismo tiempo.

 Es una cromatografa liquido liquido, puesto que el soluto es repartido entre dos
fases liquidas, una al interior y otra al exterior de la red.

35
Partition between mobile
and stationary phases is Kav = 0
determined by Kav, the Kav = 0.5
average fraction of the
bead volume that is
accessible to the molecule. Kav = 0.8

Kav is a property of the


particular molecule and the
beads used.

If Kav = 0, molecule is completely excluded from pores and Ve = Vo.


If Kav > 0, Ve = Vo + volume of beads that molecule can enter.
Ve = Vo + Kav . stationary phase volume
Ve = V0 + Kav(Vt - Vo)

36
Also called \gel ltration", \size exclusion", \sizing" or
\molecular sieve"
chromatography.
Separates molecules on basis of size. Largest molecules
are excluded from
stationary phase and elute before smaller molecules.
Beads have a distribution of pore sizes.

Diferentes geles de CFSG

37
Hydrophobic Interaction
Chromatography

38
Cromatografa de Interaccin
Hidrofbica (HIC)
La Cromatograf
Cromatografa de Interacci
Interaccin Hidrof
Hidrofbica es una cromatograf
cromatografa de
adsorci
adsorcin, lo cual implica que se produce una interacci
interaccin entre los
grupos hidrof
hidrofbicos expuestos de las prote
protenas y los grupos
hidrof
hidrofbicos de la matriz cromatogr
cromatogrfica, proceso que resulta
termodin
termodinmicamente favorable.

Para el proceso de HIC se ha propuesto un mecanismo de m


mltiples
etapas por el cual las prote
protenas se adsorben a la matriz.
la primera etapa est
est determinada por el tipo de sal utilizada
(especialmente caotr
caotrpicas)
picas)
y la segunda etapa resulta ser una etapa de cin
cintica m
ms lenta que
depender
depender de la hidrofobicidad de la prote
protena y de matriz.

Protein binding to HIC adsorbents is promoted


by moderately high concentrations of salts,
which also have a stabilizing influence on
protein structure.

Elution is achieved by a linear or stepwise


decrease in the concentration of salt in the
adsorption buffer. Recoveries are often very
satisfactory.

39
The principle for protein adsorption to HIC
media is complementary to ion exchange
chromatography and gel filtration.

HIC is even sensitive enough to be influenced


by non-polar groups normally buried within
the tertiary structure of proteins but exposed
if the polypeptide chain is incorrectly folded
or damaged (e.g. By proteases).

This sensitivity can be useful for separating


the pure native protein from other forms.

Hofstee (6) and later Shaltiel (7) proposed


hydrophobic hromatography with the implicit
assumption that the mode of interaction between
proteins and the immobilized hydrophobic ligands is
similar to the self association of small aliphatic
organic molecules in water.

Porath et al. (10) suggested a salting-out effect in


hydrophobic adsorption,. They also suggested that . .
.the driving force is the entropy gain arising from
structure changes in the water surrounding the
interacting hydrophobic groups.

40
This concept was later extended and formalized by Hjertn (25) who based his
theory on the well known thermodynamic relationship: .

He proposed that the displacement of the ordered water molecules surrounding


the hydrophobic ligands and the proteins leads to an increase in entropy (S)
resulting in a negative value for the change in free energy (G) of the system.
This implies that the hydrophobic ligand-protein interaction is
thermodynamically favourable, as is illustrated in Fig.

Close to the surface of the hydrophobic ligand and solute (L and H),
the water molecules are more highly ordered than in the bulk water
and appear to shield
shield off
off the hydrophobic ligand and solute
molecules.
molecules. Added salt interacts strongly with the water molecules
leaving less water available for the shielding
shielding off
off effect,
effect, which is
the driving force for L and H to interact with each other.
other.

41
FACTORS AFFECTING HIC

The main parameters to consider when selecting


HIC media and optimizing separation processes on
HIC media are:

Ligand type and degree of substitution


Type of base matrix
Type and concentration of salt
pH
Temperature
Additives

Purification of Annexin V on Butyl Sepharose 4 Fast Flow and Phenyl


Sepharose 6 Fast Flow (high sub). (Work from Amersham Pharmacia Biotech,
Uppsala, Sweden).

42
CROMATOGRAF
CROMATOGRAFA EN FASE REVERSA

La cromatografa en fase reversa (RPC) permite separar


molculas en base a su polaridad.

La fase estacionaria es de partculas de slica qumicamente


modificadas con hidrocarburos saturados, insaturados o
aromticos de diferentes tipos.

Esto convierte a la fase estacionaria en una matriz apolar.


Por lo tanto, para este tipo de cromatografas se emplean
mezclas de solventes polares, tales como agua, acetonitrilo,
acetato de etilo, acetona y alcoholes alifticos.

Este tipo de cromatografa ha sido tambin llamada


como cromatografa de interaccin hidrofbica
(HIC). En general, este ltimo trmino se ha
empleado para referirse a las aplicaciones en las
que emplean substituyentes y matrices compatibles
con fluidos biolgicos.

Por tanto, el termino HIC es comn cuando se


habla de purificacin de protenas y carbohidratos,
en tanto que RPC es ms empleado para referirse
a la separacin de molculas en sistemas que son
inadecuados para la separacin de
macromolculas biolgicas.

43
Las molculas se retienen en la columna en
virtud de las interacciones hidrofbicas que
establecen con la slica modificada.

Aunque, las interacciones hidrofbicas son


en general bastante dbiles, son tambin a
menudo muy numerosas y para elur las
molculas es casi siempre necesario
disminuir la polaridad del disolvente; para
ello se puede substituir el agua de la fase
mvil con un solvente orgnico cuya
concentracin se va aumentando
gradualmente.

44
Debido a diversas limitaciones pr
prcticas de la cromatograf
cromatografa
de capa fina en fase reversa, entre las que destaca el costo de
usar placas no reutilizables de una matriz dif
difcil de sintetizar,
la cromatograf
cromatografa en fase reversa ha sido adaptada para el uso
de columnas.

La versatilidad y eficiencia de este tipo de cromatograf


cromatografa se
ha visto incrementada con el uso de sistemas de alto
desempe
desempeo (HPLC, del ingl ingls "High
"High Performance Liquid
Chromatography")
Chromatography") que utilizan alta presi
presin para mejorar la
resoluci
resolucin y reducir los tiempos de separaci
separacin.

Los sistemas de alto desempe


desempeo pueden tambi
tambin emplearse en
otros tipos de cromatograf
cromatografas, de manera que para referirse a
cromatografa en fase reversa en sistemas de alto
la cromatograf
desempe
desempeo se emplea la abreviatura HPLC-
HPLC-RPC. Tambi
Tambin

Cromatografa en RP de un extracto decompuestos fenlicos


de papa

5
Compuesto Concentracin (mg/100 g)

1 Derivado de cido clorognico* 0.51


2 Derivado de cido clorognico* 1.38
3 Derivado de cido clorognico* 0.21
4 Derivado de cido clorognico* 3.76
5 Acido clorognico 38.26
6 cido cafeico 1.25
7 Derivado de cido clorognico* 0.76
Total
46.13

4
2 6
1 3 7

0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00

Minutes

45
CROMATOGRAFIA
DE AFINIDAD

CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD

Affinity chromatography separates proteins on the basis of a


reversible interaction between a protein (or group of proteins)
and a specific ligand coupled to a chromatographic matrix.

The technique offers high selectivity, hence high resolution, and


usually high capacity for the protein (s) of interest.

Purification can be in the order of several thousand-fold and


recoveries of active material are generally very high.

Affinity chromatography is unique in purification technology


since it is the only technique that enables the purification of a
biomolecule on the basis of its biological function or individual
chemical structure.

46
CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD

Purification that would otherwise be time-


time-consuming, difficult or
even impossible using other techniques can often be easily
achieved with affinity chromatography.

The technique can be used to separate active biomolecules from


denatured or functionally different forms, to isolate pure
substances present at low concentration in large volumes of
crude sample and also to remove specific contaminants.

Principles of affinity chromatography

47
CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD

PURIFICACION EZIMATICA POR


CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD

ADICION DE UN
MODIFICACION DEL PH INHIBIDOR
O FUERZA IONICA

TAMPON DE
EQUILIBRIO
DIALISIS

L: LIGANDO INMOBILIZADO
I: INHIBIDOR COMPETITIVO
E: ENZIMA

48
TECNICAS EMPLEADAS EN EL CONTROL DE LA CALIDAD E UNA
ENZIMA PURIFICADA

Electroforesis (SDS, SDS-PAGE),


Determinacin de: C. de filtracin sobre gel,
Actividad, C. de filtracin sobre
Electrofocalizacin, gel
Actividad especfica, Ultracentrifugacin Anlisis de sedimen-
Actividad(s) de tacin por ultracentri-
contaminante(s) fugacin
Presin osmtica
HOMOGENIDAD Coeficiente de difusin

2
ACTIVIDAD 1 3
BIOLGICA ENZIMA PESO MOLECULAR
Y ESPECIFICA PURIFICADA
3
4 3
PRESENTACION (libre
, inmovilizada), actividad POLIMORFISMO COMPOSICION Y
y concentrac. SECUENCIA DE
Estandarizadas AMINOACIDOS
Estudio de estabilidad,
Adaptacin a su utili- PM de las sub-
zacin posterior nidades por SDS-
PAGE

49
ANALISIS DE ELECTROFORESIS DE L A PG DE K.
MARXIANUS (KF) Y DE LA CEPA MUTANTE KF 28
SOMETIDA A UN PROCESO DE PURIFICACION

A B C D

St KF KF28 KF KF28 KF KF28 KFKF28

SDS-PAGE PAGE DETE. ACT. ENZ ISOELEC.

50