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Mtodos para determinao da digestibilidade aparente de dietas

para camaro marinho suplementadas com probitico


Celso BuglioneNeto(1), Jos Luiz Mourio(2), Felipe do Nascimento Vieira(2), Bruno Corra da Silva(2),
Adolfo Jatob(3), Walter Seiffert(2), Dbora Machado Fracalossi(4) e Edemar Andreatta(2)

Usina Hidreltrica de Itaipu, Avenida Tancredo Neves, no 6.731, CEP85856970Foz do Iguau,PR. Email:celsoc@itaipu.gov.br
(1)

Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), Centro de Cincias Agrrias (CCA), Departamento de Aquicultura (AQI), Laboratrio de
(2)

Camares Marinhos, Beco dos Coroas, Barra da Lagoa, CEP88061600Florianpolis,SC. Email:mourino@lcm.ufsc.br, vieirafn@lcm.ufsc.br,
bcs85@hotmail.com, seiffert@cca.ufsc.br, andreata@mbox1.ufsc.br (3)Instituto Federal Catarinense, Campus Araquari, Rodovia BR280,
Km 27, CEP89245000Araquari,SC. Email:adolfo.jatoba@ifcaraquari.edu.br (4)UFSC, CCA, AQI, Laboratrio de Nutrio de Organismos
Aquticos, Rodovia Admar Gonzaga, no 1.346, CEP88034001Florianpolis,SC. Email:deboraf@cca.ufsc.br

ResumoO objetivo deste trabalho foi determinar o mtodo de coleta de fezes mais adequado para camares
marinhos (Litopenaeus vannamei) na determinao do coeficiente de digestibilidade aparente da protena bruta
e da matria seca de dietas comerciais, e avaliar o efeito da suplementao de Lactobacillus plantarum na dieta
sobre o coeficiente de digestibilidade aparente da protena, da energia e da matria seca. Foram testados trs
sistemas de coletas de fezes: decantao, sifonamento e dissecao dos animais. A coleta por decantao foi
o sistema mais adequado para a determinao in vivo dos coeficientes de digestibilidade aparente da protena
bruta e da matria seca das dietas, por apresentar baixo grau de lixiviao das fezes e por ser de fcil execuo.
Noscamares alimentados com a dieta suplementada comL. plantarum, foi observado maior coeficiente de
digestibilidade aparente da protena (84,180,35%) e da energia (81,280,16%), quando comparado ao grupo
controle (82,731,01 e 78,630,93%, respectivamente). Ouso deL. plantarum como aditivo probitico na rao
pode trazer benefcios nutricionais aL. vannamei, com melhor aproveitamento dos nutrientes.
Termos para indexao: Lactobacillus plantarum, Litopenaeus vannamei, digestibilidade, nutrio.

Methods for determining the apparent digestibility of diets


for marine shrimp supplemented with probiotic
Abstract The objective of this work was to determine the most adequate feces collection method for sea
shrimp (Litopenaeus vannamei) in the determination of the apparent digestibility coefficients of crude protein
and dry matter of commercial diets, and to evaluate the effect of supplementation of Lactobacillus plantarum
to the diet on the apparent digestibility coefficient of protein, energy, and dry matter. Three feces collection
methods were tested: decanting, siphoning, and animal dissection. Decanting was the method best suited for
the in vivo determination of the apparent digestibility coeffcients of crude protein and dry matter of commercial
diets, since it promoted lower nutrient leaching from feces and was easy to perform. Shrimp fed the diet
supplemented with probiotic showed higher apparent digestibility of crude protein (84.180.35%) and energy
(81.280.16%) when compared to the control group (82.731.01 and 78.630.93%, respectively). The use
ofL. plantarum as a probiotic additive in shrimp diets can provide nutritional benefits toL. vannamei, with
better nutrient utilization.
Index terms: Lactobacillus plantarum, Litopenaeus vannamei, digestibility, nutrition.

Introduo das fontes proteicas (Lemos et al., 2009). O uso de


aditivos alimentares, como os probiticos, torna-se
Com a intensificao dos sistemas de cultivo e a uma alternativa para aumentar a digestibilidade dos
rpida expanso da carcinicultura, h uma demanda nutrientes na dieta, concomitantemente ao aumento
cada vez maior por dietas nutricionalmente balanceadas da imunidade dos animais, o que diminui os custos da
e com custo acessvel (BautistaTeruel et al., 2003). carcinicultura (OchoaSolano & OlmosSoto, 2006;
Arao representa cerca de 60% dos custos variveis Vieira etal., 2008; Zhou etal., 2009).
nos cultivos de camaro, nos sistemas semiintensivos Vieira (2010), ao avaliar a bactria Lactobacillus
(Lawrence & Lee, 1997). Portanto, tem-se buscado plantarum [(OrlaJensen) Bergey et al.] do trato
reduzir o custo da rao, com o melhor aproveitamento intestinal de Litopenaeus vannamei (Boone, 1931),

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observou efeito probitico, evidenciado pelo aumento seca de dietas comerciais, e avaliar a suplementao de
da sobrevivncia e da imunidade dos camares aps Lactobacillus plantarum na dieta sobre o coeficiente
desafio experimental com Vibrio harveyi [(Johnson and de digestibilidade aparente da protena, da energia e da
Shunk 1936) Baumann etal. 1981], alm de melhoria matria seca.
na eficincia alimentar em animais cultivados em
campo. Porm, no foi comprovado se o aumento da Material e Mtodos
eficincia alimentar se deu pela maior digestibilidade
dos ingredientes da dieta. Os experimentos foram realizados no Laboratrio
Diversos estudos avaliaram a utilizao de de Camares Marinhos da Universidade Federal de
probiticos para melhorar a capacidade digestiva de Santa Catarina (UFSC), em Florianpolis.
animais aquticos (Burr et al., 2005). A adio de Para a determinao do tempo de passagem e
bactrias do gnero Bacillus emL. vannamei aumentou esvaziamento gstrico, foram utilizados 30 camares
a atividade de amilases e proteases dos camares, o que com peso mdio de 8,00,5 g. Os camares foram
melhorou a digesto e a absoro dos alimentos, que, alimentados com rao comercial e, aps o dcimo
por sua vez, contribuiu para a melhoria no crescimento dia, iniciou-se a alimentao com dieta contendo 0,5%
dos camares (Yu etal., 2009). de xido de cromo (Cr2O3) como marcador inerte
A digestibilidade in vivo em animais aquticos (Tabela1). Asfezes foram coletadas em intervalos de
baseada na determinao da quantidade do marcador 30 min, e, quando observada a presena da colorao
inerte como, por exemplo, o xido de cromo (Cr2O3) verde nas fezes, foi determinado o tempo de passagem.
nas fezes, o qual incorporado na rao. Entretanto, Para a determinao do tempo de esvaziamento
para o uso deste mtodo, essencial que se tenha um gstrico, suspendeu-se o fornecimento da dieta e
sistema eficiente de coleta de fezes no meio aqutico monitorou-se a produo de fezes de hora em hora, at
(MartnezPalacios etal., 2001). o trmino da produo de fezes.
O sistema mais simples de coleta fecal o Para a avaliao dos mtodos de coletas de fezes,
sifonamento do material do fundo do tanque ou aqurio. foram utilizados 120 camares com peso mdio de
Noentanto, esta tcnica est sujeita a numerosos erros, 8,00,5 g. Foram testados trs sistemas de coleta
entre eles a lixiviao dos nutrientes e da matria das fezes, em triplicata: sedimentao, em tanques
seca para a gua, o que pode superestimar os valores cilindrocnicos com tela; sifonamento, em tanques
alcanados (Mourio & De Stfani, 2006). circulares, com fundo parablico; e coleta por
J o Guelph (coleta por decantao), um sistema dissecao dos animais.
eficiente desenvolvido para peixes, que utiliza um A densidade utilizada foi de 20 animais por tanque
fluxo de gua com baixa velocidade, de forma que as de 100 L, a qual foi determinada em ensaios anteriores.
fezes decantem mais rapidamente no centro do tanque, Foram avaliados os coeficientes de digestibilidade
para serem recolhidas em tubo coletor. Este sistema aparente da protena bruta e da matria seca da dieta
funciona bem para diversos organismos aquticos e, comercial.
portanto, amplamente utilizado (Cho et al., 1985; Antes de iniciar a coleta de fezes, os camares
Mourio & De Stfani, 2006). foram aclimatados s condies experimentais por dez
Contudo, ensaios de digestibilidade in vivo dias, tendo recebido rao comercial suplementada
apresentam algumas peculiaridades, pois os camares
tm hbitos bentnicos, so coprfagos e alimentam-
Tabela 1. Composio centesimal das dietas utilizadas nos
se lentamente (Smith & Tabrett, 2004). Como experimentos.
consequncia, a digestibilidade em camares foi Frao Rao comercial Controle Probitico
avaliada por sifonamento das fezes (CruzSurez etal., Protena bruta (g kg-1) 346,70,5b 360,34,7a 362,22,5a
2009; TerrazasFierro etal., 2010). Extrato etreo (g kg-1) 75,01,2 74,21,6 74,70,8
O objetivo deste trabalho foi determinar o mtodo Fibra em detergente cido (g kg-1) 50,10,4 45,80,7 45,50,8
Matria mineral (g kg-1) 130,21,5 129,81,3 128,11,2
de coleta de fezes mais adequado para camares Matria seca (g kg-1) 954,83,4b 935,95,4a 936,410,9a
marinhos na determinao do coeficiente de xido de cromo (g kg-1) 0,5% 0,5%
digestibilidade aparente da protena bruta e da matria Energia (kcal) 3.259,355,9b 3.775,9109,5a 4080,1222,4a

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com 0,5% de xido de cromo como marcador inerte. do fundo do tanque com o auxlio de mangueira de
Arao foi oferecida em trs alimentaes dirias (s silicone (5 mm de dimetro) e uma tela de 40 m,
8h, s 14h e s 20h), em bandejas, de forma a totalizar em intervalos de 30 min, para evitar a lixiviao de
3% da biomassa total de cada tanque. O tempo de nutrientes para a gua. Asfezes eram retiradas da tela
alimentao foi de 40 min, e, aps este perodo, a com o auxlio de uma pina e armazenadas em potes de
bandeja de alimentao era retirada para a higienizao plstico, a 20C, at anlise.
dos tanques antes da coleta das fezes. Operodo total Para a coleta de fezes por dissecao, foram
de coleta foi de 15dias. utilizados trs tanques circulares de 8.000L, contendo
Para a coleta por decantao, foram utilizados trs 200 camares por tanque (n = 600), com renovao
tanques cilindrocnicos com capacidade de 100 L e constante, fluxo de gua a 1L min1 e temperatura de
temperatura constante de 28C (Figura 1), contendo 28C. Aps sete dias de aclimatao, estes camares
gaiolas povoadas com 20 camares cada uma (n = 60). foram alimentados durante dez dias com rao
As fezes foram coletadas na extremidade inferior do contendo 0,5% de xido de cromo. Aps este perodo,
tanque, onde permaneciam depositadas em tubos de os camares foram abatidos por hipotermia, com
50 mL, acoplados a um registro de esfera. Os tubos
uso de 2kg de gelo e 1L de gua para cada quilo de
contendo as fezes eram retirados em intervalos de
camaro. Foi realizado um corte no ltimo segmento
30 min e contados a partir da retirada da bandeja de
abdominal de cada camaro, e as fezes contidas no
alimentao, para no haver lixiviao de nutrientes
intestino foram retiradas aps leve presso no sentido
para a gua. As fezes coletadas eram, ento,
do ltimo segmento, de modo a forar sua sada pelo
armazenadas a 20C at anlise.
corte. O material foi coletado com o auxlio de uma
Para a coleta por sifonamento (Figura 1), foram
utilizados trs tanques cilindrocnicos com capacidade pina, colocado em um recipiente e congelado a 20C
de 100L e temperatura constante de 28C. Cada tanque at anlise.
continha uma gaiola, povoada com 20 camares A cepa probitica, Lactobacillus plantarum
(n = 60), um cano central e um dreno com tela de (CPQBA 00707 DRM01), utilizada para os ensaios,
500 m para renovao da gua. Nestes tanques, a foi isolada de camares marinhos (Vieira, 2010) e
renovao de gua foi constante (1Lmin1). Otanque cedida pelo Laboratrio de Camares Marinhos da
tinha fundo cnico, e as fezes se acumulavam prximo UFSC. A cepa bacteriana foi repicada em tubos de
ao dreno central, em razo da corrente circular dentro ensaio contendo caldo de Man, Rogosa e Sharpe (MRS,
do tanque. Asfezes foram coletadas por sifonamento Difco, Detroit, MI, EUA) e incubada com agitao
contnua de 200 rpm, a 35C, por 24 horas. Acontagem
A
de unidades formadoras de colnias (UFC) em Agar
Entrada de gua
MRS foi de 1x109 UFCmL1.
Gaiola Para o preparo das dietas experimentais, foi
utilizada rao comercial contendo 0,5% de xido
Elevador de ar

Sada de
gua B
Fluxo de gua Entrada de gua de cromo, a qual foi aspergida com 200 mL kg1 de
circular
Gaiola inculo das bactrias cidolcticas e desidratada, a
Mangueira de sifonamento

Elevador de ar

35C, por 24 horas (dieta probitica). Trs amostras


Sada de gua

Fluxo de gua de 1 g da rao seca foram maceradas em 1 mL de


soluo salina (1,5%NaCl) estril e diludas em srie
circular

(1:10). As diluies 105 at 109 foram semeadas


em placas com meio de cultura MRS e incubadas a
Tela p/ coleta de fezes
35C, por 48 horas, para estimar a contagem de UFC
Coletor
de bactrias probiticas na dieta. A rao controle
passou pelo mesmo processo da rao suplementada
Figura 1. Mtodos de coleta de fezes de camares marinhos. com probiticos; porm, foi aspergida somente com
A, sistema de coleta por decantao; B, sistema de coleta por meio de cultura estril (dieta controle). Aps esses
sifonamento. procedimentos, as dietas experimentais, controle e

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probitica foram submetidas a anlises de composio digestibilidade da energia (CDAE), foi utilizada a
centesimal (Tabela1). equao (Nose, 1960): CDA (% ) = 100 - (100 %
Para cada tratamento (dieta com probitico e marcador na dieta/% marcador nas fezes % protena
controle), foram utilizados quatro tanques de formato ou energia nas fezes/%protena ou energia na dieta.
cilindrocnico com capacidade para 100L, cada um Todos os dados foram submetidos ao teste de
contendo 20camares, com peso mdio de 100,02g. Bartlett e apresentaram homocedasticidade. Osdados
Omtodo de coleta de fezes foi o mesmo utilizado no de avaliao dos diferentes mtodos de coleta foram
sistema de decantao. Coletou-se um total de 6g de submetidos anlise de varincia e, posteriormente, ao
fezes (peso seco), por rplica. teste de Tukey. Osdados de digestibilidade aparente das
Para determinar a eficincia da colonizao do dietas suplementadas com probitico foram analisados
probitico nos animais, foram retiradas amostras de pelo teste t. Foram admitidas diferenas significativas
trato digestrio, aps total esvaziamento gstrico. a 5% de probabilidade.
Estas amostras foram lavadas com soluo salina
estril e maceradas, para serem diludas na proporo Resultados e Discusso
1:1, em soluo salina estril (1,5% NaCl), e diludas
Para camares L. vannamei com aproximadamente
em srie 1:10. Asdiluies 105 e 109 foram semeadas
8 g, o tempo de passagem mdio foi de 424 min
em placas com meio de cultura MRS e incubadas a
e o tempo de esvaziamento gstrico de 37615
35C, por 48horas, para estimar a contagem de UFC
min. Contudo, a maior produo de fezes ocorreu
de bactrias cidolcticas totais presentes no trato
1 hora aps o incio da defecao e terminou aps,
digestrio.
aproximadamente, 6 horas. Segundo Cockcroft &
Para a determinao do coeficiente de digestibilidade
McLachlan (1986), juvenis e adultos de Macropetasma
aparente de protena, energia e matria seca, as anlises
africanus (Balss, 1913) esvaziam o intestino entre
dos teores de protena bruta, energia e matria seca das
2 e 4 horas aps a captura. J para Penaeus subtilis
raes e das fezes dos camares seguiram a metodologia
(PrezFarfante, 1967), a taxa mdia de esvaziamento
descrita pela AOAC (Cunniff, 1999). A matria seca
gstrico de 28% por hora, o que totaliza 3 horas e 34
foi obtida aps secagem a 105C at peso constante; min (Nunes & Parsons, 2000). ParaL. vannamei de 14
a cinza, aps queima a 550C; a protena bruta, pelo a 22g, o tempo de esvaziamento gstrico foi de at 4
mtodo Kjeldahl (N x 6,25); o extrato etreo, pelo horas e 18 min (258 min) (Faroongsarmg etal., 2007).
mtodo Soxleth, aps hidrlise cida; e a fibra, em No foram observadas diferenas significativas
detergente cido. Aenergia bruta foi determinada em quanto ao CDAPB entre o sistema de coleta por
bomba calorimtrica adiabtica, e o xido de cromo, sifonamento e decantao (Tabela 2). Este resultado
pelo mtodo colorimtrico proposto por Bremer Neto evidencia que os dois sistemas so adequados para a
et al. (2003) (Tabela 1). Nas fezes, foram analisados estimativa do CDAPB. Entretanto, houve diferena
matria seca, protena bruta, energia bruta e xido de significativa entre estes dois sistemas em relao ao
cromo. Para a quantificao do xido de cromo, as CDAMS, e o sistema de sifonamento foi 2% superior
amostras das dietas e das fezes (0,1g) foram digeridas ao de decantao (Tabela 2). Dessa forma, o sistema
com 3mL de cido ntrico e 2mL de cido perclrico
em bales Kjeldahl, a 400C, por 40min, at obteno
Tabela 2. Mdiadesvio-padro dos coeficientes de
de uma colorao amarelada. Aps diluio em 1 L
digestibilidade aparente de protena e matria seca em
de gua destilada, a absorbncia foi lida (550nm) e a camares marinhos, Litopenaeus vannamei, nos trs
concentrao de xido de cromo foi determinada pela sistemas de coleta de fezes(1).
comparao com a dosagem de uma curvapadro.
Sistema de coleta de fezes Coeficiente de digestibilidade aparente (%)
Para a determinao do coeficiente de digestibilidade Protena Matria seca
da matria seca (CDAMS), foi utilizada a equao Decantao 81,830,59a 59,530,69a
(Belal, 2005): CDA (% ) = 100 - 100 % indicador na Sifonamento 82,740,63a 61,530,84b
rao/%indicador nas fezes. Dissecao 55,650,78b 54,211,19c
Para a determinao do coeficiente de digestibilidade Mdias seguidas de letras diferentes diferem pela anlise de varincia, a
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da protena bruta (CDAPB) e do coeficiente de 5% de probabilidade.

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de coleta por sifonamento apresentou maior grau de dos animais frente resistncia aps desafio com
desintegrao das fezes, pois quando estas eram retidas V.harveyi.
na tela de coleta ficavam sujeitas a maior lixiviao O grupo de camares que recebeu dieta suplementada
pelo fluxo de gua corrente, o que resultou em um comL. plantarum apresentou maior CDAPB e CDAE,
maior CDAMS para este sistema de coleta. em comparao ao controle. No foram observadas
O sistema de coleta por dissecao apresentou menor diferenas significativas quanto ao CDAMS entre os
CDAPB e CDAMS quando comparado aos outros camares alimentados com dieta suplementada ou no
dois sistemas (Tabela2). Neste mtodo, foi observada com probitico (Tabela3).
maior dificuldade para obteno da quantidade mnima Esses aumentos no CDAPB e no CDAE podem
de fezes, para anlises de xido de cromo e protena estar relacionados a uma melhoria no equilbrio da
bruta, em razo da pequena quantidade de material microbiota no intestino ou a uma maior disponibilidade
encontrada nos segmentos finais do trato digestrio. dos nutrientes da dieta gerada por meio da degradao
Os resultados obtidos com esta metodologia podem enzimtica pela cepa probitica, L. plantarum. Esta
estar subestimados pela possvel contaminao mesma cepa de bactria cidolctica foi caracterizada
das fezes com hemolinfa ou mucosa do intestino. in vitro quanto produo de protease extracelular
Resultado semelhante foi verificado por Mourio & alcalina (1.170Umg1 de protena) e cida (3,8Umg1
De Stfani (2006), ao avaliar mtodos de coleta de de protena) (Souza, 2007). Aalta produo da protease
fezes para determinao da digestibilidade proteica em alcalina desta cepa pode explicar maiores valores
rtouro [Rana catesbeiana (Shaw, 1802)]. Deacordo de CDAPB e CDAE para camares suplementados
com estes autores, a presso durante a dissecao comL. plantarum.
pode provocar, ocasionalmente, injrias nas vsceras e Wang (2007) observou maior atividade enzimtica em
promover a adio de nitrognio endgeno s fezes na camares alimentados com dieta contendo probiticos,
forma de muco e clulas epiteliais, o que diminui os o que melhorou a digesto de protenas, carboidratos,
valores da digestibilidade. lipdios e celulose. Efeitos similares foram descritos em
Assim, o sistema de coleta por decantao foi o peixes e camares, em que as atividades enzimticas
que se adequou melhor s condies experimentais, aumentaram com o fornecimento de probiticos na
para a determinao in vivo do CDAPB e do CDAMS dieta, o que ocasionou aumento da digestibilidade da
dieta (TovarRamrez et al., 2004; ZiaeiNejad et al.,
de dietas para camares marinhos, pois foi de fcil
2006; Suzer etal., 2008; Zhou etal., 2009).
execuo, promoveu menor grau de lixiviao das fezes,
Com a intensificao da produo de camares em
comparado ao sinfonamento, e no h a necessidade de
cativeiro, aspectos nutricionais e sanitrios devem ser
sacrifcio dos animais, como no sistema de dissecao.
priorizados para aperfeioar o processo produtivo e
MartnezPalacios etal. (2001) tambm relataram que
diminuir o risco de perda de produo por enfermidades.
o mtodo Guelph (coleta por decantao) foi mais
O uso de bactrias cidolcticas como aditivos
prtico e eficiente do que o mtodo de sifonamento
probiticos na rao pode se tornar uma alternativa
para determinao da digestibilidade de protena e
inovadora para a carcinicultura, pois alm de trazer
lipdio, para camaro marinho.
benefcios nutricionais ao hospedeiro, com um melhor
Aps o processo de incorporao da bactria
na dieta, a contagem de UFC em Agar MRS foi
de 1,5x106 UFC g1, na rao com probitico, e de
1,4x106 UFC g1 no trato intestinal dos camares Tabela 3. Coeficientes de digestibilidade aparente de
marinhos alimentados com esta dieta. Entretanto, protena bruta, matria seca e energia de camares
os camares alimentados com a dieta controle no marinhos, Litopenaeus vannamei, alimentados com dietas
suplementadas ou no com o probitico Lactobacillus
apresentaram crescimento de bactrias cidolcticas
plantarum.
em Agar MRS. Vieira et al. (2008) comprovaram
Coeficiente de digestibilidade aparente (%) Controle Probitico
que o fornecimento de dietas contendoL. plantarum Matria seca 62,501,2 63,300,23
para L. vannamei aumenta a contagem de bactrias Protena 82,731,01 84,180,35(1)
cidolticas no trato intestinal dos camares, o que, Energia 78,630,93 81,280,16(1)
por sua vez, melhoria os parmetros imunolgicos Diferena significativa pelo teste t, a 5% de probabilidade.
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Recebido em 13 de julho de 2011 e aprovado em 28 de fevereiro de 2013

Pesq. agropec. bras., Braslia, v.48, n.8, p.1021-1027, ago. 2013


DOI: 10.1590/S0100-204X2013000800030

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