ROTEIRO DE AULAS PRTICAS

MTODOS ANALTICOS EM BIOMEDICINA

PROF. Dr. Renan Nunes Leles

 AULA 01:

APRESENTAO DO LABORATRIO (LACES) E INSTRUMENTAO:

1 - Recepo:

1.1 Observao geral do local

- Voc entende essa rea como uma rea crtica, semi-crtica ou no crtica?

- Qual o tipo de piso utilizado?

- Este piso adequado para a rea em questo? Por qu?

- Qual o tipo de revestimento das cadeiras? Nesse caso esse tipo de

revestimento adequado ou necessrio?

- Existe a disponibilidade de sanitrios na recepo?

2 Sala de coleta:

2.1 Observao geral do local

- Voc entende essa rea como uma rea crtica, semi-crtica ou no crtica?

- O tipo de piso utilizado igual ao da recepo? Por qu?

- Este piso adequado sala? Por qu?

- Como o revestimento dos assentos? Este tipo de revestimento necessrio?

- Como fluxo do paciente da recepo sala de coleta e sua sada? Por que

deve ser assim?

- O tamanho dos Box de coleta adequado?

- Existe uma maca em algum local da sala de coleta?

2.2 - Observao dos materiais de trabalho

- Quais os riscos relacionados aos profissionais que trabalham nesse setor?

- Quais os materiais e estruturas de biossegurana voc encontra nessa sala?

Falta algum?

- As rotulagens de todos os materiais esto corretas e todos os materiais esto

corretamente acondicionados?
 3 Demais salas da rea tcnica

- Qual o tipo de piso encontrado na corredor e nas demais salas de rea

tcnica? Qual a importncia desse tipo de piso?

- Existe alguma separao da rea tcnica para a rea de atendimento aos

pacientes? Qual a funo dessa separao?

- Existe algum artigo de biossegurana no corredor da rea tcnica? Quais?

Eles esto bem localizados?

- Como feita a construo da fiao eltrica na estrutura do laboratrio? O

que justifica essa caracterstica?

- As portas da rea tcnica tem a mesma caracterstica das portas de uso

geral?

- Como so as bancadas de trabalho e a superfcie do mobilirio? Por qu?

3.1 Microbiologia:

- uma rea do tipo crtica, semicrtica ou crtica? Qual o risco envolvido no

local?

-Qual o maquinrio presente na seo?

3.2 Bioqumica:

- uma rea do tipo crtica, semicrtica ou crtica? Qual o risco envolvido no

local?

-Qual o maquinrio presente na seo?

3.3 Hematologia:

- uma rea do tipo crtica, semicrtica ou crtica? Qual o risco envolvido no

local?

-Qual o maquinrio presente na seo?

3.4 Uranlise/Parasitologia:

- uma rea do tipo crtica, semicrtica ou crtica? Qual o risco envolvido no

local?

-Qual o maquinrio presente na seo?

3.5 Imunologia/Hormnios:

- uma rea do tipo crtica, semicrtica ou crtica? Qual o risco envolvido no

local?

-Qual o maquinrio presente na seo?

3.6 Sala de microscopia

 - uma rea do tipo crtica, semicrtica ou crtica? Qual o risco envolvido no

local?

-Qual o maquinrio presente na seo?

3.7 Sala de esterilizao:

- uma rea do tipo crtica, semicrtica ou crtica? Qual o risco envolvido no

local?

-Qual o maquinrio presente na seo?

3.8 Sala de lavagem de materiais:

- uma rea do tipo crtica, semicrtica ou crtica? Qual o risco envolvido no

local?

-Qual o maquinrio presente na seo?

-
 Glossrio:

reas crticas - so os ambientes onde existe risco aumentado de transmisso

de infeco, onde se realizam procedimentos de risco, com ou sem pacientes, ou

onde se encontram pacientes imunodeprimidos.

reas semicrticas - so todos os compartimentos ocupados por pacientes com

doenas infecciosas de baixa transmissibilidade e doenas no infecciosas.

reas no-crticas - so todos os demais compartimentos dos estabelecimentos

assistenciais de sade no ocupados por pacientes, onde no se realizam

procedimentos de risco.

Artigos crticos: Os artigos destinados penetrao atravs da pele e mucosas

adjacentes, nos tecidos subepiteliais e no sistema vascular, bem como todos os que

estejam diretamente conectados com este sistema. Estes requerem esterilizao

para satisfazer os objetivos a que se propem.

Artigos semicrticos: Os artigos destinados ao contato com a pele no-ntegra

ou com mucosas ntegras . Requerem desinfeco de mdio ou de alto nvel, ou

esterilizao, para ter garantida a qualidade do mltiplo uso destes.

Artigos no crticos: Os artigos destinados ao contato com a pele ntegra do

paciente. Requerem limpeza ou desinfeco de baixo ou mdio nvel, dependendo do

uso a que se destinam ou do ltimo uso realizado.

 AULA 02:

Tcnicas de puno venosa

1.1 Veias mais utilizadas para puno: Veias so vasos responsveis pelo

trnsito no sentido perifrico para o nvel central (corao). Podem ser

superficiais ou profundas e de grande, mdio, pequeno calibre ou vnulas. Pela

facilidade de puno, preferem-se veias superficiais (subcutneas) e mais

proeminentes (calibrosas) perceptveis visualmente ou pelo tato. As regies mais

propensas para o procedimento so: a face anterior do brao, antes ou na regio

oposta ao cotovelo (fossa antecubital) com destaques as veias ceflica, baslica e

cubital (fig. 01). Alternativamente pode-se utilizar a face dorsal da mo (fig. 01).

prudente evitar os vasos do pulso, pela superficialidade dos nervos nesta regio.

Fig. 01 Veias mais comuns para puno venosa, foto e esquema.

1.2 Roteiro para puno venosa:

1 O paciente deve ser convidado a adentrar a sala de coleta e tratado com

cortesia (sorriso e educao)

2 A identificao do paciente deve ser confirmada pelo coletador antes da

realizao da puno conferncia de documentao; questionamento do nome

completo do paciente ou dado pessoal como data de nascimento, por exemplo.

3 Realizar a identificao de tubos de coleta e lmina DO PACIENTE de

acordo com o que for determinado pelo laboratrio (nome completo, iniciais,
nmero de cadastro, iniciais + nmero de cadastro, etiquetas com cdigo de barra,

etc)

4 Separar o material de coleta que ser utilizado:

- seringa de volume correspondente necessidade de coleta quantos tubos

sero utilizados, sendo que o ideal um volume de 3 a 4 ml por tubo de coleta;

- Agulha de sua preferncia, sendo as mais utilizadas s agulhas 25 (mm) x 0,7

(mm) (preta) ou 25 (mm) x 0,8 (mm) (verde). Evitar o uso de agulhas muito finas

(20x0,55 rosa), eventualmente utilizada em crianas, pois facilitam muito a

hemlise do material;

- Garrote mais adequado para o paciente;

5 Explicar ao paciente o procedimento que ser realizado. Solicitar ao

paciente que estenda o brao, formando uma linha reta desde o ombro at o pulso,

evitando curvatura, especialmente na regio antecubital e, solicitar ainda que

feche a mo.

6 Realizar o garroteamento do brao, colocando o garrote com cerca de 10

cm acima do local a ser realizado a puno. O garrote deve ser colocado de forma a

facilitar a percepo das veias, sem impedir o fluxo sanguneo arterial.

7 Avaliar o paciente buscando os locais mais adequados a realizao da puno,

reconhecendo a disperso das veias. Soltar o garrote do paciente.

8 Calar as luvas e abrir todos os materiais que forem descartveis (agulha e

seringa) na frente do paciente, de modo que ele certifique-se do uso de material

novo e descartvel.

09- Conectar a agulha a seringa, mantendo a capa plstica sobre a agulha e

retirar o ar de dentro da seringa puxando o mbolo e empurrando novamente.

10 Realizar novamente o garroteamento do brao do paciente (este

garroteamento no deve durar mais de um minuto) tratar um chumao algodo com

lcool 70% .
 11 Realizar a anti-sepsia no local da puno em movimento espiral, do centro

para fora.

12 Retirar a capa protetora da agulha e jogar fora em lixo comum. Posicionar a

agulha com o bisel voltado para cima e realizar a puno sobre a veia em uma

angulao de cerca de 30 a 40 (observar a entrada de sangue pelo canho da

agulha)

13 Manter a posio da seringa e puxar o mbolo. Percebendo fluxo de sangue

para dentro da seringa, soltar o garrote do paciente (no deve permanecer

garroteado por mais de um minuto para evitar a hemoconcentrao da amostra,

formao de agregados plaquetrios, edemaciamento e extravasamento de sangue

para o tecido).

14 Chegando ao volume de sangue adequado pegue um chumao de algodo

seco e coloque sobre o local da puno, retire agulha e solicite ao paciente que

pressione o algodo por pelo menos CINCO MINUTOS, sem dobrar o brao.

15 Realizar a transferncia do material para os tubos de coleta, seguindo a

ordem estabelecida pela NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory

Standard) (designada abaixo). Deixe o contedo fluir naturalmente da seringa para

o tubo, NO PRESSIONE O MBOLO DA SERINGA (AUMENTA MUITO A

OCORRNCIA DE HEMLISE):

1. Tubo contendo citrato, para coagulao; (AZUL)

2. Tubo contendo EDTA, para hematologia;(ROXO)

3. Tubo contendo fluoreto de sdio, para glicemia; (CINZA)

4. Tubo sem aditivo, para soro. (AMARELO/VERMELHO)

 16 - Homogeneizar as amostras dentro do tubo coleta por meio de 8 a 10

imerses aps a transferncia da amostra para o tubo

17 Descartar todo o material (agulha e seringa) no local adequado para o

descarte de material perfuro-cortante. EM HIPTESE ALGUMA REALIZE O

REENCAPE DA AGULHA!!!
 AULA 03:

Contagem de hemcias em cmara de Neubauer

1.1 Materiais de uso:

1 Tubo de ensaio de vidro (x5);

2 Pipetas volumtricas: 2,0/5,0 mL (x5 ou o quanto disponvel);

3 Pera de pipetagem (x5)

4 Pipeta automtica: 20 L (x5 ou o quanto disponvel);

5 Cmara de Neubauer (x5);

6 Lamnulas de vidro (uma caixa);

7 Soluo Salina - alquotas de 50 mL em tubos com tampa;

8 Material de coleta com tubo de EDTA (x2);

9 Microscpios para contagem;

10 Bquer de vidro ou plstico com hipoclorito de sdio 1% para descarte de

ponteira (x5);

2.1 Procedimento de coleta: Realizar procedimento conforme trabalhado na

aula anterior;

2.2 Procedimento de diluio: Seguir o procedimento abaixo:

1. Separar o tubo com sangue no coagulado e destampa-lo com cuidado;

2. Pipetar 4 mL de soluo fisiolgica em pipeta volumtrica de vidro;

3. Dispensar o volume de salina em um tubo de ensaio;

4 Realizar a pipetagem de 20 L da amostra de sangue com pipeta

automtica;

5 Dispensar a alquota no tubo com salina, lavar a ponteira na soluo e

descartar a ponteira com o uso do dispenser para tal fim;

6 Homogeneizar a mistura, obtendo uma amostra de sangue na diluio de

1:_______.

2.3 Preparando a Cmara de Neubauer

2.3.1 Cmara de Neubauer: Uma lmina espessa de vidro, com formato

retangular, atravessada transversalmente por dois sulcos que delimitam trs

plataformas, sendo que a plataforma central onde se encontra a rea reticulada

da cmara. Nessa rea, existe uma depresso de 0,1 mm em relao s laterais

onde se apoia a lamnula, deixando uma profundidade exata de 0,1 mm.

A cmara encontra-se dividida em duas por um sulco transversal, sendo que a

rea reticulada superior e a inferior so exatamente iguais. Nas duas reas se

observa a presena de divises milimtricas de tamanho definido, observando-se 9

quadrantes na cmara, em sua poro superior e em sua poro inferior. Cada

quadrante apresenta medidas de 1 mm x 1mm de lado, com rea de 1mm2.

Os quadrantes utilizados so os quatro quadrantes laterais, divididos em 16

quadrantes de tamanho mdio (0,0625 mm2) e o quadrante central, dividido em 25

quadrantes menores, subdivididos em 16 quadrantes menores, chegando a uma

subdiviso de 400 quadrantes em 1 mm2 de rea (0,0025 mm2).

2.3.2 Realizao da contagem:

1. Umidificar as laterais da Cmara com lcool 70% ou gua;

2. Colocar a lamnula sobre a cmara, tapando totalmente as duas reas

reticuladas;

3. Homogeneizar, vagarosamente, a suspenso a ser colocada na cmara,

nesse caso o sangue diludo;

4. Pipetar 20 microlitros de suspenso, desprezar a primeira gota e colocar

na plataforma central da cmara, prximo a lamnula, colocar vagarosamente a

suspenso preenchendo toda a cmara, sem formao de bolhas;

5. esperar cinco minutos para a decantao das hemcias;

6. Colocar a cmara sobre a platina do microscpio e fazer a contagem de

hemcias no aumento de 40 x em luz baixa;

 7. A contagem dever ser realizada em cinco, dos vinte e cinco mini-

quadrantes encontrados no quadrante central da cmara, preferencialmente nos

quatro mini-quadrantes laterais e em um central:

8. Deve-se seguir a contagem da esquerda para a direita na primeira fileira

e da direita para a esquerda na segunfa fileira e assim por diante. Hemcias que

tocarem a rea limtrofe podem ser contados apenas uma nica vez, ou no

quadrante de cima/baixo ou esquerda/direita.

9. Realizar uma nova contagem da mesma amostra na rea quadriculada

ainda no utlizada seguindo os mesmos procedimentos;

10 . Fazer uma mdia das duas contagens e realizar a converso do que foi

contado para o volume desejado: hemcias/microlitro, da seguinte maneira:

Mdia x 5 x 10 x 200
80 q 400 q 0,1 1 mm3 F.D.
 AULA 04:

Dosagem de hemoglobina

Reagente de Drabkin: Reagente txico a base de Ferricianeto de Potssio e

Cianeto de Potssio para dosagem de hemoglobina. O ferricianeto de potssio atua

na oxidao do Ferro ferroso (Fe2+) ligado a hemoglobina em Ferro frrico (Fe3+) e

determina a formao da Metahemoglobina (incapaz de se ligar ao oxignio).

Seguido da reao do Cianeto de Potssio com a Metahemoglobina, formando o

cianeto de Hemoglobina, com cor estvel e de intensidade proporcional a

quantidade de hemoglobina presente na amostra. CUIDADO: CADA 5 ML DE

REAGENTE APRESENTA CERCA DE 0,25 MG DE CIANETO (TXICO).

Materiais:

. Espectrofotmetro;

. Cubetas para espectrofotmetro;

. Tubos de ensaio de vidro(4);

. Pipetas Automticas de 20 microlitros (4);

. Amostra de sangue total com anticoagulante;

. Bqueres com gua destilada (4);

. Provetas com gua destilada (2);

. Frasco com gua destilada;

. Pipetas automticas de 1 mL;

. Ponteiras;

. Soluo padro de hemoglobina;

. Reativo de Drabkin;
 Procedimento:

1. Utilizao do Espectrofotmetro:

1.1 Ligar o equipamento na tomada (verificar tenso de trabalho);

1.2 Aguardar cerca de 30 minutos para estabilizao do equipamento;

1.3 Enquanto aguarda-se o perodo de estabilizao do equipamento, realizar a

coleta de sangue total em tubo com EDTA, conforme prticas realizadas

em aulas anteriores;

1.4 Observar o comprimento de onda do monocromador para a leitura da

absorbncia, que nesta reao deve ser de 540 nm;

1.5 Abrir a tampa de acesso as cubetas do equipamento;

1.6 - Colocar a cubeta opaca na primeira posio;

1.7 Zerar com a cubeta opaca a transmitncia do equipamento;

2. Preparo da soluo de Cianometemoglobina:

2.1 Adicionar 5 ml do reativo de Drabkin em um tubo de ensaio;

2.2 - Pipetar 20 microlitros ao reativo no tubo de ensaio;

2.3 - Deixar por 5 minutos para que as reaes supracitadas aconteam;

2.4 Homogeneizar a soluo e identificar o tubo de ensaio;

3. Determinao da absorbncia do padro e clculo do fator:

3.1 O fator calculado ser o mesmo para todos os grupos, todos devem estar

atentos para a realizao desse passo;

3.2 Colocar 3 mL de gua destilada em uma cubeta de vidro;

3.3 - Retirar a cubeta opaca da posio 1;

3.4 Colocar a cubeta com gua destilada na posio 1;

3.5 Colocar 3 ml do padro de hemoglobina em uma cubeta de vidro;

3.6 Colocar a cubeta com o padro de hemoglobina na posio 2;

3.7 Zerar a absorbncia do equipamento com a leitura da gua destilada em

540 nm de comprimento de onda, colocando a alavanca de leitura em sua

primeira posio;

3.8 Realizar a leitura do da absorbncia do padro movimentando a alavanca

para sua terceira posio (a segunda posio da alavanca corresponde a

um espao opaco entre a primeira e a segunda cubeta que pode ser

utilizado para zerar a transmitncia do equipamento na ausncia da

cubeta opaca);
 3.9 Anotar a absorbncia do padro e relacion-lo a sua concentrao

(determinada no frasco do reagente)

Concentrao do padro
FC =
Absorbncia (540 nm)

4. Determinao da concentrao da amostra:

4.1 Manter a gua destilada na primeira posio de cubetas;

4.2 - Retirar a cubeta com o padro de hemoglobina e lav-la com gua

destilada, retirar o excesso de gua da cubeta e secar o restante com

cotonete ou leno de papel (CUIDADOSAMENTE VIDRO);

4.3 Homogeneizar novamente a soluo de Cianometemoglobina;

4.4 - Colocar 3ml da soluo em uma cubeta de vidro;

4.5 - Colocar a cubeta com a soluo na segunda posio de leitura;

4.6 Zerar a absorbncia da reao com a gua destilada;

4.7 - Realizar a leitura da absorbncia a 540 nm da soluo de

Cianometemoglobina;

4.8 Anotar a absorbncia e calcular a concentrao da hemoglobina da

amostra em g/dL multiplicando a absorbncia encontrada pelo fator de

concentrao FC ou, mediante correlao direta entre a concentrao

do padro e absorbncia do padro por regra de 3 simples.

Concentrao do padro (g/dL) Absorbncia padro(540 nm)

Concentrao da amostra (g/dL) Absorbncia amostra (540 nm)

 Aula 05:

Determinao de hematcrito, ndices hemantimtricos

1. Materiais:

Pipetas de Macrohematcrito;

Tubos capilares para microhematcrito;

Massinha de modelar;

Microcentrfuga para hematcrito;

Centrfuga;

Regua para leitura de microhematcrito

2. Determinao de hematcrito: Volume de sangue ocupado pelas hemcias

em porcentagem. Utiliza-se para tal a tcnica do microhematcrito ou por tubo

para hematcrito de Wintrobe e centrifugao.

2.1 Procedimento para microhematcrito:

1. Preencher o tubo de microhematcrito cuidadosamente em pelo menos 2/3

de preenchimento;

2. Fechar a ponta do tubo com massa de modelar ou selar com fogo;

3. Colocar em microcentrifuga com alta velocidade de rotao (11.500 rpm);

4. Centrifugar por 10 minutos;

5. Realizar a leitura com o auxlio da placa de leitura de hematcrito.

2.2 Procedimento para macrohematcrito:

1- Preencher o tubo de wintrobe (com seringa e uma grande agulha ou com uma

pipeta descartvel fina) at a marca de 100mm;

2 Tapar com papel;

3- Centrifugar a 3.000 rpm por 30 minutos

4 Realizar a leitura
3. Clculo dos ndices hemantimtricos:

Vcm (fL) = (Htc/Hemcias em milhes) x 10

HCM (pg) = (Hemoglobina (g/dL)/ Hemcias em milhes) x 10

CHCM (%) = (Hemoglobina/Htc) x100

 Aula 06:

Contagem de Leuccitos em Cmara de Neubauer e confeco de esfregao

1.Materiais:

Tubos de ensaio de vidro;

Pipetas automticas;

Lquido de Turk;

Cmara de Neubauer;

Ponteiras;

Lminas;

Extensoras

2. Contagem de leuccitos em Cmara de Neubauer: Contagem da quantidade

de leuccitos em um microlitro de sangue, sem diferenciao entre as diferentes

clulas leucocitrias. A metodologia realizada pela diluio do sangue em um

lquido, chamada Lquido de Turk, composto de cido actico e azul de metileno que

alm de lisar as hemcias capaz de corar os leuccitos.

Procedimento:

1. Diluio da amostra em 1:20

1.1 Pipetar 380 L de lquido de Turk em um tubo de ensaio;

1.2 Pipetar 20 L da amostra de sangue a ser avalida (devidamente

homogeneizada);

1.3 Homogeneizar o tubo de amostra diluda;

2. Contagem em Cmara de Neubauer:

2.1 Colocar a soluo diluda em Cmara de Neubauer;

2.2 Realizar a contagem dos leuccitos nos quatro quadrantes laterais da

Cmara (quadrantes com 16 subdivises);

2.3 Multiplicar o valor encontrado nos quatro quadrantes da seguinte maneira:

 3. Confeco do esfregao sanguneo: O esfregao bem feito determinante

para a realizao de um hemograma de qualidade. Para tal devem-se utilizar lminas

de qualidade, preferencialmente novas, e desengorduradas e uma lmina extensora.

O esfregao ideal no deve ser demasiadamente grosso e nem fino, deve estar

isento de falhas e paradas e com cauda bem definida, como mostra a figura abaixo:

Fig. 1 Partes do esfregao: Cabea (1), corpo (2) e cauda (3)

 3.1 Procedimetos para o esfregao:

3.1.1 - Verificar a posio da lmina, com o lado fosco para cima. Limpar a

lmina com uma gaze seca, se necessrio, limp-la com lcool antes e secar em

seguida, para retirar o excesso de gordura sobre a lmina.

3.1.2 Realizar a devida identificao da lmina segundo a determinao do

laboratrio de anlises clnicas. A identificao deve ser feita a lpis sobre a parte

fosca da lmina.

3.1.3 - O esfregao deve preferencialmente ser realizado com amostra de

sangue sem anticoagulante. Contudo, caso isso no seja possvel, pode-se realizar o

esfregao com amostra em EDTA, o mais rpido possvel, j que as alteraes

morfolgicas promovidas pelo anticoagulante na srie branca e na sria vermelha

so proporcionais ao tempo de contato do sangue com o anticoagulante.

3.1.4 Pingar uma pequena gota de sangue cerca de 01 cm da extremidade

anterior da lmina (prxima a parte fosca)

3.1.5 Colocar a face da extensora sobre a lmina, na extremidade contrria ao

qual est a gota, em um ngulo aproximado de 45 (pode variar de acordo com a

quantidade de sangue, quanto menor a angulao, o esfregao tende a se tornar

mais delgado e extenso e quanto maior a angulao, o contrrio)

3.1.6 Fazer um movimento de retorno com a extensora sobre a superfcie da

lmina at que a extensora toque a gota de sangue colocada sobre a lmina.

3.1.7 Manter a posio da extensora at que a gota de sangue se estenda sob

a superfcie da extensora.

3.1.8 Levar a extensora para frente em um movimento nico e sem paradas,

carreando o sangue e formando uma extenso do mesmo a partir da gota inicial.

essencial escorregar a lmina de uma vez, sem det-la. O movimento de extenso

deve ser uniforme. O sangue dever ser puxado pela lmina e no empurrado pela

mesma.

3.1.9 Secar o esfregao naturalmente. No utilizar fonte de calor para secar

e no deixe a lmina em posio vertical at que o esfregao esteja devidamente

seco.
 Fig 2. Passo a passo para a confeco do esfregao: gota de sangue a 1 cm da

extremidade da lmina, posicionamento da extensora em aproximadamente (45) e

movimento de retorno da extensora at a gota (A); Extenso da gota na

superfcies de contato da extensora (B); Movimento de extenso contnuo,

empurrando a gota de sangue uniformemente (C); Esfregao pronto aguardando

para que seja seco (D).

 Aula 07:

Confeco e observao de esfregao sanguneo

Materiais:

1. Materiais:

Pipetas automticas e ponteiras;

Lminas;

Extensoras;

Corante Pantico Rpido;

Microscpios;

Contador de clulas;

2. Confeco do esfregao e colorao em Pantico rpido.

2.1 Esfregao: O esfregao bem feito determinante para a realizao de um

hemograma de qualidade. Para tal devem-se utilizar lminas de qualidade,

preferencialmente novas, e desengorduradas e uma lmina extensora. O esfregao

ideal no deve ser demasiadamente grosso e nem fino, deve estar isento de falhas

e paradas e com cauda bem definida, como mostra a figura abaixo:

Fig. 1 Partes do esfregao: Cabea (1), corpo (2) e cauda (3)

 2.1 Procedimetos para o esfregao:

2.1.1 - Verificar a posio da lmina, com o lado fosco para cima. Limpar a

lmina com uma gaze seca, se necessrio, limp-la com lcool antes e secar em

seguida, para retirar o excesso de gordura sobre a lmina.

2.1.2 Realizar a devida identificao da lmina segundo a determinao do

laboratrio de anlises clnicas. A identificao deve ser feita a lpis sobre a parte

fosca da lmina.

2.1.3 - O esfregao deve preferencialmente ser realizado com amostra de

sangue sem anticoagulante. Contudo, caso isso no seja possvel, pode-se realizar o

esfregao com amostra em EDTA, o mais rpido possvel, j que as alteraes

morfolgicas promovidas pelo anticoagulante na srie branca e na sria vermelha

so proporcionais ao tempo de contato do sangue com o anticoagulante.

2.1.4 Pingar uma pequena gota de sangue cerca de 01 cm da extremidade

anterior da lmina (prxima a parte fosca)

2.1.5 Colocar a face da extensora sobre a lmina, na extremidade contrria ao

qual est a gota, em um ngulo aproximado de 45 (pode variar de acordo com a

quantidade de sangue, quanto menor a angulao, o esfregao tende a se tornar

mais delgado e extenso e quanto maior a angulao, o contrrio)

2.1.6 Fazer um movimento de retorno com a extensora sobre a superfcie da

lmina at que a extensora toque a gota de sangue colocada sobre a lmina.

2.1.7 Manter a posio da extensora at que a gota de sangue se estenda sob

a superfcie da extensora.

2.1.8 Levar a extensora para frente em um movimento nico e sem paradas,

carreando o sangue e formando uma extenso do mesmo a partir da gota inicial.

essencial escorregar a lmina de uma vez, sem det-la. O movimento de extenso

deve ser uniforme. O sangue dever ser puxado pela lmina e no empurrado pela

mesma.

2.1.9 Secar o esfregao naturalmente. No utilizar fonte de calor para secar

e no deixe a lmina em posio vertical at que o esfregao esteja devidamente

seco.
 Fig 2. Passo a passo para a confeco do esfregao: gota de sangue a 1 cm da

extremidade da lmina, posicionamento da extensora em aproximadamente (45) e

movimento de retorno da extensora at a gota (A); Extenso da gota na

superfcies de contato da extensora (B); Movimento de extenso contnuo,

empurrando a gota de sangue uniformemente (C); Esfregao pronto aguardando

para que seja seco (D).

2.2 Colorao em corante Pantico Rpido: O corante pantico rpido uma

colorao baseada na utilizao de corantes catinicos (bsicos) e corantes

aninicos (cidos) e pela respectiva atratividade dos elementos celulares pelos dois

tipos de corantes. A estrutura nuclear da clula, pelo acmulo de cido nucleico e

consequentemente de grupos fosfato (constituinte da molcula de DNA e RNA)

determina carga negativa ao ncleo e ligao ao corante carregado positivamente

(catinico) de caracterstica bsica e colorao azulada e determina a

caracterstica basoflica do ncleo. O citoplasma das clulas, por apresentar uma

disperso difusa de aminocidos bsicos, apresenta afinidade de maneira

particular ao corante cido (aninico) cido ou eventualmente ao bsico, de acordo

com a clula que se apresenta corada, possibilitando diferentes tonalidades ao

citoplasma que podem ser considerados mais neutros (rseos), cidos (azulados) ou

bsicos (avermelhados). As hemcias, por no apresentarem ncleo e pela

hemoglobina ter caracterstica bsica, tem maior afinidade pelo corante cido e

tende a ter colorao mais avermelhada. Preconiza-se antes da colorao com os

corantes cidos e bsicos a fixao do material com produtos de base alcolica o

que permite a preservao da morfologia das clulas em contato com os corantes

de base alcolica. No caso do pantico rpido utilizada a tcnica de imerso em 3

corantes sequenciais. O primeiro a base de triarilmetano 0,1%, de colorao azul

clara - esverdeado, quase translcido, com a funo de fixao. O segundo corante

de caracterstica aninica, cido, de colorao avermelhada a base de xantenos

0,1% e o terceiro corante, catinico, bsico, de colorao azulada a base de

tiazinas 0,1%.
 Procedimentos:

2.2.1 Certificar que o esfregao se encontra devidamente seco;

2.2.2 Realizar a imerso da lmina no corante 1 (azul claro/esverdeado) com

cerca de 5 segundos, realizando movimentos para disperso homognia do corante,

para cima e para baixo (5 imerses de 1 segundo cada);

2.2.2 Retirar o excesso de corante apoiando a ponta da lmina na borda do

frasco de colorao;

2.2.3 Realizar a imerso da lmina no segundo corante, vermelho, tambm por

cinco segundos e com movimentos regulares (5 imerses de 1 segundo cada);

2.2.3 Retirar o excesso de corante apoiando a lmina na borda do frasco;

2.2.4. Realizar a imerso no terceiro frasco de colorao, azul escuro, tambm

por cinco segundos e com movimentos regulares (5 imerses de 1 segundo cada);

2.2.5. Proceder lavagem da lmina em gua corrente, coloca-la para secar de

maneira apoiada transversalmente.

3. Observao do esfregao:

3.1 Reconhecer regies de cabea, corpo e cauda do esfregao e tomar nota

de suas caractersticas;

3.2 Observao das clulas da srie vermelha (tamanho e morfologia);

3.3 Observao da clulas da srie branca e reconhecimento:

Granulcitos: Apresentam ncleo de forma irregular e contm granulaes

citoplasmticas especficas que apresentam caractersticas tintoriais distintas,

sendo por elas divididos em neutrfilos, eosinfilos (afinidade pela eosina, corante

cido e de colorao avermelhada) e basfilos (afinidade pela hematoxilina,

colorao arroxeada). Os agranulcitos tem ncleo mais regular, podendo

apresentar granulaes citoplasmticas inespecficas (azurfilas ribossomos).

So divididos em linfcitos e moncitos.

Neutrfilo (40 60%): Apresentam ncleo lobulado, podendo formar de 2 a 5

lbulos (normalmente 3), ligados entre si, por finas pontes de cromatina.

Citoplasma com grnulos especficos de natureza neutra, conferindo

colorao rsea ao citoplasma.

 Eosinfilo (1-3%): Apresenta ncleo lobulado, de maneira geral com dois

lbulos. Grnulos especficos acidfilos, com propriedade de se corar pela

eosina.

Basfilo (0 1%): Ncleo volumoso de forma retorcida e irregular.

Citoplasma com a presena de grnulos grossos, de caracterstica

basoflica que podem encobrir o ncleo.

Linfcito (25 45%) : Ncleo esfrico com possvel formao de

chanfradura. A cromatina tem aspecto grosseiro, adquirindo colorao

escura na colorao. O citoplasma pequeno e escasso comparado ao

ncleo com discreta basofilia (azul claro).

Moncito (2 10%): Ncleo ovide a reniforme, geralmente

excntrico. A cromatina mais frouxa quando comparado aos linfcitos,

tendo colorao mais clara. Citoplasma basoflico (azulado).

3.4 Contagem diferencial de clulas: Feita do meio (corpo) do esfregao para

a periferia (cauda), feita em movimento de ziguezague entre as duas extremidades

da lmina. Deve ser contado de forma a se diferenciar, pelo menos 100 clulas

(leuccitos) com o auxlio do contador de clulas.

Fig. 3 Contagem em lmina, forma de ziguezague.

 Aula 08:

Contagem de plaquetas em Cmara e em Lmina

Materiais:

01 Oxalato de amnio 1%;

02 Pipetas de vidro;

03 Pipetas automticas (20 L);

04 Cmaras de Neubauer;

05 Corante pantico;

06- Lminas e extensoras;

07- Tubos de ensaio

1. Contagem de plaquetas em Cmara de Neubauer: Contagem de plaquetas

se d pela adio de diluente lisante de hemcias (oxalato de amnio) para a

contagem de plaquetas e determinao direta em Cmara de Neubauer.

1.1 Procedimento:

1.1.1. Realizar a diluio de 1:200 de sangue e Oxalato de Amnio 1%:

1.1.2 Pipetar 4,0 mL de Oxalato de Amnio 1% em um tubo de ensaio;

1.1.3 Pipetar 20 microlitros de sangue junto ao Oxalato de Amnio;

1.1.4 Homogeneizar a soluo dentro do tubo de ensaio;

1.1.5 Colocar na Cmara de Neubauer;

11.6 Colocar a Cmara de Neubauer em cmara mida por 20 minutos;

1.1.5 - Contagem em Cmara de Neubauer:

1.1.5.1 - Realizar a contagem em 5 dos 25 quadrantes do Quadrante L5

1.1.5.2 Calcular o total de plaquetas/ microlitro:

Fig. 01 Plaquetas em cmara de Neubauer

 2. Contagem em lmina Mtodo de Fnio: Mtodo de contagem de

plaquetas realizado em lmina que leva em considerao a quantidade de plaquetas

observadas em lmina, em imerso, baseado em uma comparao com o nmero de

hemcias.

2.1 Procedimento:

2.1.1 Realizar a confeco do esfregao sanguneo, conforme praticado em

aulas anteriores;

2.1.2 Proceder a colorao da lmina, conforme descrito em aulas anteriores

2.1.3 Busca por rea da lmina com disposio de hemcias uniforme, repleta,

sem sobreposio (as hemcias se tocam, contudo no h sobreposio);

Fig. 02 - Campo adequado para contagem de plaquetas

2.1.4 - Contagem da quantidade mdia de hemcias por campo (contar pelo

menos 5 campos);

2.1.5 Calcular em mdia quantos campos de microscopia eu preciso para

encontrar 1.000 hemcias;

2.1.6 Contar quantas plaquetas esto distribuidas na quantidade de campos

estimada acima;

2.1.7 Fazer a relao direta de acordo com a quantidade de hemcias que

foram contadas na contagem de hemcias:

X plaquetas --------------- 1.000 hemcias

Y plaquetas ---------------- Z x 106 hemcias; onde:

X = Quantidade de plaquetas contadas no tem 2.1.5;

Y = Quantidade de plaquetas/ microlitro;

Z = Quantidade de hemcias do paciente;

Simplificando, temos:

Y = (X. Z. 106)/1.000

Y= X . Z. 1.000
 Laboratrio ____________________

HEMOGRAMA

Nome do paciente: ____________________________________________

ERITROGRAMA Valores de Referncia

Hemcias (/L)

Hemoglobina (g/dL)

Hematcrito (%)

V.C.M. (fL)

H.C.M. (pg)

C.H.C.M. (% ou g/L)

LEUCOGRAMA Valores de Referncia

------------------------ Relativo (%) Total (/L)

Leuccitos ---------------

Neutrfilos

Eosinfilos

Basfilos

Linfcitos

Moncitos

PLAQUETOGRAMA Valores de Referncia

Contagem de plaquetas (/L)

Metodologia utilizada:

Contagem de hemcias:

Dosagem de hemoglobina:

ndices hemantimtricos:

Contagem de leuccitos:

Contagem diferencial de leuccitos:

Contagem de plaquetas:

Bibliografia:
 Aula 09: Coagulograma 01

O coagulograma busca avaliar a

propriedade coagulativa do sangue

baseado na avaliao qualitativa da

formao do tampo plaquetrio e do

trombo por meio de tcnicas

realizadas em laboratrio. As tcnicas

basicamente avaliam a agregrao

plaquetria e a quantidade de

plaquetas, por meio da avaliao do

tempo de sangramento e da contagem

de plaquetas. Avaliam ainda a

formao de cogulo, de maneira

menos precisa, por meio do tempo de

coagulao e tambm por meio da

adio de clcio em plasma citratado,

avaliando a ao dos fatores da coagulao da cascata. Esse processo pode ser

testado tanto em sua fase de iniciao, por meio do TP (tempo de protrombina),

quanto na sua fase tardia, por meio do TTPa (tempo de tromboplastina

parcialmente ativado). O primeiro, TP, avalia a formao de cogulo por meio da

adio de fator tecidual sinttico e clcio em sangue com citrato de sdio

(sequestrante do clcio plasmtico reversvel), simula a via extrnseca, a iniciao,

da coagulao e tem VR de cerca de 10 a 14 segundos. O segundo, o TTPa, avalia a

formao de cogulo aps a oferta de fosfolipdio, anlogo aos fosfolpedes de

membrana das plaquetas, um ativador de superfcie anlogo ao encontrado na

superfcie das plaquetas (caulim) e clcio, simula a via intrnseca ou o processo de

amplificao da sntese de fibrina e tem VR de 30 a 40 segundos.

A coleta para determinao do TP e do TTPa devem obedecer rigorosamente os

protocolos de coleta ideal. Deve-se acertar diretamente a veia, com o mnimo

contato possvel com fator tissular (lquido tissular), o tempo de garroteamente

deve ser respeitado rigorosamente.

 Procedimentos de aula prtica:

01 Tempo de sangramento:Tempo necessrio para o estanque de uma sangria

determinada por uma leso de pequena inciso (lanceta). Esse teste avalia

basicamente a contrao reflexa dos vasos capilares e a adeso e agregao

plaquetria. Alteraes desse procedimento normalmente encontra-se relacionado

a plaquetopenia (abaixo de 100.000 plts/microlitro) ou deficincia do fator de von

Willebrand. Pacientes em uso de aspirina e anti-inflamatrios no-esteroidais

tambm podem aumentar o TS por inibio do Tromboxane A2 das plaquetas.

Material de uso:

01 Lanceta para puno digital;

02 Papel filtro absorvente;

03 Cronmetro.

1.1 Fazer a assepsia da polpa digital ou lbulo da orelha;

1.2 Furar a polpa digital com a lanceta e deixar o sangue fluir espontaneamente;

1.3 Marcar em cronmetro o incio no momento da primeira gota;

1.4 Secar o excesso de sangue com papel fitro, de 30 em 30 segundos, sem

encostar diretamente na inciso;

1.5 Ao cessar o fluxo, parar o cronmetro;

1.6 Valor de referncia: 1 a 3 minutos.

02 Tempo de coagulao: Avalia o tempo que o sangue coletado sem

anticoagulante consome at coagular-se completamente.

Materiais:

01 Material de puno venosa;

02 Tubo de ensaio sem anticoagulante;

03 Banho Maria a 37 C;

04 Cronmetro.

2.1 Colocar dois tubos de ensaio em banho maria a 37C;

2.2 Realizar a puno venosa, iniciando o tempo ao primeiro contato do sangue

com a seringa;
2.3 Transferir imediatamente cerca de 1 ml de sangue para cada um dos tubos

pr - aquecidos;

2.4 Voltar os tubos ao banho maria;

2.5 Manter os incubados por 3 minutos;

2.6 Aps trs minutos, movimentar um dos tubos de minutos em minuto, at o

ponto em que seja capaz de verte-lo quase que completamente sem que o sangue

escorra pelas paredes;

2.7 Inicie o exame do segundo tubo, vertendo-o de 30 em 30 segundos at que se

forme o cogulo, tal qual o primeiro;

2. 8 O tempo para a coagulao no segundo tubo o tempo de coagulao;

2.9 Valor de referncia: 5 10 minutos.

 Aula 10

Coagulograma 02

03 Coleta das amostras: Cada grupo realizar a coleta de um tubo de

amostra dos participantes do grupo em questo. A amostra poder ser coletada em

apenas uma seringa e em um procedimento, devendo coletar pelo menos 6 ml de

amostra. Evitar a procura pela veia durante o procedimento, minimizando o

contato com fluido tissular e evitar tambm o garroteamento prolongado. Deve-se

transferir o contedo da coleta para o tubo com citrato.

03 Tempo de Protrombina: Utiliza a tcnica de adio de fator tecidual

sinttico (tromboplastina) e clcio, em excesso, em uma amostra de sangue

anticoagulado com citrato de sdio. Esse processo anlogo ao processo

determinante para a fase de iniciao da sntese de protrombina e fibrina

(iniciao) do processo de coagulao. Essa tcnica capaz de avaliar

qualitativamente a formao do cogulo por meio dos fatores da coagulao

envolvidos nessa etapa da coagulao: Fatores VII, X e V, alm dos fatores da via

comum, II (protrombina) e I (fibrinognio). Elevaes no TP podem ser observadas

em casos de deficincias genticas dos fatores de coagulao, problemas hepticos

que alterem a sntese dos fatores, falta ou problemas de absoro da vitamina K

(utilizada na sntese dos fatores II, VII, IX e X) e uso de medicamentos

anticoagulantes ou que interfiram de alguma maneira na absoro de vitamina k.

Materiais:

01- Tubos de ensaio;

02 Banho Maria a 37 C;

03 Pipetas automticas (100 e 200 microlitros);

04 Ponteiras;

05 Tromboplastina e clcio (soluplastin);

06 Cronmetro
 3.1 Separar o plasma citratado em um tubo de ensaio;

3.2 - Pipetar 200 Microlitros do reagente A Soluplastin em um tubo de ensaio;

3.3 - Incubar os tubos, tanto de reagente como de plasma em banho maria a

37C por 3 minutos;

3.4 - Terminado o tempo de incubao misturar 100 microlitros do plasma

citratado aos 200 microlitros de reagente A previamente encubado E INICIAR O

CRONMETRO IMEDIATAMENTE APS A PIPETAGEM;

3.5 - Agitar o tubo e mant-lo em banho maria at o sexto segundo;

3.6 - Passado esse tempo, verter o tubo a cada segundo at verificar a

formao de cogulo;

3.7 - Anotar o tempo encontrado como TP do paciente;

3.8 Valor de Referncia: 10 14 s.

04 Tempo de Tromboplastina Parcial Ativado (TTPa): Avalia o tempo de

formao do cogulo aps a incluso da cefalina, a comportar como um anlogo dos

lipdeos de membrana das plaquetas e clcio. Avalia os fatores da coagulao em

sua fase secundria, a de amplificao, que ocorre na superfcie das plaquetas.

Avalia dessa maneira os fatores: VIII, V, IX e XI, alm dos fatores da via comum

II (protrombina) e I (trombina). Pode estar aumentado nos casos de deficincia

gentica desses fatores e uso de anticoagulantes.

Materiais:

01- Tubos de ensaio;

02 Banho Maria a 37 C;

03 Pipetas automticas (100 microlitros);

04 Ponteiras;

05 Cefalina, caulim e clcio

06 Cronmetro

4.1 Pipetar 100 Microlitros do plasma citratado em um tubo de ensaio;

4.2 Misturar ao plasma 100 Microlitros do reagente A (RA - cefalia + caulim);

4.3 Incubar a amostra + RA em banho maria a 37C por 3 minutos;

 4.4 Terminado o tempo de incubao misturar 100 microlitros do reagente B

(clcio) a amostra plasma + RA previamente incubado E INICIAR O

CRONMETRO IMEDIATAMENTE APS A PIPETAGEM;

4.5 Agitar o tubo e mant-lo em banho maria por 30 segundos;

4.6 Passado esse tempo, inverter o tubo a cada segundo at verificar a

formao do cogulo;

4.7 Anotar o tempo encontrado como tempo de TTPa do paciente;

4.8 Valor de Referncia: 30 40 s.

05 TP e TTPa em metodologia semi-automtica:

5.1 TP:

5.1.2 Colocar o reagente A sobre a placas trmica do equipamento;

5.1.2 - Pipetar 50 microlitros do plasma em uma cubeta com magneto;

5.1.3 - Apertar no equipamento a opo incub

5.1.4 - Selecionar por meio das setinhas para cima a incubao por 2 minutos;

5.1.5 - Aguardar o perodo de incubao;

5.1.6 - Selecionar o boto test at que aparea a opo TP;

5.1.7 - Colocar a cubeta com amostra no espao de leitura. Para tal, empurre a

tampa do leitor para cima cuidadosamente e encaixe sua cubeta na posio de

leitura, observando o posicionamento do bico da cubeta;

5.1.8 - Pipetar 100 microlitros do reagente A incubado;

5.1.9 - Lanar o reagente rapidamente e verticalmente sobre o plasma, pelo

orifcio da tampa da cabine de leitura (sem abri-la e sem encostar no plasma da

cubeta);

5.9.10 Aguardar a leitura.

5.9.11 Apertar a opo FIM

 5.2 TTPa:

5.2.1 Colocar os Reagentes A e B sobre a placa trmica;

5.2.2 Pipetar 50 microlitros de plasma e 50 microlitros de Reagente A em uma

cubeta com magneto;

5.2.3 Apertar no equipamento a opo incub;

5.2.4 Selecionar por meio das setinhas para cima a incubao por 2 minutos;

5.2.5 Aguardar o perodo de incubao;

5.2.6 Selecionar o boto test at que aparea a opo TTPa;

5.2.7 Colocar a cubeta com amostra + RA no espao de leitura. Para tal,

empurre a tampa do leitor para cima cuidadosamente e encaixe sua cubeta na

posio de leitura, observando o posicionamento do bico da cubeta;

5.2.8 Pipetar 50 microlitros do reagente B incubado;

5.2.9 Lanar o reagente B rapidamente e verticalmente sobre a amostra, pelo

orifcio da tampa da cabine de leitura (sem abri-la e sem encontrar no plasma da

cubeta);

5.2.10 Aguardar a leitura

5.2.11 Selecionar a opo fim do equipamento.

 AULA 11:

Tipagem sangunea

Por motivos genticos existem diferenas na apresentao de glicolipdeos de

membrana das hemcias que determinam diferenas na expresso fenotpica

dessas clulas. O mais comum entre essas alteraes o sistema de disperso

mundial conhecido como sistema AB0. Nesse sistema existe uma mudana em

acar expresso no glicolipdeo de membrana, conhecido como substncia H,

determinado por padres genotpicos caractersticos, formando padro fenotpico

conhecido como Tipo A, Tipo B, Tipo AB ou Tipo 0. No tipo A existe a adio de N-

acetil-glactosamina (galnac) terminal. No tipo B uma galactose terminal (gal). No

tipo 0 (zero) no h a adio de um acar terminal, tendo o final comum uma

fucose (fuc) e no tipo AB existe a expresso de ambos acares nas hemcias.

galnac gal
gal gal gal fuc

fuc fuc

Fig. 01 Esquematizao da estrutura terminal da substncia H dos Tipos A, B

e 0 (zero), respectivamente.

Um detalhe importante a ser considerado sobre o sistema AB0 que a

presena dos acares terminais do grupo A e do grupo B, chamados de

aglutinognios, so capazes de gerar resposta imunolgica imediata em pessoas que

no apresentam esses aglutinognios em suas hemcias, e que, portanto,

apresentam aglutininas contra esses aucares em seu plasma, naturalmente, sem a

necessidade de prvia imunizao. Portanto, indivduos com hemcias com

aglutinognio A, apresentam aglutininas anti B e indivduos com hemcias do tipo B

apresentam aglutininas anti A. Indivduos do grupo zero, no apresentam

aglutinognio, contudo apresentam aglutininas anti A e anti B, j os do grupo AB

apresentam ambos aglutinignios, contudo no apresentam aglutininas.

As hemcias contendo determinado aglutinognio, caracterstico de um grupo

sanguneo, sofre aglutinao na presena de uma aglutinina correspondente,

caracterizando os testes realizados para a triagem de tipagem sangunea do tipo

AB0.

Alm do sistema AB0, outro aglutinognio de superfcie importante chamado

de Rh. O termo se deve a sua descoberta oriunda da observao da aglutinao de

algumas amostras (na verdade da maioria delas) aps contato com soro de cobaia,

previamente inoculados com sangue de Macacus rhesus. Determinado

geneticamente pelo gene RhD ou Rhd, tem seu fentipo caracterizado pela

expresso ou no da protena D na superfcie das hemcias, formando os tipos Rh +

ou Rh -, respectivamente, sendo que cerca de 85% da populao tida como

portadora da protena de superfcie D (Rh +). Diferentemente do sistema AB0,

contudo, indivduos Rh - dependem de estimulao prvia, por meio do contato do

indivduo com a protena, para a produo de imunoglobulinas (aglutininas) que vo

aglutinar as hemcias Rh +.

A identificao da protena de superfcie se da por meio da aglutinao de

hemcias portadoras, na presena de soro anti-D. Algumas pessoas apresentam a

protena D em baixssimo grau, chamado de D fraco ou Du. Nesse caso,

fenotipicamente so consideradas Rh negativas, contudo a presena do fator Du

de significativa importncia, j que capaz de determinar a sensibilizao de outro

indivduo Rh negativo. Nesse caso, pacientes com presena de Du so tratados

como Rh negativos quando receptores de sangue e como Rh positivos quando

doadores.

O Du em tcnica comum no evidenciado, sendo caracterizado como Rh

negativo aps a exposio direta ao soro Anti-D. Embora no seja capaz de gerar

aglutinao de hemcias e visualizao da reao, os anticorpos IgG anti-D ficam

fixados a membrana das clulas e podem ser evidenciados com a utilizao de soro

anti IgG humano (soro de coombs) determinando aglutinao pela adeso desses

anticorpos aos anti-D (IgG) fixados na membrana eritrocitria.

A aula prtica proposta tem o objetivo de realizar a tipagem sangunea por meio

da utilizao dos soros Anti-A, Anti-B e Anti-Rh e da tcnica para deteco ou no

do Du. Para a tipagem sero realizadas duas tcnicas distintas, em lmina e em

tubo com centrifugao, sendo a primeira mais simples, porm menos segura, pois

existe menos protocolos de purificao das hemcias e menos contato entre o soro

e os aglutinognios das hemcias em questo.

 Procedimento de aula prtica

1 Coleta das amostras: Cada grupo realizar a coleta de um tubo de amostra

dos participantes do grupo em questo e transferida para um tubo de EDTA.

2 Realizar a tipagem sangunea em lmina:

2.1 Separar duas lminas de vidro limpas;

2.2 Pingar 50 microlitros de sangue puro, sem diluio, em um canto da lmina;

2.3 Pingar 50 microlitros de sangue puro, sem diluio, no outro canto da mesma

lmina do item anterior;

2.4 Pingar uma gota de soro anti- A (azulado) sobre a gota do tem 2.2;

2.4 Pingar uma gota de soro Anti B (amarelado) a gota de sangue do tem 2.3;

2.5 Misturar o soro com o sangue com o auxlio da prpria ponteira, o anti-A

com a ponta inferior e o anti-B com a ponta superior;

2.6 Realizar a leitura de aglutinao ou no das hemcias:

Leitura:

4.6.1 Aglutinao das hemcias com o soro Anti-A: _______

4.6.2 Aglutinao das hemcias com o soto Anti B: _______

4.6.3 Aglutinao das hemcias em nenhuma das gotas: _______

4.6.4 Aglutinao das hemcias nas duas gotas: __________

2.7 Em uma segunda lmina pingar mais 50 microlitros de sangue puro;

2.8 Sobre o sangue pingar uma gota de soro Anti-D;

2.9 Misturar com a ajuda da ponteira

2.10 Verificar a aglutinao (Rh +) ou no (Rh -) das hemcias.

Fig.1 Representao da leitura de aglutinao.

 3 Tipagem em tubo: Antes de comearmos, vamos realizar a diluio das

hemcias do paciente para a realizao desse processo e a diluio das

hemcias O+ para realizao do fator D fraco:

3.1 Diluio das hemcias:

3.1.1 Identificar um tubo de ensaio como: T5%

3.1.2 Colocar nesse tubo de ensaio 950 microlitros de soluo salina;

3.1.3 Colocar junto a soluo salina 50 microlitros da amostra de sangue

coletada;

3.1.4 Identificar um tubo de ensaio como: Tipo0+ 5%;

3.1.5 Colocar nesse tubo de ensaio 950 microlitros de soluo salina;

3.1.6 - Colocar junto a soluo salina 50 microlitros da amostra de sangue tipo

O+ (ver com os colegas ou professor);

3.1.7 - Identificar um tubo de ensaio como: A 5%;

3.1.8 Colocar nesse tubo de ensaio 950 microlitros de soluo salina;

3.1.9 - Colocar junto a soluo salina 50 microlitros da amostra de sangue tipo A

(ver com os colegas ou professor);

3.1.10 Identificar um tubo de ensaio como: B 5%

3.1.11 Colocar nesse tubo de ensaio 950 microlitros de soluo salina;

3.1.12 - Colocar junto a soluo salina 50 microlitros da amostra de sangue tipo

B (ver com os colegas ou professor);

3.1.13 Centrifugar todos os tubos a 1200 rpm por 1 minuto e ressuspender as

hemcias dentro do tubo.

3.2 Tipagem em tubo:

3.2.1 Identificar 3 tubos de ensaio: A; B e D;

3.2.2 Em cada um dos tubos, pipetar 50 microlitros de hemcias lavadas T5%;

3.2.3 Pingar uma gota de soro Anti-A (azul) no tubo A;

3.2.4 Pingar uma gota de soro Anti-B (amarelo) no Tubo B;

3.2.5 Pingar uma gota de soro Anti D (incolor) no Tubo D;

3.2.6 Centrifugar os tubos a 1.200 rpm por 1 minuto;

3.2.7 Verificar a presena de hemaglutinao ou no tubos A e B revolvendo

suavemente as hemcias:
 3.3 Leitura AB0:

3.3.1 Aglutinao no Tubo A?

3.3.2 Aglutinao no Tubo B?

3.3.3 Aglutinao no Tubo A e B?

3.3.4 Aglutinao nem no tubo A e nem no tubo B?

3.4 Leitura Anti-D:

3.4.1 Verificar a aglutinao no tubo D revolvendo suavemente as hemcias:

3.4.2 Aglutinao no Tubo D?

Fig. 2 Formao de aglutinao em tubo

3.5 Comprovao por prova reversa:

3.5.1 Centrifugar tubo da amostra;

3.5.2 Identificar 3 tubos de ensaio como A; B e O;

3.5.3 Acrescentar 100 microlitros de plasma em cada tubo de ensaio;

3.5.4 Acrescentar 100 microlitros de hemcias lavadas e diludas tipo A no

tubo A;

3.5.5 - Acrescentar 100 microlitros de hemcias lavadas e diludas tipo B no

tubo B;

3.5.6 - Acrescentar 100 microlitros de hemcias lavadas e diludas tipo 0 no

tubo 0;

3.5.7 Homogeneizar o tubo, realizar a centrifugao a 1.200 rpm e fazer a

leitura;
 4 Testagem do fator Du: Em rotina normal realizado apenas em

pacientes com fator Rh negativo, contudo, em nossa aula faremos em todos os

grupos, mesmo que de sabidamente positivo.

4.1 Identificar 3 tubos de ensaio: T; CP; CN (teste, Controle Positivo e Controle

negativo, respectivamente);

4.2 Pingar 100 microlitros de hemcias T5% no tubo T;

4.3 Pingar 100 microlitros de hemcias T5% no tubo CN;

4.4 Pingar 100 microlitros de hemcias O5% no tubo CP;

4.5 Pingar 2 gotas do soro anti-D no tubo T (hematologia);

4.6 Pingar 2 gotas do soro anti D no tubo CP (hematologia);

4.7 Incubar em banho maria a 37 C por 20 minutos;

4.8 Lavar as hemcias em soluo salina:

4.8.1 Colocar 800 microlitros de soluo fisiolgica nos tubos T; CP e CN;

4.8.2 Centrifugar a 3.000 rpm por 5 minutos;

4.8.3 Desprezar o sobrenadante;

4.8.4 Repetir o procedimento por mais duas vezes;

4.9 Pingar duas gotas de soro de Coombs nos tubos: T; CN; CP j lavados;

4.10 Centrifugar a 1.200 rpms por 1 minuto;

4.11 Fazer a leitura revolvendo suavemente as hemcias sedimentada e

observando a presena de aglutinao.

 Aula 12:

Exame de Urina

01 Coleta da amostra:

01.1 Homens: Passar ao paciente as informaes abaixo, importantes para

evitar resultados errneos e dificuldades na anlise por excesso de detritos na

urina. A amostra de urina idealmente deve estar represada na bexiga por pelo

menos 4 horas. Em amostras de urgncia (pronto socorro) as medidas de

higienizao devem ser igualmente seguidas.

01 - Lavar as mos, em seguida lavar o pnis, retraindo todo o prepcio,

enxaguar e secar com gaze estril ou toalha bem limpa;

02 - com uma das mos, afastar o prepcio;

03 - com a outra mo segurar o frasco j destampado, desprezar o primeiro

jato de urina e coletar a poro mdia da urina (20-50ml) em frasco estril;

04 - tampar o frasco imediatamente e desprezar o restante da mico no vaso

sanitrio;

05 - tomar cuidado para no tocar no interior do frasco ou da tampa.

01.2 Mulheres: Passar ao paciente as informaes abaixo, importantes para

evitar resultados errneos e dificuldades na anlise por excesso de detritos na

urina. A amostra de urina idealmente deve estar represada na bexiga por pelo

menos 4 horas. Em amostras de urgncia (pronto socorro) as medidas de

higienizao devem ser igualmente seguidas.

01 - No momento da higiene e da coleta, manter os grandes lbios afastados.

Lavar a regio genital de frente para trs, enxaguar e secar, usando gaze estril

ou toalha bem limpa. No usar duas vezes a mesma gaze. Nunca inverter este

movimento.

02 - sentar no vaso sanitrio com as pernas afastadas e, com uma das mos,

afastar os grandes lbios;

03 - com a outra mo segurar o frasco j destampado, desprezar o primeiro

jato de urina e coletar a poro mdia da urina (20-50ml) em frasco estril;

04 - tampar o frasco imediatamente e desprezar o restante da mico no vaso

sanitrio;

05 - tomar cuidado para no tocar no interior do frasco ou da tampa.

 01.3 Crianas:

01- Retirar o papel que recobre a parte adesiva do saco coletor.

02- Fixar o orifcio do saco coletor regio genital em torno da uretra.

03 - Aguardar que a criana urine.

04 - Se a criana no urinar em um perodo de 30 minutos, repetir a higiene e

trocar o saco coletor. Assim que a criana urinar, retirar o saco coletor e fech-lo

colando as bordas do orifcio. Tomar cuidado para no tocar na parte interna do

coletor. Verificar se est bem vedado.

Obs: aps a coleta a urina deve ser enviada ao laboratrio o mais rpido possvel,

no ultrapassando 1 hora.

02 Materiais utilizados para processamento do exame (EAS):

. Tubos plsticos graduados de fundo cnico;

. Grades adequadas;

. Ponteiras;

. Micropipetas;

. Cmaras de Neubauer;

. Lamnulas

. Tiras reativas;

. Microscpio;

. Centrfuga;

03 Procedimentos: Os procedimentos para a realizao dos EAS so

basicamente divididos em trs momentos:

. Anlise fsica da urina

. Anlise qumica da urina

. Anlise do sedimento urinrio

03.1 Anlise fsica:

3.1.1 Homogeneizar a urina ainda dentro do coletor universal

3.1.2 Verter 10 ml de urina para o tubo falcon;

3.1.3 Realizar a identificao do tubo falcon;

3.1.4 Anotar o volume de urina colocado no tubo;

3.1.5 Verificar a colorao da urina;

 3.1.6 Verficiar o odor da urina;

3.1.7 Colocar o tubo contra a luz e verificar a aspecto;

03.2 Anlise qumica:

3.2.1 Pegar uma tira reativa;

3.2.2 Submergir rapidamente toda a tira na urina colocada no tubo falcon;

3.2.3 Manter a tira submersa por no mais que 10 segundos;

3.2.4 Retirar a tira reativa e secar o excesso em papel absorvente;

3.2.5 Realizar a leitura dos parmetros qumicos da urina baseado no grfico

de cores situado no corpo do recipiente das tiras reativas;

03.3 Sedimentoscopia:

3.3.1 Tampar o tubo falcon de urina com a tampa de rosca;

3.3.2 Proceder a centrifugao a 2.000 rpm por 5 minutos;

3.3.3 Retirar o excesso de sobrenadante mantendo apenas 1 ml de urina no

tubo falcon;

3.3.4 Realizar a anotao da presena ou no de depsito na urina;

3.3.5 Ressuspender o depsito na urina remanescente (1ml);

3.3.6 Proceder a leitura do depsito em Cmara de Neubauer.

04 Algumas observaes importantes:

4.1 Manipulao da amostra:

01 - Sempre utilizar luvas para manipular amostras.

02 Conferir a identificao da urina de acordo com o protocolo emitido.

03 Verificar a vedao ideal do coletor e em seguida realizar a

homogeneizao da urina por inverso suavemente.

04 Separar em tubo cnico graduado 10 ml de urina.

5.2 Anlise fsica da urina: Compreende a verificao do volume coletado,

aspecto da urina, cor da urina, eventualmente a presena de odor ftido e a

presena ou no de depsito aps centrifugao.

 05.2.1 Volume: Deve ser anotado o volume mdio de urina coletada,

especialmente, em casos eventuais em que o volume de urina for inferior a 10 ml.

05.2.2 Aspecto: O aspecto da urina deve ser observado em um frasco

transparente e contra a luz (pode ser feita no prprio tubo cnico caso este seja

translcido). Deve ser anotado como lmpido, ligeiramente turvo ou turvo de acordo

com a percepo em relao a turbidez da urina ao ser observada contra a luz.

Lmpido - partculas no visveis, transparente;

Ligeiramente turvo - algumas partculas, texto impresso pode ser visto atravs

da urina;

Turvo - muitas partculas, texto impresso no pode ser visto atravs da urina;

05.2.3 Cor: A cor habitual da urina amarelo citrino, o que se deve, em sua

maior parte, ao pigmento urocromo. Avaliar a cor da urina de acordo com a

seguinte classificao:

Incolor; Amarelo Claro; Amarelo Citrino; Amarelo Escuro; mbar (amarelo

acastanhado); Laranja; Vermelho; Verde; Marrom; Preto.

05.2.4 Depsito: A anlise da presena ou no de depsito deve ser feita

aps a relizao da centrifugao (2000 rpm por 5 minutos). O depsito pode estar

ausente, escasso, moderado ou intenso e deve ser analisado concomitantemente ao

aspecto e ao exame microscpico de acordo com a tabela 1.

Tabela 1 Correlao do Aspecto e Depsito com exame microscpico.

Aspecto Depsito Nmero de Elementos

Sem alteraes quantitativas nos elementos normais;

Lmpido Ausente
Ausncia de estruturas anormais.

Pequenas alteraes quantitativas nas estruturas normais,

Ligeiramente
Escasso podendo ser observado estruturas anormais; e/ou
Turvo
+/4+ a ++/4+ cristais ou muco.

Grandes alteraes quantitativas nas estruturas normais

e, geralmente, se observam estruturas anormais de valor

Turvo Moderado
diagnstico; e/ou

+++/4+ cristais ou muco.

Grandes alteraes quantitativas nas estruturas normais

e, geralmente, se observam estruturas anormais de valor

Turvo Intenso
diagnstico; e/ou

++++/4+ cristais ou muco.

 05.3 Anlise qumica da urina: Feito a partir de leitura colorimtrica em tira

reativa, podendo a leitura ser realizada em equipamento especfico ou visualmente

01 Verificar antes de tudo as condies da tira reativa: Prazo de validade, cor

das reas reativas e se as tiras reativas esto plenamente secas.

02 - Mergulhar a tira completamente na urina e de maneira rpida (deixar

aproximadamente 5 segundos).

03- Retirar lateralmente o excesso de urina em papel absorvente.

04 - Aguardar o tempo especificado (tempo ideal: aps 60 segundos e antes de 120

segundos) e realizar a leitura no analisador de urina.

Utilizar os seguintes critrios de expresso:

pH: valor de pH lido na tira.

Protenas: ausente, traos, 1+ a 4+;

Glicose: ausente, 1+ a 4+;

Cetonas: ausente, 1+ a 4+;

Sangue: ausente, traos, 1+ a 3+;

Bilirrubinas: ausente, 1+ a 3+;

Urobilinognio: normal (< 1mg/dl) ou aumentado;

Nitrito: negativo ou positivo;

Esterase Leucocitria (Leuccitos): ausente, 1+ a 3+

cido ascrbico: ausente, 1+ a 3+;

Densidade (Gravidade especfica - SG): valor de densidade lido na tira.

05.4.3 Clculo para o resultado (clulas/ml): O nmero de estruturas

contadas na cmara de Newbauer dada pela seguinte frmula:

Nmero de estruturas contadas/ml = VF x NC x FC x 1000

VI x A

Sendo:

VF = volume final (1mL); NC = nmero de estruturas contadas nos quatro

quadrantes ; FC = fator da cmara de Neubauer (10) o volume de cada quadrante

de 0,1mm; 1000 = fator de converso de mm para ml;

VI = volume inicial (10mL); A = rea contada (4) quatro quadrantes laterais

Obs.: Quando o sedimento estiver muito concentrado, efetuar uma diluio com

soluo fisiolgica e multiplicar o resultado pelo fator de diluio.

05.4.4 Expresso dos resultados: Devero ser expressos da seguinte forma:

01 - Clulas epiteliais, leuccitos, hemcias e cilindros (identificados o tipo): n /

ml

02 - Cristais e Muco

Expressar em cruzes (1+ a 4+/ 4+)

Ao se verificar a presena de cristais na urina, deve-se considerar o pH

urinrio, para a correta identificao do tipo de cristal (vide Quadro 1).

03 - Microbiota (Flora bacteriana)

o Ausente

o Moderada

o Intensa

Obs.: somente liberar flora aumentada (moderada ou intensa) quando em

associao com leuccitos aumentados e com preservao adequada da amostra.

 Fig. 03 Alguns elementos que podem ser encontrados no sedimento urinrio

06 Algumas consideraes:

01 - Reao de nitrito negativa no exclui o diagnstico de infeco urinria.

02 - Densidade menor que 1010 e/ou pH maior que 7,5 em geral destroem os

elementos figurados;

03 - Um pH de 9,0 est associado conservao incorreta da amostra e, portanto,

deve-se solicitar a coleta de nova amostra;

04 - O sedimento urinrio pode conter Trichomonas (especificar vaginalis para o

sexo feminino e sp para sexo masculino), espermatozides (relatados apenas

quando for do sexo masculino) e clulas leveduriformes. Este achados so

descritos na observao;

05 - Outros dados, quando presentes, tambm devem ser descritos: presena de

aglomerados de picitos, parasitas (ovos de helmintos, caros, etc.) e outros.

 Elementos Anormais de Sedimentoscopia

Anlise fsica Valores de Referncia

Volume:

Cor:

Odor:

Aspecto:

Depsito:

Anlise qumica Valores de Referncia

pH:

Protenas:

Glicose:

Cetonas:

Sangue:

Bilirrubinas:

Urobilinognio:

Nitrito:

Leuccitos:

cido ascrbico:

Densidade:

Sedimentos

Clulas epiteliais:

Leuccitos:

Hemcias:

Observao:
 Aula 13:

Exame Parasitolgico de Fezes

01 Escolha do mtodo: As formas parasitrias variam tanto quanto a seu peso

quanto a seu tempo de vida em ambiente externo. Assim no existe um mtodo
capaz de diagnosticar, ao mesmo tempo, todas as formas parasitrias. Alguns
mtodos so mais gerais, permitindo o diagnstico de vrios parasitos intestinais,
como o caso do mtodo de Hoffman. Outros mais especficos, que sero
utilizados em situaes diagnsticas especficas, como os mtodos de flutuao
espontnea para deteco de ovos leves (Willis) e o mtodo de termotropismo
(Rugai) para deteco de larvas de Strongyloides stercoralis. Mesmo em situaes
que se especifique o diagnstico de uma parasitose especfica, o mtodo dever
ser acompanhado de um mtodo geral, visto a grande possibilidade de coinfeces
ou de dvidas, j que a manifestao clnica muitas vezes se confunde entre os
diversos parasitos intestinais.
02 Mtodo geral (Hoffman):

02.1 - Material necessrio:

. Amostra de fezes frescas

. 01 Copo descartveis

. 01 clices de vidro

. 01 peneira descartveis (parasitofiltro)

. 01 gaze dobradas em quatro

. 01 palitos de picol

. 01 pipeta (canudinho)

. 01 lamna de vidro e lamnulas 24x40 mm

. Lugol e recipiente com gua (2 litros)

02.2 Mtodo:

01 Colocar cerca de 2g de fezes em um frasco (copo descartvel) com cerca de 5

ml de gua e triturar a amostra com o auxlio de um basto de vidro ou palito de
picol.

02 Acrescentar mais 20 ml de gua.

03 Filtrar a suspenso para um clice cnico por intermdio de uma peneira

acoplada a uma gaze dobrada em quatro.

04 Os detritos retidos so lavados com mais 20 ml de gua, agitados

constantemente com o basto de vidro ou palito de picol.

05 Completar o volume do clice (200ml) com gua.

06 Deixar a suspenso em repouso por cerca de 2 a 24 horas (No caso da aula, 1

hora).

07 Findo o perodo mencionado acima, observar o aspecto do sobrenadante.

Estando o lquido ainda turvo, descarta-lo sem resuspender o sedimento e colocar
mais gua at o volume anterior e deixar em repouso por mais 60 minutos. Estando
o sobrenadante lmpido, colher uma amostra do sedimento para exame.

08 Coletar o sedimento utilizando-se uma pipeta (ou canudo de festa), tapando a

ponta do canudo at que o mesmo alcance o sedimento, retirar o dedo e deixar
subir uma pequena poro de sedimento. Alternativamente, pode-se desprezar o
sobrenadante, homogeneizar o sedimento e colher uma gota.

09 Colocar uma gota do sedimento coletado em lmina, pingar uma gota de lugol e
colocar uma lamnula sobre a preparao que est pronta para ser analisada.
03 Mtodo de Willis (ovos leves):

03.1 - Material necessrio:

. Amostra de fezes recm-coletadas

. 01 copos descartveis

. Soluo saturada de acar ou sal

. 01 peneiras descartveis

. 01 gaze dobradas em 4x

. 01 coletor universal

. lminas

. lamnulas

. Lugol

03.2 Mtodo:

01- Colocar cerca de 10g de fezes em um frasco ou bequer de vidro.

02 Diluir a amostra em soluo saturada de acar ou sal.

03 Realizar a filtrao da amostra em gaze dobrada em 4x.

04 Passar a soluo filtrada para um tubo de ensaio de vidro ou frasco coletor

universal.

05 O volume passado para o frasco deve ser suficiente para a formao de um

menisco na boca do frasco.

06 Colocar uma lmina em contato com o menisco formado na boca do frasco e

deixar em repouso por cinco minutos.

07 Findo este tempo, retirar rapidamente a lmina, voltando parte molhada

para cima e cobrir com uma lamnula.

08 Levar ao microscpio e examinar com objetiva de 10 e ou 40x

04 Mtodo de Rugai (termotropismos):

04.1 - Material utilizado:

. Amostras de fezes recm coletadas

. Gaze para trouxa dobrada em 4x

. ligas ou grampos

. clice de vidro

. Banho Maria ajustado a 45C

. pipetas (canudinhos)

. lminas e lamnulas

. Lugol

04.2 Mtodo:

01 Retirar e utilizar a prpria tampa do coletor universal para a realizao do

mtodo.

02 Colocar cerca de 2 g de fezes sobre a tampa do coletor universal e envolver a

tampa do coletor em uma gaze dobrada em 4x, formando uma trouxa.

03 prender com uma liga, ou grampo ou liga metlica ou fita a base da trouxa para
que no se desfaa.

04 Colocar a trouxa com a face que se encontra com fezes, voltada para baixo,
em um clice de vidro com gua a 45C, em volume suficiente para que as fezes
permaneam em contato com a gua.

05 Deixar por cerca de uma hora em repouso.

06 Colher o sedimento ao fundo do clice com uma pipeta ou canudo.

07 Colocar uma gota do sedimento em lmina e pingar uma gota de lugol.

08 Colocar lamnula o observar em microscpio.

 Aula 14:

Dosagem de glicose por metodologia de ponto final e cintica

A determinao da glicose se da por uma metodologia enzimtica colorimtrica

por meio da ao da glicose oxidase que catalisa a oxidao da glicose com

formao de perxido de hidrognio, que, ao se associar a 4-Aminoantipirina e

fenol por ao da enzima peroxidase, forma um complexo de colorao

avermelhada, cuja tonalidade varia em funo da concentrao direta de glicose na

amostra e pode ser dessa maneira dosado por espectrofotometria com leitura de

absorbncia a 490-520 nm.

A reao pode ser dosada com esse reagente segundo dois procedimentos

distintos que sero feitos na aula prtica: Por ponto final ou por metodologia

cintica. A metodologia por ponto final determina a leitura da reao aps o

consumo de todo o reagente (no caso a glicose) e formao de colorao estvel ao

final do processo (figura 1).

A metodologia cintica baseada na leitura da formao de cor enquanto a

reao acontece em um perodo da reao em que a formao do produto

colorimtrico se d em velocidade constante.

Fig. 2 Reao cintica contnua e reao cintica de dois pontos

 Basicamente, em procedimentos manuais a reao de ponto final se torna mais

prtica, pois independe da termostatizao da cubeta j que a reao j se

encontra estvel, enquanto o procedimento cintico depende da temperatura

constante durante a reao (normalmente 37C), contudo se torna um

procedimento de leitura mais rpida, comumente utilizado para a automao.

Procedimento:

Obs: Antes de iniciarmos os procedimentos de aula, ligar o

espectrofotmetro na sesso de bioqumica e deixar em repouso por 30

minutos para sua estabilizao.

1. Coleta de sangue: Realizao de puno venosa em cada grupo e

transferncia da amostra a tubo de soro ou de plasma com fluoreto de sdio.

2. Dosagem da glicose por tempo fixo:

Materiais:

Tubos de ensaio de vidro;

Pipetas de vidro e pipetador de borracha;

Espectrofotmetro e cubetas;

Amostra de controle comercial para bioqumica (Valor mdio 8913 mg/dL);

Padro comercial para glicose (100 mg/dL);

Pipeta automtica para 30 microlitros e ponteiras;

2.1 Identificar 4 tubos de ensaio: Um como Branco, um como padro, um como

controle e um como teste.

2.2 Em cada tubo colocar 3ml do reativo para dosagem de glicose;

2.3 Pipetar 30 microlitros do padro no tubo padro;

2.4 Pipetar 30 microlitros de soro ou plasma no tubo teste;

2.5 Pipetar 30 microlitros de amostra controle no tubo controle;

2.6 No pipetar nada no tubo branco (apenas o reagente);

2.7 Identificar todos os tubos com alguma identificao de seu grupo;

2.8 Colocar os tubos em banho maria a 37 C (separao de materiais) por 10

minutos;
 2.9 Enquanto espera-se a incubao da amostra zerar o equipamento

(espectrofotmetro)

2.9.1 - Observar o comprimento de onda do monocromador para a leitura da

absorbncia, que nesta reao deve ser de 500 nm;

2.9.2 Abrir a tampa de acesso as cubetas do equipamento;

2.9.3 - Colocar a cubeta opaca na primeira posio;

2.9.4 - Zerar com a cubeta opaca a transmitncia do equipamento;

2.10 Terminado o tempo de incubao levar as amostras para serem analisadas

na sesso de bioqumica;

2.11 Colocar 3 ml do reagente para dosagem de glicose do tubo branco em uma

cubeta de vidro;

2.12 Colocar 3 ml do contedo do tubo padro em uma cubeta de vidro;

2.13 Colocar 3 ml do contedo do tubo controle em uma cubeta de vidro;

2.14 Colocar 3 ml do contedo do tudo teste em uma cubeta de vidro;

2.15 Colocar as cubetas de vidro no trilho de amostras do

espectrofotmetro nessa ordem;

2.16 Zerar a absorbncia da reao com o reagente como branco no primeiro

ponto do carretel de amostras;

2.17 Realizar e anotar a leitura da absorbncia do padro na terceira posio

do carretel de amostras;

2.18 - Realizar e anotar a leitura da absorbncia do controle na prxima posio

do carretel de amostras;

2.19 - Realizar e anotar a leitura da absorbncia do teste na prxima posio do

carretel de amostras;

2.20 Estabelecer as concentraes do controle e do teste com base na

relao da absorbncia e concentrao do padro por meio de regra de trs ou por

clculo do fator (Concentrao do padro/ Absorbncia (500nm))

Ap Cp Ct x Ap = Cp x At

At Ct Ct = At x (Cp/Ap) Fator de Calibrao

 2.21 Verificar a validade da reao baseado no valor de dosagem do controle;

2.22 Esperar que todos os grupos realizem a leitura de suas absorbncias e

seus clculos.

3. Dosagem da glicose por mtodo cintico: Essa dosagem ser realizada a

cada grupo por vez, podendo os demais observarem a execuo at que chegue a

sua vez. Ser feita no espectrofotmetro semiautomtico, porque o equipamento

que apresenta a cubeta com termostato. Os primeiros procedimentos sero

realizados junto com toda a turma;

Materiais:

Tubos de ensaio de vidro;

Pipetas de vidro e pipetador de borracha;

Espectrofotmetro e cubetas;

Amostra de controle comercial para bioqumica (Valor mdio 8913 mg/dL);

Padro comercial para glicose (100 mg/dL);

Pipeta automtica para 20 microlitros e ponteiras;

3.1 Cada grupo dever novamente identificar seus tubos com as iniciais do seu

grupo e com as identificaes para tubo padro, controle e teste;

3.2 Cada grupo deve pipetar 2 ml de reagente para dosagem de glicose em

cada um dos tubos identificados;

3.3 Colocar os tubos identificados, bem como ependorfs de controle e

calibrador, de forma organizada, no banho maria da bioqumica a 37C ao lado do

espectrofotmetro;

3.4 Em um trabalho conjunto de toda turma iremos configurar a nossa reao

no equipamento, tendo como guia as instrues de bula do kit, anexada ao roteiro;

3.4.1 Ligar o equipamento (verificar a voltagem);

3.4.2 Esperar o tempo de estabilizao de temperatura;

3.4.3 Selecionar a opo test do equipamento;

3.4.4 Buscar e selecionar um opo que esteja em branco;

3.4.5 Selecionar a opo de edio;

3.4.6 Nomear o teste a ser arquivado;

3.4.7 Selecionar o mtodo adequado para a dosagem (vide bula);

 3.4.8 Selecionar a unidade que se apresentar o resultado;

3.4.9 Selecionar a temperatura que a cubeta permanecer durante a reao;

3.4.10 Selecionar o comprimento de onda da primeira leitura;

3.4.11 Selecionar o comprimento de onda da segunda leitura;

3.4.12 Escolher o branco a ser utilizado;

3.4.13 Selecionar o fator (pode ser escrito ou determinado, faremos a

determinao);

3.4.14 Referncia alta;

3.4.15 Referncia baixa;

3.4.16 Tempo de espera para a primeira leitura;

3.4.17 Tempo de leitura da reao;

3.4.18 Quantidade de casas decimais utilizadas;

3.4.19 Determinar o volume de aspirao para a leitura;

3.4.20 Selecionar a opo enter;

3.5 Cadastrar o nosso calibrador para a reao (clculo do fator) (Um grupo

por vez):

3.5.1 Selecionar a opo standard (STD) do equipamento na nossa reao

recm cadastrada;

3.5.2 Escolha do mtodo: linear;

3.5.3 Escolha do nmero de calibradores;

3.5.4 Escolha do nmero de repeties da dosagem;

3.5.5 Concentrao do padro;

3.6 Dosagens:

3.6.1 Colocar a gua destilada no cano de suco e dar o comando de suco

(branco);

3.6.2 Selecionar o teste padro (STD);

3.6.3 Pipetar 20 microlitros de amostra padro no tubo com 2 ml de reagente

identificado como padro e imediatamente homogeneizar vigorosamente e dar

comando de suco;

3.6.4 Aguardar a leitura e clculo do padro (Concentrao P/At2 At1);

3.6.5 O equipamento solicitar a leitura dos primeiros testes;

 3.6.6 Pipetar 20 microlitros de amostra controle no tubo com 2 ml de

reagente identificado como controle e imediatamente homogeneizar vigorosamente

e dar comando de suco;

3.6.7 Verificar se o valor aferido no controle est dentro do valor de mdia e

erro aceitveis;

3.6.8 - O equipamento solicitar a leitura do prximo teste;

3.6.9 Estando o controle dentro da margem de erro esperada, pipetar 20

microlitros de amostra teste (plasma ou soro) no tubo com 2 ml de reagente

identificado como controle e imediatamente homogeneizar vigorosamente e dar

comando de suco;

3.6.10 Registrar a leitura do teste do grupo;

3.6.11 Selecionar o comando esc para que o prximo grupo possa fazer a sua

calibrao e dosagens;

3.6.12 Comparar os resultados encontrados pelas duas metodologias.

 Aula 15 :

Lipidograma

Os lipdios so substncias orgnicas insolveis em gua, contudo solveis em

solventes apolares. Tem diversas funes fisiolgicas e esto presentes em todos

os tecidos. Atuam basicamente como hormnios ou precursores hormonais, fonte

de combustvel metablico, componentes estruturais e funcionais de membrana e

de isolante trmico e de conduo nervosa. Os mais encontrados nos humanos so o

colesterol (livre cerca de 30%), steres de colesterol (cerca de 70%),

triglicerdios, fosfolipdios e cidos graxos. Por serem insolveis em gua

dependem de lipoprotenas para serem transportados, sendo as principais os

quilomicrons, e as lipopretenas de muito baixa densidade (VLDL), de baixa

densidade (LDL) e alta densidade (HDL). O colesterol o esterol mais abundante

nos tecidos e faz parte da composio das LDLs e das membranas celulares, alm

de precursor de hormnios e de cidos biliares. Apenas 25% do colesterol

circulante proveniente da dieta, o restante fundamentalmente produzido pelo

fgado. Em nossa aula prtica o colesterol ser medido por metodologia enzimtica

com a ao da colesterol esterase que hidrolisa os steres de colesterol em

colesterol livre, seguido pela ao da colesterol oxidase que forma perxido de

hidrognio que oxidada formando um reativo de cor rsea. Estudos apontam uma

relao que a poro do colesterol transportada pela LDL, resultado basicamente a

partir das VLDL e da degradao dos quilomicrons, a de maior potencial

aterognico. J o HDL aparentemente tem efeito contrrio, protetivo coronariano,

j que h evidncias que ele atua no retorno do colesterol dos tecidos perifricos

para o fgado, segui da remoo do mesmo em cidos biliares. A determinao das

fraes de transporte do colesterol ser realizada pela centrifugao das

protenas de baixo peso molecular (LDL e VLDL) com o uso de solues polianinicas

capazes de se associar a ApoB dessas protenas de transporte, seguido de dosagem

do colesterol presente no sobrenadante. O colesterol LDL ser obtido por

estimativa obtida pela frmula de Friedewald: CLDL= CTotal (CHDL + Trig/5).

Refeies recentes tem pouca interferncia na dosagem de colesterol em curto

prazo.

Os triglicerdeos so sintetizados no fgado e representam a mais importante

forma de armazenamente de cidos graxos do organismo. Constituem a principal

frao dos quilomicrons, das VLDL e pequena parte das LDL presentes no plasma.

Os triglicerdeos tem basicamente duas origens, intestinal e heptica. No primeiro

caso os triglicerdeos da dieta so hidrolizados pela lipase e sais biliares, formam

os quilomicrons que deixam a mucosa intestinal e ganham a circulao sistmica,

sendo incorporados pelos vrios tecidos, especialmente o tecido adiposo. A

presena dos quilomicrons na circulao perifrica pode perdurar por horas aps a

refeio, podendo considerar pequena sua concentrao no sangue aps jejum de

12 a 14 horas. Os triglicerdeos plasmticos em jejum so de origem heptica a

partir da captao de cidos graxos do tecido adiposo e liberados, associados a

VLDL.

O lipidograma um exame realizado para avaliao do perfil lipdico do

indivduo, buscando sobretudo associao como casos de riscos para a

aterosclerose e consequentemente a problemas vasculares. So dosados nesse

processo o colesterol total e colesterol HDL pela centrifugao das lipoprotenas

de baixo peso molecular. O colesterol LDL e VLDL so obtidos mediante clculo

pela frmula de Friedewald que, se mostra aceitvel at um nvel de Triglicrides

de 400 mg/dl. Entende-se como desejvel um perfil de colesterol total inferior a

200 mg/dL, limtrofe entre 200 e 239 mg/dL e elevado, acima de 240 mg/dL. Para

o HDL desejvel que se encontre acima de 60 mg/dL e considerado baixo quando

inferior a 40 mg/dL. Para o colesterol LDL considerado timo quando abaixo de

100 mg/dL, limtrofe timo at 129 mg/dL, limiar elevado at 159 mg/dL elevado

entre 160 e 190 mg/dL e muito elevado a partir desse ponto. Para o triglicrides o

desejvel at 150 mg/dL, limtrofe at 199 mg/dL, alto at 499 mg/dL e muito

alto acima de 500 mg/dL.

Procedimentos:

1. Coleta e centrifugao:

1.1 Ligar o espectrofotmetro para a sua estabilizao;

1.2 - Realizao da coleta dos alunos, um de cada grupo, em tubo para obteno

de soro;

1.3 - Esperar a formao do cogulo que pode ser acelerada colocando as

amostras em banho-maria a 37C;

1.4 - Proceder a centrifugao das amostras a 3.500 rpm por 10 minutos e

observar se houve a separao adequada do soro.

 2. Determinao de colesterol total (Colesterol Liquiform Labtest):

Concentrao do padro: 200 mg/dL

Concentrao do controle:

2.1 Proceder identificao dos tubos de vidro para tubo branco, padro,

controle e teste;

2.2 Pipetar 3 ml do reagente colesterol (Rseo) em cada um dos tubos

supracitados;

2.3 Separar o tubo branco apenas com o reagente;

2.4 Pipetar 30 microlitros da amostra padro no tubo padro;

2.5 - Pipetar 30 microlitros da amostra controle no tubo controle;

2.6 - Pipetar 30 microlitros da teste no tubo teste;

2.7 Manter as amostras em banho-maria por 10 minutos;

2.8 Realizar as leituras das absorbncias em espectrofotmetro com

comprimento de onda de 500 nm;

3. Determinao do Colesterol HDL (Doles):

Concentrao do padro: 50 mg/dL

Concentrao do controle:

3.1 Proceder identificao dos tubos de vidro para tubo centrifugado,

branco, padro, controle e teste;

3.2 - Adicionar 600 microlitros do soro no tubo de ensaio centrifugado;

3.3 Adicionar 600 microlitros do HDL R (polietilenoglicol tamponado);

3.4 Adicionar 400 microlitros de soro controle em um tubo de ensaio (uso

comum descongelar outro controle);

3.5 - Adicionar 400 microlitros HDL R no tubo de ensaio com controle (uso

comum);

3.6 Homogeneizar os tubos e deixar repousar por 10 minutos a temperatura

ambiente;

3.5 Proceder a centrifugao dos tubos a 3.500 rpm por 15 minutos;

3.6 Pipetar 3 ml do reagente colesterol nos tubos identificados como

branco; padro; controle e teste;

3.7 Separar o tubo branco apenas com o reagente;

3.8 Pipetar 30 microlitros da amostra padro no tubo padro;

 3.9 - Pipetar 30 microlitros do sobrenadante da amostra controle no tubo

controle;

3.10 - Pipetar 30 microlitros do sobrenadante da amostra teste no tubo teste;

3.11 Manter as amostras em banho-maria por 10 minutos;

3.12 Realizar as leituras das absorbncias em espectrofotmetro com

comprimento de onda de 500 nm;

Obs: Ao realizar o clculo da concentrao do controle e do teste baseado

na leitura da absorbncia do padro deve-se multiplicar o resultado pelo fator

de diluio da amostra com o reagente.

Determinao de Triglicrides (Trig Liquiform Labtest)

Concentrao do padro: 200 mg/dL

Concentrao do Controle:

4.1 Proceder identificao dos tubos de vidro para tubo branco, padro,

controle e teste;

4.2 Pipetar 3 ml do reagente Triglicrides em cada um dos tubos

supracitados (amarelado);

2.3 Separar o tubo branco apenas com o reagente;

2.4 Pipetar 30 microlitros da amostra padro no tubo padro;

2.5 - Pipetar 30 microlitros da amostra controle no tubo controle;

2.6 - Pipetar 30 microlitros da teste no tubo teste;

2.7 Manter as amostras em banho-maria por 10 minutos;

2.8 Realizar as leituras das absorbncias em espectrofotmetro com

comprimento de onda de 500 nm.

Laboratrio:

Nome:

Exame: Amostra:

Anlito Concentrao (g/dL) Valores de Referncia

Colesterol Total

Colesterol HDL

Colesterol LDL

Triglicrides