CROMATOGRAFIA

EN HPLC
CONTROL DE CALIDAD DE MEDICAMENTOS Y
ALIMENTOS

ROMERO VALLES DEBHORA

REYNA RENGIFO BELLA
 CROMATOGRAFIA
INTRODUCCION

Desde que la qumica se empez a usar con fines cuantitativos, surgi la necesidad de
buscar tcnicas ms especficas pues para separar compuestos de una mezcla compleja,
si estos son similares, y entre ms parecidos sean, la separacin es ms difcil.

La cromatografa fue descubierta por el qumico ruso Mikhail Tsuet quien, en 1906,
emple por primera vez el trmino cromatografa. Us columnas de adsorcin de
lquidos para separar pigmentos vegetales

Todo proceso cromatogrfico tiene como caracterstica la distribucin de los

componentes en dos fases; una mvil y una estacionaria, estas fases son inmiscibles. La
fase mvil es un lquido, un gas o un gas que funciona como liquido supercrtico, la fase
estacionaria generalmente se coloca en una columna cilndrica de dimensiones
apropiadas, adems la fase estacionaria es el cerebro del proceso de separacin y de su
escogencia depende el xito de este. Cada componente experimenta una afinidad
distinta por la fase estacionaria y as permanece en esta fase ms o menos tiempo;
cuando interacciona con la fase mvil sale de la estacionaria y es eluido o sea se
transporta en la fase mvil.

Todos los componentes de la muestra pasan en este proceso, pero como sus afinidades
por la fase estacionaria son diferentes, as permanecern tiempos diferentes en ella,
algunos sern eluidos primero, los ms rpidos y otros despus, el resultado final es que
se van a separar a lo largo del camino de migracin

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LA CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA EFICACIA O
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY
(HPLC)
Es un tipo de cromatografa en columna utilizada frecuentemente en bioqumica y
qumica analtica. El HPLC es una tcnica utilizada para separar los componentes de una
mezcla basndose en diferentes tipos de interacciones qumicas entre las sustancias
analizadas y la columna cromatogrfica.

Consiste en una fase estacionaria no polar (columna) y una fase mvil. Los componentes
de la solucin emigran de acuerdo a las interacciones no-covalentes de los compuestos
con la columna. Estas interacciones qumicas, determinan la separacin de los
contenidos en la muestra. La utilizacin de los diferentes detectores depender de la
naturaleza de los compuestos a determinar.

FENOMENOS QUE OCURREN EN LA CROMATOGRAFIA HPLC

ADSORCION: es un fenmeno de superficie que ocurre por la interaccin fsica o qumica
de un adsorbente sobre un adsorbato.

PARTICION: Es el fenmeno de reparto de un soluto en 2 fases distintas.

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INTERCAMBIO IONICO: Es un fenmeno generado por la interaccin electrosttica entre

molculas cargadas elctricamente.

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EXCLUSION: Es un fenmeno fsico que consiste ms que nada en separar molculas en
base a su tamao molecular

AFINIDAD: Se combina la alta especificidad de ciertas, molculas por un sustrato tales,

como Ab, enzimas, receptores, etc.

PRINCIPIOS DE LA TCNICA
En la cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una columna
que contiene a la fase fija. La separacin cromatogrfica en HPLC es el resultado de las
interacciones especficas entre las molculas de la muestra en ambas fases, mvil y
estacionaria

A diferencia de la cromatografa de gases, la cromatografa de lquidos de alto

rendimiento no est limitada por la volatilidad o la estabilidad trmica de la muestra.

La HPLC es capaz de separar macromolculas y especies inicas, productos naturales

lbiles, materiales polimricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de
alto peso molecular. Con una fase mvil lquida interactiva, otro parmetro se encuentra
disponible para la selectividad, en adicin a una fase estacionaria activa. La HPLC ofrece
una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor gama de estas
interacciones selectivas y ms posibilidades para la separacin.

TIPOS DE CROMATOGRAFIA EN HPLC

CROMATOGRAFA LIQUIDA FASE NORMAL

La fase estacionaria presenta puntos activos de alta polaridad y las interacciones que se
producen con el soluto son especficas del grupo activo. El componente menos polar es
el primero que se detecta.

La cromatografa de fase normal o normal phase HPLC (NP-HPLC) fue el primer tipo de
sistema HPLC utilizado en el campo de la qumica, y se caracteriza por separar los
compuestos sobre la base de su polaridad. Esta tcnica utiliza una fase estacionaria polar
y una fase mvil apolar, y se utiliza cuando el compuesto de inters es bastante polar.
El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase estacionaria. La fuerza de
adsorcin aumenta a medida que aumenta la polaridad del compuesto y la interaccin
entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en comparacin a la fase mvil)
aumenta el tiempo de retencin.

La fuerza de interaccin no slo depende de los grupos funcionales del compuesto de

inters, sino tambin en factores estricos de forma que los ismeros estructurales a
menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La utilizacin de disolventes ms polares
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en la fase mvil disminuye el tiempo de retencin de los compuestos mientras que los
disolventes ms hidrofbicos tienden a aumentar el tiempo de retencin.
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La NP-HPLC cay en desuso a los aos 1970 con el desarrollo del HPLC de fase reversa o
reversed-phase HPLC debido a la falta de reproductibilidad de los tiempos de retencin
puesto que los disolventes prticos cambiaban el estado de hidratacin de la silica o
almina de la cromatografa.

CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA

La fase estacionaria tiene una naturaleza no apolar (cadenas hidrocarbonada, grupo

fenilo) la fase estacionaria puede ser un slido adsorbente.

La HPLC de fase inversa (RP-HPLC) consiste en una fase estacionaria apolar y una fase
mvil de polaridad moderada. Una de las fases estacionarias ms comunes de este tipo
de cromatografa es la silica tratada con RMe2SiCl, donde la R es una cadena alquil tal
como C18H37 o C8H17. El tiempo de retencin es mayor para las molculas de
naturaleza apolar, mientras que las molculas de carcter polar eluyen ms
rpidamente.

El tiempo de retencin aumenta con la adicin de disolvente polar a la fase mvil y

disminuye con la introduccin de disolventes ms hidrofbicos. La cromatografa de fase
reversa es tan utilizada que a menudo se lo denomina HPLC sin ninguna especificacin
adicional. La cromatografa de fase reversa se basa en el principio de las interacciones
hidrofbicas que resultan de las fuerzas de repulsin entre un disolvente relativamente
polar, un compuesto relativamente apolar, y una fase estacionaria apolar. La fuerza
conductora en la unin del compuesto a la fase estacionaria es la disminucin del rea
del segmento apolar del analito expuesto al disolvente. Este efecto hidrofbico est
dominado por el aumento de la entropa, y la consecuente disminucin de la energa
libre, asociada con la minimizacin de la interfase compuesto-disolvente polar. El efecto
hidrofbico disminuye con la adicin de disolvente apolar a la fase mvil. Esto modifica
el coeficiente de particin de forma que el compuesto se mueve por la columna y eluye.

Las caractersticas del compuesto de inters juegan un papel muy importante en la

retencin. En general, un compuesto con una cadena alquil larga se asocia con un
tiempo de retencin mayor porque aumenta la hidrofobicidad de la molcula. Aun as,
las molculas muy grandes pueden ver reducida la interaccin entre la superficie del
compuesto y la fase estacionaria. El tiempo de retencin aumenta con el rea de
superficie hidrofbica que suele ser inversamente proporcional al tamao del
compuesto. Los compuestos ramificados suelen eluir ms rpidamente que sus
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ismeros lineales puesto que la superficie total se ve reducida.

Aparte de la hidrofobicidad de la fase inmvil, otras modificaciones de la fase mvil

pueden afectar la retencin del compuesto; por ejemplo, la adicin de sales inorgnicas
provoca un aumento lineal en la tensin superficial, y como que la entropa de la
interfase compuesto-disolvente est controlada precisamente por la tensin superficial,
la adicin de sales tiende a aumentar el tiempo de retencin.

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Otra variable importante es el pH puesto que puede cambiar la hidrofobicidad del

compuesto. Por este motivo, la mayora de mtodos utilizan un tampn como el fosfato
de sodio para controlar el valor del pH. Estos tampones controlan el pH, pero tambin
neutralizan la carga o cualquiera resto de silica de la fase estacionaria que haya quedado
expuesta y actan como contraiones que neutralizan la carga del compuesto. El efecto
de los tampones sobre la cromatografa puede variar, pero en general mejoran la
separacin cromatogrfica.

Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor facilidad que las columnas
de silica normales. Aun as, muchas columnas de fase reversa estn formadas por silica
modificada con cadenas alquil y no se deben utilizar nunca con bases en medio acuoso
puesto que stas podran daar el esqueleto de silica subyacente. Las columnas se
pueden utilizar en cidos en medio acuoso pero no deberan estar expuestas demasiado
tiempo al cido porque puede corroer las partes metlicas del aparato de HPLC.

CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR

La fase estacionaria en este caso es un material poroso, el tamao del poro debe ser
controlado, permite la entrada de ciertas molculas de manera selectiva dejando fuera
otras de mayor tamao.

La cromatografa de exclusin molecular, tambin conocida como cromatografa por

filtracin en gel, separa las partculas de la muestra en funcin de su tamao.
Generalmente se trata de una cromatografa de baja resolucin de forma que se suele
utilizar en los pasos finales del proceso de purificacin. Tambin es muy til para la
determinacin de la estructura terciaria y la estructura cuaternaria de las protenas
purificadas.

La cromatografa de filtracin molecular es un mtodo de cromatografa en columna por

el cual las molculas se separan en solucin segn su peso molecular, o ms
precisamente, segn su radio de Stokes.

En esta cromatografa, la fase estacionaria consiste en largos polmeros entrecruzados

que forman una red tridimensional porosa. A los fines prcticos, las columnas se
empaquetan con pequeas partculas esferoidales formadas por esos polmeros
entrecruzados. En consecuencia, estas partculas son porosas, y el tamao de los poros
es tal que algunas molculas (las demasiado grandes) no podrn ingresar a esos poros,
en tanto que otras (las suficientemente pequeas) podrn pasar libremente. Los poros
quedan conectados formando una malla o red, lo cual determina una serie de caminos
a ser recorridos por las molculas que acceden al interior de esta.
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CROMATOGRAFA DE INTERCAMBIO IONICO

Este tipo se da cuando la fase estacionaria presente en su superficie grupos ionizados

capaces de retener selectivamente a iones del signo contrario que circulan en la fase
mvil.

En la cromatografa de intercambio inico, la retencin se basa en la atraccin

electrosttica entre los iones en solucin y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria.
Los iones de la misma carga son excluidos mientras que los de carga opuesta son
retenidos por la columna. Algunos tipos de intercambiadores inicos son:

Resinas de poliestireno
Intercambiadores inicos de celulosa y dextranos (geles)
Silica porosa o vidrio de tamao de poro controlado.

En general los intercambiadores inicos favorecen la unin de iones elevada carga y

radio pequeo. Un incremento en la concentracin del contrain (respecto a los grupos
funcionales de la resina) reduce el tiempo de retencin. Un incremento en el pH reduce
el tiempo de retencin en las cromatografas de intercambio catinico mientras que una
disminucin del pH reduce el tiempo de retencin en las cromatografas de intercambio
aninico. Este tipo de cromatografa es ampliamente utilizado en las siguientes
aplicaciones: purificacin de agua, concentracin de componentes traza, Ligand-
exchange chromatography, Ion-exchange chromatography of proteins, High-pH anion-
exchange chromatography of carbohydrates and oligosaccharides, etc.

CROMATOGRAFA BASADA EN BIOAFINIDAD

Este tipo de cromatografa se basa en la capacidad de las sustancias biolgicamente

activas de formar complejos estables, especficos y reversibles. La formacin de estos
complejos implica la participacin de fuerzas moleculares como las interacciones de Van
der Waals, interacciones electrostticas, interacciones dipolo-dipolo, interacciones
hidrofbicas y puentes de hidrgeno entre las partculas de la muestra y la fase
estacionaria

CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA EFICACIA EN CONDICIONES DESNATURALIZANTES

(DHPLC)

Se trata de un mtodo que se emplea para el rastreo de mutaciones (ya casi totalmente
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en desuso debido al auge de la secuenciacin), que permite detectar la presencia de

variaciones en el ADN aunque no se determinan especficamente cules. En este caso,
se utiliza la tcnica cromatogrfica para la deteccin de heterodplex de ADN, en lugar
de utilizar un gel para correr las molculas de cidos nucleicos.

El procedimiento consiste en desnaturalizar (aumentando la temperatura

normalmente) una muestra que contenga tanto el ADN problema como un ADN control,
que no es ms que el mismo ADN problema pero en su versin silvestre o normal (sin

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mutaciones). Luego se procede a re naturalizar (disminuyendo la temperatura), de
manera que aquellas cadenas de ADN que vuelvan a unirse con sus respectivas
complementarias (cadena "a" silvestre con cadena "b" silvestre; o bien cadena "a"
mutante con cadena "b" mutante) no presentarn diferencia con el estado original; sin
embargo, si por ejemplo una cadena "a" silvestre hbrida con una cadena "b" mutante,
aquella regin (ms o menos amplia) en la que exista mutacin no complementar,
formndose un bucle u horquilla, es decir, una regin en la que las bases nitrogenadas
no son complementarias y no establecen las uniones caractersticas por puentes de
hidrgeno en la doble hlice de ADN. Dichas estructuras son los denominados
heterodplex (dplex de ADN hbridos). Estos heterodplex migran de forma diferente
a los homodplex en la columna de cromatografa de fase reversa(al igual que lo hacen
en un gel de agarosa o acrilamida). La separacin se realiza en condiciones
desnaturalizantes variables, detectndose las molculas de ADN midiendo la
absorbancia a 260 nm. Esto origina un pico de elucin a un tiempo caracterstico. A
medida que se incrementan las condiciones desnaturalizantes los heterodplex migran
por delante de los homodplex, apareciendo los picos correspondientes a heterodplex
antes en el grfico resultante, el cromatograma. De esta manera, como los heterodplex
se desnaturalizan a temperaturas distintas a los homodplex, ambas molculas dan
lugar a picos de elucin distintos.

Previo al proceso inicial de desnaturalizacin se suele llevar a cabo una PCR para la
amplificacin del ADN molde en fragmentos de unas 150-450 pb.

Con este sistema pueden detectarse fcilmente sustituciones de una base, inserciones
o deleciones, con un coste reducido y de manera rpida (aproximadamente 16 minutos)

TIPOS DE SOLVENTES
Los solventes para HPLC deben ser muy puros "CALIDAD HPLC" es una de las calidades
ms altas.

Las impurezas de un disolvente malo producen: seal en el fondo del detector y arruinan
las columnas, en especial por partculas, aun con estas precauciones se utiliza una pre
columna, cortada igual a la que se va a usar pero ms barata.

CONSIDERACIN DE SOLVENTES

Debe tener alta pureza.

Disolver el analito.
Debe ser voltil.
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INSTRUMENTACIN
1) CONSIDERACIN DE RESERVORIO.

Contiene a la Fase Mvil. Frasco cerrado de vidrio, resistente al disolvente con paredes
homogneas. Contiene un filtro de metal que retiene partculas mayores a 10
nanmetros.

2) BOMBAS

Impulsa a la Fase Mvil dentro del sistema de elucin de HPLC. Impulsan al fluido hasta
el HPLC. Genera presin de hasta 6000 psi. Tiene flujo libre de precisiones

TIPOS DE BOMBAS

Binarias: Impulsan solo un disolvente.

Secundarias: Impulsan 2 disolventes.
Terciarias: Impulsan 3 disolventes.

3) INYECTOR (AUTOMUESTRADOR O MANUAL)

Permite introducir la muestra al sistema.

4) COLUMNA Y PRE-COLUMNA

Sistema de anlisis. Medio en el que se lleva a cabo la separacin y es el contenedor del

fluido emergente. Las pre-columnas evita el posible ingreso de las partculas
contaminantes, y por lo general prolonga la vida de la columna.

CARACTERSTICA DE LA COLUMNA

Dimetro interno de 3.9 mm

Longitud de 10,15,20,25,30.
Tamao de partcula 3.5, 5 nanmetros

5) DETECTORES

Es un transductor que tiene como funcin el registro del paso de componentes de una
muestra en el orden en el que eluyen.

6) COLECTOR DE FRACCIONES
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Sirve para recibir o contener por separado los componentes que ya eluyeron por si se
requiere un anlisis posterior de alguno de ellos.

7) COMPUTADOR

Sistema de almacenamiento. Columna Micro boro o Brownlee microbore

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CAMPO DE APLICACIN DE LA HPLC
Los mtodos que utilizan columnas con un tamao pequeo de partcula se conocen
como cromatografa liquida de alto desempeo HPLC, esta tcnica es la ms usada
debido a su alta sensibilidad, su adaptacin de las determinaciones cuantitativas, idnea
para la separacin de especies no voltiles o termolbiles porque trabaja a temperatura
ambiente. Es de inters para estudio de sustancias de ciencia, industria y sociedad como:
aminocidos, carbohidratos, terpenoides, plaguicidas, esteroides, hidrocarburos,
drogas, protenas, antibiticos, rgano metlico, especies inorgnicas y otros.

Ejemplos de aplicacin de HPLC

Frmacos: Antibiticos, sedantes esteroides, analgsicos

Bioqumica: Aminocidos, protenas, carbohidratos, lpidos
Productos de alimentacin: Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas,
aditivos
Productos de la industria qumica: Aromticos condensados, tensoactivos,
propulsores, colorantes
Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB
Qumica forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcticos
Medicina clnica: cidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina,
estrgenos

Para lograr la separacin, identificacin y cuantificacin de estos analitos en muestras

que contienen, la mayora de las veces es necesario desarrollar mtodos especficos o
utilizar mtodos estandarizados de la literatura.

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 CROMATOGRAFIA
LA CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTO DESEMPEO EN LA INDUSTRIA
MDICA Y FARMACUTICA
La Cromatografa Lquida de Alto Desempeo (HPLC, por sus siglas en ingls) se usa en la
industria mdica y farmacutica para analizar productos y los ingredientes que se usan para
hacerlos. A menudo, este anlisis lo desarrolla un laboratorio de control de calidad de la
empresa farmacutica. Los qumicos que contratan a estos fabricantes tienen muestras de
funcionamiento de materias primas o productos terminados por medio de mquinas de HPLC y
despus se analizan los resultados.

El significado de la HPLC en el campo de los farmacuticos y los medicamentos, en parte, debido

a estas industrias cae en reglas rigurosas establecidas por la Administracin de Medicamentos y
Alimentos en Estados Unidos (FDA, por sus siglas en ingls). Si una empresa falla en el anlisis
de productos usando estos mtodos como HPLC, la FDA puede emitir Cartas de Advertencia 483
o incluso cerrar la produccin de la empresa por medio de una orden de la corte. La
cromatografa lquida de alto desempeo tiene un significado especial en las industrias
farmacutica y mdica debido a que permite ambos anlisis cualitativos y cuantitativos.

Un beneficio para la empresa farmacutica en el uso de la cromatografa lquida de alto

desempeo es la seguridad en la calidad que brinda este anlisis. Otro es que los mtodos HPLC
son relativamente estndar en la industria. Esto significa que las nuevas contrataciones con
experiencia en el campo farmacutico requieren de un entrenamiento mnimo antes de que
comiencen a desarrollar un anlisis en los laboratorios. Adems, el desempeo estndar del
anlisis HPLC permite contratar a los fabricantes para transferir mtodos en sus instalaciones de
la empresa que contrata la produccin.

FUNCIN
La HPLC se usa para analizar materias primas y productos terminados para asegurarse que la
calidad de los niveles previamente establecidos se cumpla. La HPLC comienza en forma de una
manguera de alta presin que genera y mide una tasa de flujo especializada desde la reserva
que soporta al solvente. Un inyector introduce la muestra de forma continua en la fase de vapor
del flujo mvil que lleva la muestra hacia la columna de la HPLC. Un detector se usa para medir
las bandas separadas del compuesto conforme se eluden desde la columna HPLC. La fase mvil
saca el detector y se puede recolectar o enviar para hacer pruebas.

Cuando una empresa farmacutica usa la HPLC, el mtodo de validacin se debe desarrollar para
asegurar una adecuada deteccin del material. A menudo esto conlleva a clavar una muestra
con una cantidad conocida de un ingrediente activo y comparar los resultados con ste en una
muestra blanca. Cuando se usan los mtodos de varias farmacopeas (USP, etc), no es necesario
evaluar su idoneidad.

Con el uso de la HPLC, una empresa tiene el potencial de descubrir fallas en los productos que
no cuentan con una especificacin. Esto permite al fabricante evitar una costosa llamada por
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dao de reputacin al no liberar el producto en el primer lugar. Debido a que el lote completo
de tabletas o cpsulas no se puede analizar en una cantidad razonable de tiempo, la
representacin de las muestras se recolecta, usando estndares de la ANSI (Instituto Nacional
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de Estndares Estadounidenses) y se revisa con la HPLC.

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BIBLIOGRAFIA
Mecanismos Y Aplicaciones de la Cromatografa Lquida de Alto Desempeo.
Editorial Universidad de Costa Rica. ISBN 9977679185, 9789977679181
Desarrollo de mtodos para el aislamiento y la deteccin de toxinas marinas en
productos de la pesca y la acuicultura. Univ Santiago de Compostela
EDITORIAL. UNIVERSITAT POLITCNICA DE VALNCIA. Adrin Garca de Marina
Bayo. Dolores Julia Yus Marco. 2016. HPLC instrumental
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