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PURIFICACION
DE METABOLITOS
DOWNSTREAM PROCESSING
Introduccin
Downstream processing, conjunto de operaciones unitarias, empleadas
para la recuperacion de los productos dentro del proceso biotecnologico
1
ESQUEMA DE LA PRODUCCION E INTEGRACION
DE LAS TECNICAS BIOTECNOLOGICAS
FERMENTADOR
EXTRACCION Y
PURIFICACION
BIO-REACTOR
PRE-CULTIVO PRODUCTOS
CELULAS Alimentarios
Farmacuticos
Energa
Qumicos
Microfiltracin
Optimizacin
Clulas y enzimas
Manipulacin
tangencial
inmovilizadas
Ultrafiltracin
gentica
Cromatografa
liquida
preparativa,
HPLC.
2
TYPICAL TYPES OF DOWNSTREAM PROCESSING OPERATIONS
3
Relationship between the product concentration
in the starting material and the selling price.
[From Dwyer, J. L. (1984). Biol. Technol.
II
III
4
Separation of cells and medium
5
Separation of Cells
Precipitation/flocculation
Filtration
Centrifugation
Cell Disruption
Chemical: alkali, organic solvents, detergents
Enzymatic: lysozyme, glucanases, chitinase
Physical: osmotic shock, freeze/thaw
Mechanical: sonication, homogenization,
wet milling, French press
6
METODOS EMPLADOS PARA LA RUPTURA
CELULAR
7
Procedimientos Mecnicos
Procedimientos
Procedimientos Mec
Mecnicos
8
Chemical Disruption
Detergents such as Trition X-
100 can permeabilize cells by
solubilizing membranes.
9
.High Pressure Homogenizers.
Homogenizers.
Homogenization
Cells are placed in a closed
vessel (usually glass). A tight
fitting plunger is inserted and
rotated with a downward
force. Cells are disrupted as
they pass between the plunger
and vessel wall.
10
Bead Mills
Bead mills have been adapted from industry where they are used for
fine grinding of materials.
The chamber is partially filled with glass beads. During operation, the
beads are agitated by high-speed rotation of the impellers.
French Press
11
Otros Procedimientos no Mecnicos
Lsis Enzim
Enzimtica
12
CHOICE OF DISRUPTION METHODS
En resumen
Pellet Centrifuge
(discard)
Cell-
Cell-Free Lysate
Supernatant Proteins, Nucleic Acids,
Small Molecules
Unwanted
Molecules
Multiple
Purification Steps
Pure Protein
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DEFINICION
Es una tcnica utilizada en la separacin de los componentes de un
fluido, que fluye bajo presin sobre la superficie de la membrana
(separacin tangencial).
Comprende un grupo de procesos, que incluyen:
Microfiltracin, Ultrafiltracin,
Osmosis inversa y Nanofiltracin.
Alimentacin Retentado
Los compuestos
pequeos pasan a travs
de la membrana,
Permeado
14
MICROFILTRACIN: RETENTADO
Rango de filtracin: 0.1 - 10 m
Presin: 0.2 - 2 bar
PMS: Sobre 1000,000 Da ALIMENTACION
Retiene: Virus,bacterias, coloides PERMEADO
slidos en suspensin
ULTRAFILTRACIN: RETENTADO
Rango de filtracin: 0.001 - 0.1 m
Presin: 1-10 bar (10 - 20 bar,
posible)
PMS: 500 - 500,000 Da ALIMENTACION
PERMEADO
Retiene: Macromolculas, Virus,
bacterias, coloides, slidos en
suspensin
RETENTADO
OSMOSIS INVERSA:
Rango de filtracin: 0.0001-0.001 m
Presin: 20-80 bar
ALIMENTACION
PMS: Bajo 50n Da PERMEADO
Retiene: Micro y macromolculas
Virus, bacterias, coloides, slidos en
suspensin
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Classification of membrane separation
processes for liquid systems
16
Type of membrane process for several
products
La filtraci
filtracin tangencial es m
ms
eficiente.
17
TIPOS DE MEMBRANA
18
CARACTERISTICAS DE LAS MEMBRANAS
Permeabilidad
Selectividad
Resistencia: qumica, trmica y mecnica
PERMEABILIDAD
SELECTIVIDAD
19
Para molculas cuya masa se
encuentra en la zona de ruptura, se
define La tasa de retencin o tasa
1.2
de rechazo, dada por :
1.0
R = 1 - Cp/Ca 1 2
0.8
Retencin total: R = 1, Cp = 0
R
0.6
Retencin nula: R = 0, Ca = Cp
0.4
0.2
Mientras ms estrecha sea la zona 0.0
de ruptura, mayor es la selectividad 0 1000 10000 100000
M
20
NWMC
RESISTENCIA
21
POLARIZACION Y DEPOSITO DE GEL SOBRE LAS MEMBRANAS
difusin. Esto se traduce en un aumento de la
Permeado
disminuyen el flujo a travs de la membrana. La
concentracin en soluto sobre la membrana
puede ser tan elevada que origina precipitacin
de sales y formacin de geles que pueden
colmatar la membrana.
Caudal de alimentacin
Temperatura
22
Tubular membranes
Tubular membranes
23
CONFIGURACION
DE PLATO Y
CARCASA
24
ESQUEMA DE PRODUCCION DE PROTEINA Y LACTOSA A PARTIR DE
SUERO, UTILIZANDO ULTRAFILTRACION Y OSMOSIS INVERSA
SUERO PRE-TRATADO
RETENTADO
OI
AGUA RETENTADO
UF
PASTEURIZACION
PERMEAD
O
LACTASA SECADO POR
ATOMIZACION
LACTOSA
CONCENTRADA OI
HIDROLISIS PROTEINA DE
SUERO
JARABE LACTOSA
HIDROLIZADO
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COMPARACION ENTRE LOS SISTEMAS DE CONCENTRACION DE SUERO POR
OSMOSIS INVERSA Y EVAPORACION AL VACIO
RETENTADO
ALIMENTACION
TANQUE DE
MODULO DE
FILTRACION
P1 P2
PERMEADO
26
PERMEADO
ALIMENTACION
TANQUE DE
MODULO DE
FILTRACION
P1 P2
Instalacion de funcionamiento
controlado mediante
captores de nivel PERMEADO
ALIMENTACION
TANQUE DE
MODULO DE
FILTRACION
P1 P2
Instalacion de funcionamiento
discontinuo
con bucle de recirculacion PERMEADO
27
DIAFILTRACION
Purificacin por
cromatografa
28
ASPECTOS A CONSIDERAR PARA LLEVAR A CABO UN
PROCESO DE PURIFICACION
MATERIA
PRIMA
ETAPA 2
FRACCIONAMIENTO
ANIMAL VEGETAL MICROBIANA
EXTRACTO
BRUTO
ETAPA 1
ETAPA 3
EXTRACCION
PURIFICACION
EXTRACTO ENZIMA
TOTAL PURA
29
Disposici
Disposicin de un sistema de cromatograf
cromatografa en columna
Desalado
C. de intercambio C. de filtracin
de iones C. de adsorcin
sobre gel
Ultrafiltracin
C. de filtracin C. de intercambio
C. de afinidad C. sobre hidroxiapatita sobre gel de iones
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ESTRATEGIA GENERAL PARA LA PURIFICACION DE ENZIMAS
Concentracin
Dilisis
C. de intercambio de iones
Concentracin
C. de filtracin sobre gel
C. de filtracin sobre gel
Concentracin y dilisis
ULTRAFILTRACION - ISOELECTROFOCALIZACION
DIALISIS
C. DE INTERCAMBIO - CROMATOFOCALIZACION
FILTRACION EN GEL DE IONES
P. MOLECULAR PUNTO
CARGA
ISOELECTRICO
ULTRACENTRIFUGACION
CENTRIFUGACION
- PRECIPIT. FRACCIONADA
DENSIDAD ENZIMA SOLUBILIDAD CON SALES O SOLVENTES
- PRECIPIT. ISOELECTRICA
- PARTI. LIQUIDO-LIQUIDO
PROPIEDADES DE
SUPERFICIE ESTABILIDAD
- C. DE ADSORCION
- ACCION DE LA TEMPERATURA
- C. DE AFINIDAD
- ACCION DE ACIDOS Y BASES
- C. HIDROFOBICA
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CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO
+
CARGA NETA DE LA PROTEINA
PUNTO
UNION A
ISOELECTRICO
INTERCABIADORES
ANIONICOS
2 4 6 8 10 pH
UNION A
INTERCABIADORES
CATIONICOS
32
1. Intercambiador en equilibrio con sus contraiones, muestra inyectada
2. Los contra-iones son tercambiados por compuestos de la muestra, se inicia la separacin utilizando
un gradiente.
3. Se separa uno de los compuestos de la mezcla, la que es separada por los contra-iones del buffer
4. El otro compuesto de la muestra es separado al aumentar la fueza inica del eluente (gradiente)
5. Se inicia la regeneracin y lo iones del eluente son intercambiados por los contra-iones
INTERCAMBIO INICO
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GRUPOS FUNCIONALES USADOS EN
INTERCAMBIADORES DEIONES
+
+
+
-
-
-
34
CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE EXCLUSION
......
Las molculas muy grandes que se encuentran por encima del rango de separacin,
son eluidas primero, sin penetrara en la red. las otras molculas son eluidas por
orden de talla decreciente.
Es una cromatografa liquido liquido, puesto que el soluto es repartido entre dos
fases liquidas, una al interior y otra al exterior de la red.
35
Partition between mobile
and stationary phases is Kav = 0
determined by Kav, the Kav = 0.5
average fraction of the
bead volume that is
accessible to the molecule. Kav = 0.8
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Also called \gel ltration", \size exclusion", \sizing" or
\molecular sieve"
chromatography.
Separates molecules on basis of size. Largest molecules
are excluded from
stationary phase and elute before smaller molecules.
Beads have a distribution of pore sizes.
37
Hydrophobic Interaction
Chromatography
38
Cromatografa de Interaccin
Hidrofbica (HIC)
La Cromatograf
Cromatografa de Interacci
Interaccin Hidrof
Hidrofbica es una cromatograf
cromatografa de
adsorci
adsorcin, lo cual implica que se produce una interacci
interaccin entre los
grupos hidrof
hidrofbicos expuestos de las prote
protenas y los grupos
hidrof
hidrofbicos de la matriz cromatogr
cromatogrfica, proceso que resulta
termodin
termodinmicamente favorable.
39
The principle for protein adsorption to HIC
media is complementary to ion exchange
chromatography and gel filtration.
40
This concept was later extended and formalized by Hjertn (25) who based his
theory on the well known thermodynamic relationship: .
Close to the surface of the hydrophobic ligand and solute (L and H),
the water molecules are more highly ordered than in the bulk water
and appear to shield
shield off
off the hydrophobic ligand and solute
molecules.
molecules. Added salt interacts strongly with the water molecules
leaving less water available for the shielding
shielding off
off effect,
effect, which is
the driving force for L and H to interact with each other.
other.
41
FACTORS AFFECTING HIC
42
CROMATOGRAF
CROMATOGRAFA EN FASE REVERSA
43
Las molculas se retienen en la columna en
virtud de las interacciones hidrofbicas que
establecen con la slica modificada.
44
Debido a diversas limitaciones pr
prcticas de la cromatograf
cromatografa
de capa fina en fase reversa, entre las que destaca el costo de
usar placas no reutilizables de una matriz dif
difcil de sintetizar,
la cromatograf
cromatografa en fase reversa ha sido adaptada para el uso
de columnas.
5
Compuesto Concentracin (mg/100 g)
4
2 6
1 3 7
Minutes
45
CROMATOGRAFIA
DE AFINIDAD
CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD
46
CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD
47
CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD
ADICION DE UN
MODIFICACION DEL PH INHIBIDOR
O FUERZA IONICA
TAMPON DE
EQUILIBRIO
DIALISIS
L: LIGANDO INMOBILIZADO
I: INHIBIDOR COMPETITIVO
E: ENZIMA
48
TECNICAS EMPLEADAS EN EL CONTROL DE LA CALIDAD E UNA
ENZIMA PURIFICADA
2
ACTIVIDAD 1 3
BIOLGICA ENZIMA PESO MOLECULAR
Y ESPECIFICA PURIFICADA
3
4 3
PRESENTACION (libre
, inmovilizada), actividad POLIMORFISMO COMPOSICION Y
y concentrac. SECUENCIA DE
Estandarizadas AMINOACIDOS
Estudio de estabilidad,
Adaptacin a su utili- PM de las sub-
zacin posterior nidades por SDS-
PAGE
49
ANALISIS DE ELECTROFORESIS DE L A PG DE K.
MARXIANUS (KF) Y DE LA CEPA MUTANTE KF 28
SOMETIDA A UN PROCESO DE PURIFICACION
A B C D
50