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Tcnicas Fundamentales: Cromatografa 15

CROMATOGRAFA

Cromatografa de Capa Fina y Cromatografa en Columna

A. INTRODUCCIN
La cromatografa puede definirse como una tcnica analtica para separar los
componentes de una mezcla sobre la base de las diferencias en afinidad por una fase
estacionaria y otra mvil. Estas diferencias en afinidad involucran que el proceso de
separacin sea de adsorcin o de particin (1).
La adsorcin involucra el enlace de un compuesto con la superficie de una fase
slida. Por ejemplo, la purificacin de un compuesto mediante su disolucin en un solvente
orgnico, seguida del tratamiento con carbn activado, depende de la adsorcin
preferencial de la impureza sobre el carbn.
La particin involucra la solubilidad relativa de un compuesto en dos fases que da
por resultado la particin de dicho compuesto entre las dos fases. Por ejemplo, la
extraccin de un compuesto orgnico, disuelto en una solucin acuosa, con ter depende
si el compuesto orgnico se disuelve de preferencia en la fase etrea.
As, los diversos tipos de cromatografa pueden ser clasificados como cromatografa
de adsorcin o de particin, dependiendo si la fase estacionaria es un slido o un lquido,
respectivamente.
La cromatografa es un procedimiento fsico-qumico que permite separar los
componentes de una mezcla mediante el desplazamiento diferenciado de cada uno de
ellos sobre una superficie estacionaria (2).
La cromatografa (del griego chroma: color, y graphos: escritura) fue establecida
entre 1903 y 1910 por el botnico ruso Mikhail Tswett.
Tswett extrajo los pigmentos de las hojas verdes de las plantas con ter de
petrleo, y verti el extracto de pigmentos resultante dentro de una columna de vidrio
colocada verticalmente y llenada previamente con carbonato de calcio finamente
pulverizado (el adsorbente o fase estacionaria).
Inicialmente, los pigmentos fueron retenidos (adsorbidos) en la parte superior de la
columna, pero al hacer fluir por la columna ter de petrleo (el solvente o eluente), los
diversos pigmentos fueron desplazados hacia la parte inferior de la columna (elusin),
desplazndose cada pigmento a una velocidad diferente. Como resultado de esto, los
pigmentos fueron separados en bandas o zonas discretas y pudieron ser desalojados, por
separado, por el extremo inferior de la columna.
A esta separacin se le llama cromatograma y al mtodo de obtenerla mtodo
cromatogrfico o cromatografa (2,3).

Los componentes de la mezcla son continua y reversiblemente adsorbidos sobre el

slido, luego desadsorbidos por accin del eluente, mientras se mueven por accin de
ste. Figura 1 (3).
En la Figura 1 se ilustra la seccin transversal de una pequea porcin de
adsorbente en una placa o columna cromatogrfica en tres momentos sucesivos (la flecha
de cada recuadro indica la direccin del desplazamiento de las molculas del eluente,
representado por los puntos pequeos):
i Una molcula de uno de los componentes de la mezcla (disco negro) es adsorbida sobre
la superficie de la fase estacionaria;
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ii otra molcula del mismo componente es desadsorbida de la fase estacionaria y se

desplaza junto con el eluente;
iii la molcula desadsorbida es readsorbida ms adelante.
Las molculas del otro componente de la mezcla (representada mediante discos
blancos) estn fuertemente adsorbidas sobre la superficie de la fase estacionaria y, por lo
tanto, se desplazan slo lentamente (no se nuestra en la Figura 1).

i ii iii

Figura 1.- Separacin de una mezcla (de dos componentes) por cromatografa de adsorcin.

El origen de este fenmeno yace en las interacciones (fuerzas intermoleculares:

dipolo dipolo, van der Waals, etc.) del eluente y de la mezcla (lase componentes de la
mezcla) entre s y con la superficie del adsorbente.
Un adsorbente slido tiene un rea superficial grande que expone un gran nmero
de sitios ms o menos polares que pueden unir o adsorber reversiblemente a las
molculas de la mezcla mediante fuerzas de atraccin electrostticas. A medida que el
eluente viaja sobre la superficie del adsorbente, compite con la mezcla por el adsorbente y
con el adsorbente por la mezcla, y as desplaza reversible y continuamente a sta en
direccin del desplazamiento del frente del eluente (4).
Este proceso se puede considerar como una competencia de tres: entre la mezcla,
el eluente y el adsorbente, como se expresa en el equilibrio siguiente:

mezcla - eluente

mezcla-adsorbente eluente-adsorbente

La velocidad de elusin de los componentes de la mezcla depende de la naturaleza

y velocidad de desplazamiento del eluente y de la afinidad de los componentes de la
mezcla por la superficie del adsorbente (3,4).
Para el caso de los adsorbentes polares usados comnmente en el laboratorio, tales
como la slica (slica gel, SiO2) y la almina (xido de aluminio, Al2O3) los compuestos no
polares tales como los hidrocarburos R-H, los teres R-O-R, las cetonas RR`C=O, los
aldehidos HCHO, etc., con baja afinidad por la superficie del adsorbente, pasarn la mayor
parte de su tiempo en el eluente y, por lo tanto, se desplazarn fcilmente junto a l.
Correspondientemente, las molculas polares y polarizables tales como las aminas
RR`NH, los cidos carboxlicos RCOOH, los alcoholes R-OH, etc., con alta afinidad por los
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adsorbentes polares, sern adsorbidos fuertemente sobre su superficie y, por lo tanto, se

desplazarn lentamente o no se desplazarn (2,3).
A ms polar el solvente de elusin, ms rpidamente se desplazan los
componentes. Por tanto, la seleccin del solvente estar fijada por la naturaleza de los
componentes a ser separados: solventes polares para molculas fuertemente adsorbidos y
solventes no polares para las dbilmente adsorbidas.
Serie elutrpica. A continuacin se indican algunos solventes comnmente usados
en el laboratorio, en orden creciente de poder de elusin, el cual va paralelo al orden de
aumento de polaridad (3):

Eter de petrleo (Hexano, heptano, etc)

Ciclohexano, C6H12
Cloruro de metileno, CH2Cl2
Aumento de poder Cloroformo, CHCl3 (muy txico) Aumento de
de elucin Eter etlico, (CH3CH2)2O polaridad
Acetona, CH3COCH3
Etanol, CH3CH2OH
Metanol, CH3OH (muy txico)
Agua, H2O

Debe tenerse presente que estos fenmenos de adsorcin no se limitan a los

pigmentos de plantas y, bajo condiciones apropiadas, todos los compuestos, sea
coloreados o incoloros, pueden tener un comportamiento anlogo (2).
As, esta tcnica de separacin resulta de gran utilidad al qumico orgnico, pues
muchas veces en su trabajo de laboratorio requiere de la separacin de los diferentes
componentes de una mezcla.
De acuerdo a la tcnica empleada, la cromatografa de adsorcin puede clasificarse
en:
i cromatografa en capa fina (CCF).
ii cromatografa en placa preparativa (CPP).
iii cromatografa en columna (CC)
La CCF es la tcnica que se utiliza para obtener informacin rpida y sencilla sobre:
i cantidad de compuestos que hay en la mezcla:
ii seleccionar el solvente o la mezcla de solventes, con los cuales se puede separar cada
componente de todos los otros.
Estos resultados iniciales se utilizan en seguida para ensayar la separacin de la
mezcla por cromatografa en placa preparativa o por cromatografa de columna.
Por lo general, en el laboratorio de qumica orgnica, la cromatografa en placa
preparativa se utiliza para realizar separaciones de mezclas de hasta 250 mg.
En cambio, la cromatografa en columna se utiliza para realizar separaciones de
mezclas comprendidas entre 100 mg y 10 g, e inclusive hasta de 40 g (Cromatografa en
embudo Buchner).
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B. CROMATOGRAFA EN CAPA FINA

En su forma ms simple de aplicacin, la cromatografa en capa fina involucra la
aplicacin de una cantidad muy pequea de la mezcla a ser analizada (en disolucin con
algn solvente) sobre la superficie de un adsorbente slido, esparcido como una capa fina
sobre una placa de vidrio o plstico.
Cuando el solvente se ha evaporado, dejando depositada la mezcla sobre el
adsorbente, la placa se coloca en un recipiente de vidrio que contiene un pequeo
volumen de algn solvente, o mezcla de solventes, tal que la parte revestida de la placa,
por debajo de la posicin de la mezcla, quede en contacto con el solvente.
En estas condiciones, el solvente es arrastrado verticalmente hacia la parte superior
de la superficie revestida por accin capilar, pasando por la posicin en donde se aplic la
mezcla; entonces, los componentes de la mezcla se mueven, por accin del solvente,
hacia la parte superior de la placa (4).
Los componentes de la mezcla son continua y reversiblemente adsorbidos sobre el
adsorbente, luego desadsorbidos por accin del solvente, mientras ascienden lentamente
por accin capilar a travs de la placa.
Los componentes no polares (como los hidrocarburos carotenoides) slo son
dbilmente adsorbidos por el adsorbente y son fcilmente eludos con solventes
hidrocarbonados (tales como el n-hexano, el ciclohexano, el ter de petrleo). Por el
contrario, los componentes polares (como las clorofilas) son fuertemente adsorbidos y solo
pueden ser eludos con solventes relativamente polares, tales como las mezclas de
solventes hidrocarbonados con cloruro de metileno y acetona.

1. Preparacin de las placas (4)

Se lavan 6 placas de vidrio tamao porta-objetos con detergente, enjuagndolos
con agua de cao y luego con agua destilada y se secan con papel de filtro. Desde ahora,
al manipular las placas tmelas por los bordes. Colquelas sobre un papel limpio.
Se pesan 5 g de slica gel en polvo (Nota 2) y se vierten en un vaso de 50 mL. Se
adicionan 15 mL de agua destilada y se agita con una vagueta. La papilla que se forma
deber tener la consistencia de una pasta espesa, pero fluida. Si es demasiado aguada,
adicionar un poco ms de slica gel; si es espesa, adicionar un poco de agua (4).
Para revestir las placas con el adsorbente se procede de la siguiente manera:
i Se toma el porta-objetos por los bordes.
ii Se vierte un poco de papilla en el extremo superior de la placa, inclinndola de modo
que la papilla se extienda sobre la superficie de sta, procurando que el revestimiento
sea lo ms uniforme posible. Se vierte cualquier exceso de gel sobre las placas en el
vaso que contiene el resto de la papilla. Esta operacin producir una capa lisa y
uniforme de gel de slice sobre la superficie de las placas, siendo el revestimiento lo
suficientemente espeso para oscurecer el vidrio.
iii Se dejan las placas en reposo durante 5 a10 minutos, para que el gel se solidifique.
Enseguida se procede a activar las placas.
iv Las placas se activan eliminando el agua, lo que se consigue colocndolas en la estufa
a 100-110C, durante 20-30 minutos (Nota 3). Luego se dejan enfriar.
Ahora, las placas estn listas para utilizarse dentro de las siguientes horas, puesto
que una exposicin prolongada al medio ambiente las hacer perder la actividad por
adsorcin de la humedad del aire.
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2. Aplicacin de las Muestras

Se introduce el extremo de un tubo capilar pequeo en la muestra orgnica para
analizar. La solucin asciende por el tubo mediante capilaridad.
Enseguida, se toca el extremo del capilar contra una placa (Figura 2): La solucin
se escurrir sobre el revestimiento.
Si se desea puede aplicarse otra muestra, al costado de la anterior, tratando que la
concentracin de la muestra sea diferente (el doble) que la anterior, de modo de comparar
el comportamiento cromatogrfico de la muestra a dos concentraciones diferentes.

Se permite que el solvente se evapore, dejando la placa al ambiente durante 5 a10

segundos: La placa est lista para ser desarrollada.
El desarrollo se lleva a cabo en cubetas de vidrio provistas con tapas de vidrio
(lunas de reloj): Figura 3. Se Coloca un papel de filtro de tamao adecuado de modo que
recubra las paredes laterales interiores de la cubeta. En seguida, se vierte un poco de
solvente, en la cubeta, de modo que alcance una altura de 0,5 cm como mximo. Se
coloca la luna de reloj en su posicin, y se espera que el solvente impregne el papel de
filtro colocado previamente. Con esto se consigue que la atmsfera en el interior de la
cubeta se sature de vapor del solvente.
Si un solvente no polar (por ejemplo, ter de petrleo) no logra desplazar a los
pigmentos sobre la superficie revestida de la placa, mientras que otro solvente polar (por
ejemplo, cloruro de metileno) los desplaza completamente sin separar los distintos
componentes, se procede a ensayar mezclas de ambos solventes de modo de obtener una
separacin de los distintos componentes contenidos en la muestra analizada.

3. Desarrollo del Cromatograma (Nota 4)

Se coloca la placa en el interior de la cubeta, teniendo cuidado de que el solvente
no alcance el rea de aplicacin de las muestras (Figura 3). El cromatograma se arruinara
si el solvente cubre el punto de aplicacin de las muestras (4).
Se coloca la luna de reloj en su posicin y se observa el desplazamiento del
solvente y de los pigmentos sobre la superficie revestida de la placa. Durante el desarrollo
del cromatograma no debe moverse la cubeta.
Cuando el solvente llega a aproximadamente 0,5 cm del extremo superior de la
placa, se retira la placa de la cubeta y se marca el lmite superior alcanzado por el solvente
con un lpiz de punta fina u otro objeto adecuado, y se deja evaporar el solvente a la
atmsfera (1-2 min.).
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4. Clculo del valor de Rf

La relacin de la distancia recorrida por un componente a la distancia recorrida por
el solvente, en el mismo tiempo, se denomina Rf (Figura 4), y vara con la naturaleza del
componente, la actividad del adsorbente y la naturaleza del eluente (4).
Calcular los valores de Rf para cada uno de los componentes identificables de la
muestra analizada, observando que el solvente se desplaza desde el punto de aplicacin
de la muestra hasta la lnea trazada en la parte superior de la placa.

Y: distancia recorrida por el solvente, en cm.

X: distancia recorrida por la muestra, medida en el punto

de mxima intensidad de color o en el centro de
Y gravedad de la mancha, en cm.

X X
Rf
Y

Figura 4

C. CROMATOGRAFA EN COLUMNA
La cromatografa en columna es el mtodo escogido cuando se requiere separar
mezclas de compuestos en cantidades apreciables (4).
El adsorbente slido se empaca tan uniformemente como sea posible en una
columna de vidrio. Luego se adiciona a la parte superior de la columna una solucin
concentrada de la mezcla a ser separada. En seguida la columna se desarrolla
permitiendo que un solvente pase lentamente a travs de ella, estando el empaque
cubierto con dicho solvente durante todo el tiempo (4).
Los componentes de la mezcla son continua y reversiblemente adsorbidos sobre el
slido, luego desadsorbidos por accin del eluente, mientras descienden lentamente a
travs de la columna (4).
Los compuestos no polares slo son dbilmente adsorbidos por el adsorbente y son
fcilmente eludos con solventes no polares. Por el contrario, los compuestos polares son
fuertemente adsorbidos y slo pueden ser eludos con solventes relativamente polares.

1. Preparacin de la Columna Cromatogrfica (Empaque hmedo)

La columna cromatogrfica debe estar limpia y completamente seca, as como los
tubos de ensayo que se utilizan para recolectar el eluente.
i Se dispone la columna y sus accesorios como se ilustra en la Figura 5a.
ii Se tapa adecuadamente el fondo de la columna con un dispositivo obturador: Con
ayuda de una varilla de vidrio, de dimetro y tamao adecuado a las dimensiones de la
columna, se rellena el fondo de la misma con un poco de algodn, y luego, se vierte un
poco de arena de modo de formar una capa uniforme de unos 5mm de espesor (Nota 6).
iii En un vaso de 50 mL, se prepara una papilla mezclando el adsorbente con el solvente:
8 g de almina y 10 mL de ter de petrleo (Nota 7).
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iv La operacin que sigue debe ser realizada rpidamente, sin aplicar succin con vaco
al sistema (Nota 8). Si desea, se coloca un embudo de vidrio en la parte superior de la
columna: se llena la columna con un poco de ter de petrleo (Nota 9), hasta
aproximadamente 1/2 a 1/3 de su volumen, e inmediatamente se vierte dentro de la
columna en pequeas porciones, la papilla de adsorbente-solvente previamente
preparada.
v Durante la adicin del adsorbente, se golpea suavemente la columna con el extremo de
una varilla de vidrio (o, si se ha utilizado un embudo golpear suavemente con el
vstago en las paredes interiores de la columna) originndose de este modo una
vibracin suficiente para garantizar una cada uniforme del adsorbente, el cual se
dispersa por accin del solvente antes de depositarse en el fondo de la columna,
proporcionando una superficie de empaque horizontal y plana (Figura 5b).
vi Una vez que el tubo de ensayo (el colector de solvente eludo) est lleno hasta 3/4
partes de su capacidad se cambia por uno nuevo (Nota 9). Para ello, se debe tener a
disposicin varios tubos de ensayo limpios y secos, a los cuales se les ha adaptado
una soguilla de hilo para realizar rpidamente el cambio de tubos.
vii Debe evitarse que, una vez empacado, el adsorbente se seque (Nota 10); es decir, que
el nivel del solvente desciende por debajo de la superficie del adsorbente, pues esto
puede echar a perder la eficiencia de la columna (Nota 11). Cuando el nivel del
solvente est a 1 mL de la superficie slida, se adiciona ms solvente.
viii En caso de que la velocidad de descenso del solvente por la columna se torne muy
lento (esto suceder luego que se haya empacado algo de adsorbente). Aplique
cuidadosamente la succin con vaco (Nota 8) a fin de acelerar el descenso del
solvente y garantizar el empaque uniforme.
ix Cuando se ha adicionado todo el adsorbente, se hace descender lentamente el
solvente (Nota 8), y cuando el nivel de ste llegua a la superficie del slido,
rpidamente se cubre ste con una capa de arena de 5 mm de espesor e
inmediatamente se recubre la superficie de sta con un poco de solvente (Figura 5c).
Ahora, la columna est lista para aplicar la muestra y desarrollar el cromatograma.

Figura 5.- Empaque hmedo de una columna cromatogrfica (3,4)

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D. NOTAS
1. Coloque a secar el siguiente equipo de vidrio: 3 cubetas de vidrio para CCF con sus
respectivas cubiertas.
2. Slice GF 254 tipo 60 (Merck), especial para cromatografa en capa fina, o Silicagel G
(tipo 60) para CCF.
3. La actividad (afinidad por las molculas) de los adsorbentes se afecta inversamente
con el aumento de su contenido de agua: cuanto ms agua contiene el adsorbennte,
adsorber menos fuertemente. Por tanto, es posible adaptar a estos adsorbentes
(variando su contenido de agua de hidratacin) a un amplio rango de separaciones
cromatogrficas, dependiendo de la mezcla de compuestos que deseemos separar (3).
4. Al trmino de la prctica de laboratorio verter los solventes utilizados en las cubetas en
las botellas de recuperacin de solventes respectivas.
5. Ponga a secar la columna cromatogrfica y 8 tubos de ensayo.
6. Algunos tipos de columnas tienen un disco de obturacin de vidrio fritado adaptado
internamente en ellas, de modo que ya no es necesario colocar el dispositivo obturador
de algodn-arena.
7. El solvente que se usa para la preparacin de la papilla adsorbente-solvente y para el
empaque de la columna es, en general, un solvente no polar, sea cual fuere el solvente
que se usar para realizar la elusin cromatogrfica.
8. La vlvula de succin que conecta la lnea de vaco con el sistema cromatogrfico)
puede ayudarnos a detener, hacer lento o acelerar el descenso del solvente por la
columna segn sea conveniente. Ensayar cuidadosamente en las distintas posiciones
de la vlvula. En caso de querer reducir al mnimo el descenso del solvente,
desconectar la succin con vaco.
9. El solvente recolectado puede servir para volverlo a usar en el proceso de empaque y/o
elusin de la columna. Se hace uso del tubo de ensayo debido a que la succin
arrastrara al solvente hacia la lnea de vaco, y a la facilidad de operacin que presenta
este dispositivo.
10. Disponer de unos 5-10 mL de solvente en un tubo de ensayo para ser usados
inmediatamente, de modo de evitar que la columna se seque.
11. El secado de la columna ocasiona filtraciones de aire en la capa de adsorbente,
formndose grietas por donde pasara luego, sin interactuar con el adsorbente, las
molculas de solvente y de los pigmentos.

E. REFERENCIAS
1 Gaucher,B. M., F. J. Chem. Ed., 46, 729-733 (1969)
An introduction to chromatography
2 Dominguez, X., Cromatografa en papel y en capa delgada, Programa Regional de Desarrollo
Cientfico y Tecnolgico, OEA, Washington D.C., 1975, pgs.1-2.
3 Cava, M. and M. Mitchell, Selected Experiments in Organic Chemistry, W. A. Benjamin, Inc.,
New York, 1969, pgs 95-98.
4 Caserio, M., Experimental Organic Chemistry, W. A. Benjamin, Inc., 1967, pgs. 1-10, 13-17.