DIRECCIN GENERAL DE INOCUIDAD AGROALIMENTARIA, ACUCOLA Y PESQUERA

CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA DE PLAGUICIDAS Y CONTAMINATES

VALIDACIN DE MTODOS MICROBIOLGICOS
Clave: GVMM Revisin: 00 Fecha de emisin: 03/2015 Pgina 1 de 10

GUIA DE VALIDACION DE METODOS PARA EL ANALISIS DE

MICROORGANISMOS PATGENOS EN PRODUCTOS
VEGETALES
 DIRECCIN GENERAL DE INOCUIDAD AGROALIMENTARIA, ACUCOLA Y PESQUERA
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA DE PLAGUICIDAS Y CONTAMINATES
VALIDACIN DE MTODOS MICROBIOLGICOS
Clave: GVMM Revisin: 00 Fecha de emisin: 03/2015 Pgina 2 de 10

DIRECTORIO

MVZ Enrique Snchez Cruz

Director en Jefe del Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria

MVZ. Hugo Fragoso Snchez

Director General de Inocuidad Agroalimentaria, Acucola y Pesquera

QA Mayrn Cristina Zamora Nava

Directora del Centro Nacional de Referencia de Plaguicidas y Contaminantes

MVZ Linda Coatlicue Garca Lpez

Subdirectora de Diagnstico y Deteccin de Organismos Patgenos

LAE Daniel Gonzlez vila

Subdirector de Monitoreo y Evaluacin de Calidad

MC Mara Felipa Lpez Durn

Coordinadora del Laboratorio Central

Tecmac, Edo. De Mxico, marzo de 2015

 DIRECCIN GENERAL DE INOCUIDAD AGROALIMENTARIA, ACUCOLA Y PESQUERA
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA DE PLAGUICIDAS Y CONTAMINATES
VALIDACIN DE MTODOS MICROBIOLGICOS
Clave: GVMM Revisin: 00 Fecha de emisin: 03/2015 Pgina 3 de 10

CONTENIDO

1. PROPOSITO 4

2. ALCANCE 4

3. REFERENCIAS 4

4. DESARROLLO 4
4.1 SELECCIN DEL METODO 4
4.2 ESTABLECIMIENTO DEL PROTOCOLO 5
4.3 TABLA DE CONTINGENCIAS 7
4.4 EVALUACIN DEL DESEMPEO DE METODOS 7
4.4.1 LIMITE DE DETECCION 7
4.4.2 REPETIBILIDAD 7
4.4.3 REPRODUCIBILIDAD 7
4.4.4 EFICACIA RELATIVA 8
4.4.5 ESPECIFICIDAD RELATIVA 8
4.4.6 SENSIBILIDAD RELATIVA 8
4.4.7 RECUPERACIN 8
4.4.8 ROBUSTEZ 8
4.4.9 INFORME DE RESULTADOS 9

5 ANEXOS
 DIRECCIN GENERAL DE INOCUIDAD AGROALIMENTARIA, ACUCOLA Y PESQUERA
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA DE PLAGUICIDAS Y CONTAMINATES
VALIDACIN DE MTODOS MICROBIOLGICOS
Clave: GVMM Revisin: 00 Fecha de emisin: 03/2015 Pgina 4 de 10

1. PROPSITO.

Establecer los lineamientos y criterios para la evaluacin del desempeo de mtodos aplicados en LDDOP aportando
evidencia objetiva que permita establecer la veracidad de los resultados particulares para su uso.

2. ALCANCE.

El presente documento aplica para el rea tcnica del Laboratorio de Diagnstico para la Deteccin de Organismos
Patgenos (LDDOP)

3. REFERENCIAS

NMX-EC-17025-IMNC-2006 Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y de

calibracin.

CRITERIOS DE APLICACIN DE LA NORMA NMX-EC-17025-IMNC-2006 / ISO/IEC 17025:2005

UNE-EN ISO 16140 Microbiologa de los alimentos para consume humano y animal Protocolo de Validacin de
mtodos alternativos.(ISO 16140:2003)

4. DESARROLLO

4.1 Seleccin del mtodo

Para validar un mtodo, en necesario considerar si el tipo de Mtodo es normalizado o No Normalizado con la
finalidad de establecer los parmetros correspondientes.

4.1.1 Mtodo Normalizado

Se consideran mtodos o procedimientos normalizados, aquellos publicados en Normas Oficiales Mexicanas (NOM),
Normas Mexicanas (NMX) los emitidos por organizaciones de normalizacin, extranjeras, regionales e
internacionales; todas reconocidas, tales como FDA, USDA, ISO, EN, ASTM, AOAC, EPA, USP, Estndar Methods,
etc.

Para mtodos o procedimientos normalizados el laboratorio debe realizar y presentar evidencia objetiva de la
confirmacin del mtodo para demostrar que cumple las especificaciones del mismo y cuenta con la competencia
tcnica para realizarlo adecuadamente, tomando en consideracin sus propias instalaciones, equipo y personal.

La confirmacin del mtodo debe realizarse de acuerdo a lo siguiente:

Repetibilidad.
Reproducibilidad.
Eficacia Relativa.
Especificidad Relativa
Sensibilidad Relativa

4.1.2 Mtodo no Normalizado

Los mtodos no normalizados, propios o desarrollados por el laboratorio, los mtodos obtenidos de publicaciones
cientficas, as como los mtodos normalizados modificados o ampliados o usados fuera de su alcance propuesto el
laboratorio debe realizar y presentar evidencia objetiva de la validacin del mtodo, para evaluar estos parmetros se
requiere un nmero mayor de muestras.
 DIRECCIN GENERAL DE INOCUIDAD AGROALIMENTARIA, ACUCOLA Y PESQUERA
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA DE PLAGUICIDAS Y CONTAMINATES
VALIDACIN DE MTODOS MICROBIOLGICOS
Clave: GVMM Revisin: 00 Fecha de emisin: 03/2015 Pgina 5 de 10

Lmite de deteccin.
Repetibilidad.
Reproducibilidad.
Eficacia Relativa.
Especificidad Relativa / Exclusividad
Sensibilidad Relativa / Inclusividad
Recuperacin
Robustez

4.2 Establecimiento del Protocolo

Antes de iniciar con la validacin de un mtodo, es necesario contar con el Protocolo de Validacin
correspondiente al mtodo a validar. Para ello, es necesario realizar lo siguiente:

Nota: Durante la ejecucin del protocolo de validacin se debern documentar todas las actividades realizadas junto
con los resultados obtenidos.

4.2.1 Pruebas preliminares

Las pruebas preliminares se realizan para asegurar que no existe algn factor que no permita la deteccin del
organismo de inters por el mtodo empleado, se pueden realizar pruebas preliminares para determinar:

El efecto o interferencia de la matriz sobre el mtodo

Evaluar reactivos que van a ser utilizados
La preparacin de laS muestras, etc.

Estas pruebas se registraran en el formato correspondiente.

4.2.2 Seleccin de matriz

Los criterios de seleccin de matriz para la evaluacin del desempeo del mtodo, se basan en:

Alertas / Notificaciones
Vinculacin epidemiolgica entre la matriz y el organismo diana.
Programas de Monitoreo y Vigilancia
Peticin explicita del cliente
Idoneidad y disponibilidad de la matriz.
Categoras de matrices (Ver Anexo).
Registro histrico de muestras analizadas
Otras

4.2.4 Preparacin del inoculo

Para realizar las diluciones que se van a emplear para inocular las muestras se siguen las indicaciones de trabajo
para diluciones bacterianas del laboratorio, tomando en cuenta las organismos Diana / Blanco y No Diana / Blanco.

Microorganismo diana. El nivel de inoculo debe ser de 10 a 100 veces mayor que el nivel de deteccin relativo
mnimo del mtodo y debe emplearse el protocolo completo del mtodo y cuando se obtengan resultados falsos
negativos o dudosos, la cepa debe ser analizada otra vez con el mtodo de referencia.

Microorganismo no diana. El nivel de inoculo de cepas debe ser mayor al nivel del microorganismo diana (10 veces
ms), mnimo 1 microorganismo no diana por ensayo.
 DIRECCIN GENERAL DE INOCUIDAD AGROALIMENTARIA, ACUCOLA Y PESQUERA
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA DE PLAGUICIDAS Y CONTAMINATES
VALIDACIN DE MTODOS MICROBIOLGICOS
Clave: GVMM Revisin: 00 Fecha de emisin: 03/2015 Pgina 6 de 10

Tabla 1. Criterios generales para la validacin de mtodos cualitativos.

Criterios Nivel 1 Nivel 2
Nmero de microorganismos
1, 2 10 (20 para Salmonella) 30 cepas
diana (inclusividad)
Nmero de microorganismos
3 10 cepas 20 cepas
no diana (exclusividad)
Nmero de alimentos 1 o ms 1 o ms
el nivel usualmente
Niveles de inoculacin / matriz encontrado en la matriz / 3 1 inoculado y 1 sin inocular
5
- 5 niveles
Nmero de repeticiones de
20 cepas 20 cepas
cada nivel
Adicin de cepas competitivas Microflora natural presente
Comparacin con mtodo de
Si Si
referencia
1
Cuando no sea posible cumplir con los criterios de inclusividad/exclusividad, el laboratorio podrn utilizar las cepas disponibles, o trabajar en
colaboracin con otro laboratorio; siempre que el material sea de una fuente trazable y documentada.
2
La eleccin de cepas de inclusividad deber considerar la relevancia gentica, grupos serolgicos, diversidad bioqumica, virulencia, frecuencia de
ocurrencia, etc., del organismo diana o blanco. (Consultar apndice 3, Guidelines for the Validation of Analytical Methods for the Detection of
Microbial Pathogens in Foods).
3
La eleccin de cepas de exclusividad debe basarse en la estrecha relacin del organismo diana o blanco con organismos que potencialmente
puedan presentar una reaccin cruzada, por presentar caractersticas similares de virulencia, frecuencia de ocurrencia, etc. (Consultar apndice 3,
Guidelines for the Validation of Analytical Methods for the Detection of Microbial Pathogens in Foods).
4
Para la validacin de mtodos moleculares, los criterios de inclusividad y exclusividad deben considerar adicionalmente la cantidad de templado,
el uso de clulas bacterianas, purificacin de cidos nucleicos, la comparacin previa de los primers, sondas o secuencias con bases de datos
genmicas. Adicionalmente, se debe incluir el uso de cepas control positivo y negativo, as como el control interno de reaccin para PCR en tiempo
real.
5
Primer nivel: Deber ser el control negativo; segundo nivel: el nivel terico de deteccin; tercer nivel: deber ser un nivel de deteccin por arriba
del nivel terico; cuarto y quinto nivel: Debern ser mayores que el nivel de deteccin anterior.

4.2.3 Preparacin de la muestra

La preparacin de la muestra debe considerar la microflora natural presente en la matriz, la cual se determinar
mediante el conteo de mesfilos aerobios (APC) para verificar la microflora fondo.

Cuando no sea posible asegurar la presencia del microorganismos diana en la matriz vegetal, se proceder a la
inoculacin artificial, conforme al punto 4.2.4 y 4.2.5

Registrar la muestra en el formato de inoculacin de muestras del laboratorio, con la siguiente informacin

Identificacin de la muestra
Cantidad de la muestra.
Concentracin de Inoculo de organismo Diana
Concentracin de Inoculo de organismos No Diana
Mtodo de preparacin de la muestra
Tamao de la muestras
Estado de maduracin de la matriz

4.2.5 Inoculacin de muestras

Considerando que las matrices vegetales frescos, no presentan una distribucin uniforme de contaminacin
microbiolgica, se pueda presentar una inhibicin propia de la matriz, un estrs microbiano, o una lesin de los
microorganismos, ser necesario realizar una contaminacin artificial con el organismo diana, y en su caso la inclusin
de microflora competitiva.
 DIRECCIN GENERAL DE INOCUIDAD AGROALIMENTARIA, ACUCOLA Y PESQUERA
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA DE PLAGUICIDAS Y CONTAMINATES
VALIDACIN DE MTODOS MICROBIOLGICOS
Clave: GVMM Revisin: 00 Fecha de emisin: 03/2015 Pgina 7 de 10

La inoculacin de las muestras se realiza en condiciones aspticas, preferentemente dentro de una cabina de
seguridad biolgica.

Para realizar la inoculacin de las muestras se deber emplear material de referencia, si est disponible o material
verificado en las instalaciones del LDDOP, presentando certificado de calidad y/o informe de verificacin.

La inoculacin artificial debe asegurar la uniformidad de la contaminacin en la matriz, que permita la recuperacin del
microorganismo en la porcin de la matriz utilizada.

4.3 Tabla de contingencias

Al tratarse de pruebas cualitativas los resultados se dan en dos categoras, Positivo/Negativo y se establece una
tabla de comparacin respecto con el valor esperado y el valor obtenido por lo de esta forma se pueden ingresan los
datos en una tabla de resultados de validacin, donde se realice la captura y anlisis de resultados.

Tabla de contingencias
Respuesta Muestra inoculada Muestra no inoculada
Resultado Positivo Verdadero positivo (VP) Falso Positivo (FP)
Resultado Negativo Falso negativo (FN) Verdadero Negativo (VN)

4.4 Evaluacin del desempeo de mtodos.

Proceso que se realizara en el laboratorio para demostrar que un mtodo produce consistentemente resultados
confiables en las condiciones particulares del laboratorio evaluando los siguientes aspectos:

4.4.1 Limite de deteccin

Demostrar la concentracin ms baja en la que el mtodo es capaz de recuperar al microorganismo de las muestras
inoculadas con un nivel bajo de inoculo (menor a 5 UFCs).

LD= VP x 100
Ni
Dnde:
VP= Resultados Positivos de muestras con inoculacin baja
Ni = Muestras inoculadas (menos a 5 UFCs)

Criterio de aceptacin: Mayor o igual 50%.

4.4.2 Repetibilidad (R)

Grado de concordancia entre resultados sucesivos e independientes obtenidos por el mismo mtodo empleando un
material idntico bajo las mismas condiciones (aparatos, operadores, laboratorio e intervalos de tiempos cortos, es
decir condiciones de repetibilidad)

R= N x 100
VP

Criterio de aceptacin: Mayor o igual a 90%.

4.4.3 Reproducibilidad

Grado de concordancia entre resultados de anlisis individuales en materia de anlisis idntico empleando el mismo
mtodo y obtenido por operadores en diferentes laboratorios empleando equipos diferentes (es decir unas condiciones
de reproducibilidad)
 DIRECCIN GENERAL DE INOCUIDAD AGROALIMENTARIA, ACUCOLA Y PESQUERA
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA DE PLAGUICIDAS Y CONTAMINATES
VALIDACIN DE MTODOS MICROBIOLGICOS
Clave: GVMM Revisin: 00 Fecha de emisin: 03/2015 Pgina 8 de 10

El anlisis es realizado por al menos dos personas y se evalan los criterios de Eficacia Relativa, Especificidad
Relativa y Sensibilidad Relativa de forma independiente.

Criterio de aceptacin: Mayor igual al 95% de eficacia relativa por cada analista

4.4.4 Eficacia Relativa (ER)

Grado de correspondencia entre la respuesta obtenida por el mtodo con las muestras inoculadas y las que no estn
inoculadas

ER= VP+VN x 100

N
Criterio de aceptacin: Mayor igual a 95%

4.4.5 Especificidad Relativa (ES) / Exclusividad

Capacidad del mtodo para distinguir el analito blanco u organismo diana, de otros organismos similares, pero
genticamente distintos o no blancos, es decir la capacidad de no detectar el analito cuando no est presente en la
muestra.

ES = VN x 100
Ns

Criterio de aceptacin: Mayor igual al 95%

4.4.6 Sensibilidad Relativa (SR) / Inclusividad

Capacidad del mtodo para detectar el analito cuando se encuentra presente, en una amplia gama de
microorganismos no diana. Por ejemplo: clasificacin taxonmica, composicin inmunolgica, gentica, etc.

SR = VP x100
Ni

Criterio de aceptacin: Mayor igual al 95%

4.4.7 Recuperacin (Re)

Determina la fraccin del analito adicionado a la muestra (Fortificada) antes del anlisis que es recuperado con la
prueba

%Re= VP x 100
Ni

Criterio de aceptacin: Mayor igual al 95%

N= Nmero total de muestras

Ni= Nmero de muestras inoculadas
Ns= Nmero de muestras sin inocular

4.4.8 Robustez

La robustez es una medida de la capacidad de un procedimiento analtico de no ser afectado por variaciones
deliberadas de los parmetros del mtodo; proporciona una indicacin de la fiabilidad del procedimiento en un uso
 DIRECCIN GENERAL DE INOCUIDAD AGROALIMENTARIA, ACUCOLA Y PESQUERA
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA DE PLAGUICIDAS Y CONTAMINATES
VALIDACIN DE MTODOS MICROBIOLGICOS
Clave: GVMM Revisin: 00 Fecha de emisin: 03/2015 Pgina 9 de 10

normal. En este sentido el objetivo de la prueba de robustez es optimizar el mtodo analtico desarrollado o
implementado por el laboratorio, y describir bajo qu condiciones analticas (incluidas sus tolerancias), se pueden
obtener resultados confiables.

Un mtodo de ensayo es ms robusto entre menos se vean afectados sus resultados frente a una modificacin de las
condiciones analticas.

Entre las condiciones analticas que podran afectar a un mtodo se encuentran:

Analistas
Equipos
Reactivos
pH
Temperatura.
Tiempo de reaccin.
Matriz.
Otros.

Para realizar en anlisis de robustez se aplica el test de Youden y Steiner aplicado de la siguiente forma:

Prueba de Robustez de Younden y Steiner

Letra Descripcin Valor Nominal Valor Alto Valor Bajo

A/a Condicin 1 X A a
B/b Condicin 2 Y B b

Se deben establecer las comparaciones posibles, es decir las diferencias entre la variable de alto valor contra la de
valor bajo:

(A a), (B b), (C c), (D d), (E e), (F f) y (G g)

Condicin 1 2 3 4 5 6 7 8
A/a A A A A a a a a
B/b B B B b B b b b
C/c C c C c C c C c

Resultados

Donde los resultados obtenidos se reportan como presencia (1) o ausencia (0)

Para las variables A y a:

Donde el promedio de A se calcula: (A+A+A+A) = X

4

Donde el promedio de a se calcula: (a+a+a+a) = X

4
4.4.9 Informe de resultados

El mtodo estadstico utilizado para la evaluacin del mtodo se deber incluir en el informe de resultados, as
como la eliminacin de resultados aberrantes, tales como:
Controles negativos (sin inocular) que arrojen un resultado positivo, son indicadores de un error del
laboratorio/operador.
Evidencia de no homogeneidad o uniformidad del material inoculado.
 DIRECCIN GENERAL DE INOCUIDAD AGROALIMENTARIA, ACUCOLA Y PESQUERA
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA DE PLAGUICIDAS Y CONTAMINATES
VALIDACIN DE MTODOS MICROBIOLGICOS
Clave: GVMM Revisin: 00 Fecha de emisin: 03/2015 Pgina 10 de 10

Valores atpicos

Las actividades realizadas as como los resultados obtenidos se describirn en un informe de validacin anexando
la evidencia que lo respalde.

5. ANEXOS

5.1 CATEGORIAS DE MATRICES

FRUTAS HORTALIZAS
Bayas y otras frutas pequeas
Brasicceas (Ej. brcoli)
(Ej. fresas, zarzamora, uva)
Frutas de hueso (Ej. durazno) De Bulbo (Ej. cebollin)
Frutas pomceas (Ej. manzana) Cucurbitceas (Ej. calabaza)
Frutas tropicales y subtropicales variadas
De fruto (Ej. tomate, chile)
(de piel comestible) (Ej. higo)
Frutas tropicales y subtropicales variadas
De hojas verdes (Ej. espinaca, lechuga)
(de piel no comestible) (Ej. papaya)
Frutos ctricos (Ej. naranja) De tallo (Ej. apio)
Leguminosas (Ej. ejote)

HIERBAS AROMATICASY ESPECIAS OTROS

Especias (Ej. tomillo Setas
Hierbas aromticas (Ej. epazote Brotes de semilla (Ej. Germen de alfalafa)

SUPERFICIES DE CONTACTO
AGUA
(Vivas e inertes)
Agua de Riego en produccin primaria Hisopo
Agua potable proceso de empaque Esponja