Manual de Microbiología

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE QUERTARO
Pre-
LABORATORIO DE
FACULTAD DE QUMICA CLAVE requisito
Laboratorio de microbiologa
MICROBIOLOGA
ACADEMIA DE QFB
MANUAL DE PRCTICAS
.
.
.
Pre-
Laboratorio de microbiologa 591 724

ABORATORIOExp. Biolgica
Introduccin
Este laboratorio pretende capacitar al estudiante para la ejecucin, implementacin e

interpretacin de las tcnicas microbiolgicas bsicas, y a la vez, proporcionar un panorama
general de la forma en que se efecta el estudio sistemtico de los microorganismos.
Las practicas se han programado en forma creciente de complejidad y tanto la

implementacin de las diferentes tcnicas, ejecucin e interpretacin de resultados,
requieren del conocimiento y consideracin de las prcticas y resultados anteriores; por lo
que cada unidad tiene como antecedentes, los objetivos de la unidad previa.
Es importante recalcar que es indispensable la integracin de los conocimientos y

habilidades adquiridas en la teora, con aquellos logrados en el laboratorio, para lograr un
buen desempeo en ambas partes del curso.
Pre-

ndice
Introduccin
Contenido Temtico
Reglamento del Laboratorio de Microbiologa
Unidad I. Higiene y Seguridad en el laboratorio de Microbiologa
Unidad II. Microscopa y Morfologa Microbiana
I. El microscopio, Calibracin
II. Tinciones simples y hmedas
III. Tinciones Diferenciales
IV. Utilizacin de colorantes vitales. Identificacin y descripcin de la

morfologa de bacterias esporuladas y capsuladas
Unidad III. Manejo de cultivos puros
I. Preparacin y esterilizacin de material de vidrio y medios de cultivo
II. Seleccin de medios de cultivo
III. Verificacin de la eficacia de esterilizacin: Recuento de mos
IV. Cultivo Puro de microorganismos
V. Conservacin de cultivos Puros
Unidad IV. Obtencin e identificacin de cultivos puros
I. Identificacin Bacteriana
Pre-

Unidad V. Evaluacin del crecimiento bacteriano
I. Crecimiento Bacteriano
II. Recuento de microorganismos por Mtodos Directos
III. Anlisis microbiolgico de la leche, anlisis microbiolgico del agua
Unidad VI. Control de microorganismos
I. Determinacin del efecto de agentes qumicos

Pre-

CONTENIDO TEMTICO
Unidad I. Higiene y Seguridad en el laboratorio de Microbiologa
Objetivo
Explicaran y observaran las reglas bsicas de higiene y seguridad para los laboratorios
de microbiologa, dada la importancia que estos tienen.
Actividades
1. Elaborar un reglamento sobre seguridad e higiene en el laboratorio de microbiologa.

2. Elaborar guas de observacin para supervisar el cumplimiento de las normas
establecidas.
Unidad II. Microscopa y Morfologa Microbiana
Objetivo
Harn el estudio microscpico de los microorganismos procariotes y eucariotes, adems

los diferenciarn.
Seleccionaran las tinciones adecuadas para la observacin de grupos y caractersticas
especficas de microorganismos.
Determinarn microscpicamente, las dimensiones de los microorganismos.
Actividades
1. Realizaran tinciones simples. Identificacin y descripcin de morfologa y agrupaciones

de microorganismos.
2. Realizaran tinciones hmedas. Determinacin de la movilidad de los microorganismos.
Identificacin y descripcin de la morfologa de hongos.
3. Utilizacin de colorantes vitales. Identificacin y descripcin de la morfologa de bacterias
esporuladas y capsuladas.
4. Realizar tinciones diferenciales. Diferenciacin de bacterias por su Gram y por su cido
alcohol resistencia.
5. Realizar la calibracin del microscopio y medicin de microorganismos.
Pre-

Unidad III. Manejo de cultivos puros
Objetivo
Cultivaran y conservaran adecuadamente cepas puras de bacterias y hongos.

Prepararan material de vidrio y medios de cultivos de uso comn en el laboratorio de
microbiologa.
Seleccionaran adecuadamente los medios de cultivo y mtodos de esterilizacin para
algunos de los casos ms frecuentes en el laboratorio de microbiologa.
Cultivaran en diversos medios de cultivo, mediante diferentes tcnicas de inoculacin e
incubacin a las bacterias aerobias, anaerobias y hongos.
Organizaran e interpretaran las caractersticas morfolgicas macroscpicas y
microscpicas de diversos microorganismos.
Conservaran adecuadamente, por el resto del curso a algunos cultivos puros.
Actividades
1. Preparacin y esterilizacin de material de vidrio y medios de cultivo; seleccionaran de

medios, mtodos de esterilizacin y verificacin de la eficacia del proceso de
esterilizacin.
2. Realizar las tcnicas de inoculacin para obtener cultivos puros. Cultivo de
microorganismos aerobios. Descripcin e identificacin de caractersticas morfolgicas.
3. Realizar el cultivo de microorganismos anaerobios por diversas tcnicas.
4. Llevar a acabo la conservacin de cultivos puros.
Unidad IV. Obtencin e identificacin de cultivos puros
Objetivos
Aislaran e identificaran cultivos puros de bacterias y hongos.

Seleccionaran tcnicas y medos de cultivo adecuados para el aislamiento de algunos
microorganismos.
Obtendrn cultivos puros de algunos microorganismos de fcil manejo y comprobaran su
pureza.
Actividades
1. Aislamiento de microorganismos por diferentes tcnicas.

2. Comprobacin del aislamiento mediante la observacin macroscpica y microscpica.
3. Utilizacin de esquemas para completar la identificacin del microorganismo aislado,
considerando los datos obtenidos anteriormente.
4. Caracterizacin bioqumica del microorganismo aislado.
Pre-

Unidad V. Evaluacin del crecimiento bacteriano
Objetivos
Seleccionaran y aplicaran diversas tcnicas para determinar el crecimiento microbiano.

Evaluaran el crecimiento bacteriano por diversos mtodos.
Seleccionaran mtodos adecuados de evaluacin del crecimiento microbiano para casos
especficos.
Actividades
1. Recuento de microorganismos mediante mtodos directos: Microscopio, masa celular,

cmara de Breed.
2. Recuento de microorganismos viables. Cuenta en placa.
3. Otros mtodos indirectos de recuento microbiano: Mtodos de xido reduccin, variantes
de pH, cuantificacin de productos, mtodos turbidimtricos.
4. Ejercicios de aplicacin: Anlisis microbiolgico de la leche, anlisis microbiolgico de
agua. Identificacin del ndice de contaminacin.
Unidad VI. Control de microorganismos
Objetivos
Seleccionaran y aplicaran agentes qumicos y fsicos para propiciar e inhibir el desarrollo

bacteriano.
Determinaran prcticamente el efecto de diversos agentes fsicos y qumicos en el
crecimiento microbiano e interpretarn el efecto de dichos agentes.
Aplicaran los conocimientos sobre microorganismos y sobre agentes externos en el
cultivo, control y estudio de los microorganismos.
Actividades
1. Determinacin del efecto de algunos agentes fsicos sobre los microorganismos

(temperatura, radiacin, presin osmtica).
2. Determinacin del efecto de algunos agentes qumicos sobre los microorganismos
8fenoles, alcoholes, metales pesados, agentes oxidantes, colorantes, etc.)
3. Ejercicio de aplicacin: Determinacin del efecto de algunos agentes fsicos y qumicos
sobre un microorganismo problema. Interpretacin de resultados.
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REGLAMENTO DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA
1. Se deber llegar puntual a cada una de las sesiones impartidas a lo largo de todo el
semestre, slo se contemplarn 15 minutos de tolerancia.
2. Es de carcter obligatorio el portar la bata de laboratorio la cual deber contar con
manga larga, y cubrir al menos hasta la rodilla.
3. Se portarn, siempre, zapatos cerrados.
4. Antes de comenzar a realizar cualquier procedimiento y antes de retirarse del laboratorio
se debern limpiar las mesas de trabajo.
5. Queda estrictamente prohibido el consumir alimentos, bebidas o fumar dentro del
laboratorio de microbiologa.
6. Se ingresar al laboratorio slo si se encuentra acompaado al menos de un compaero,
est prohibido trabajar experimentalmente slo.
7. En caso de contar con cabello largo, siempre se recoger, nunca se deber de trabajar
con el cabello suelto.
8. No est permitido, bajo ninguna circunstancia, que los cultivos realizados en el
laboratorio salgan de las instalaciones del mismo.
9. Para evitar cualquier peligro de contaminacin con los microorganismos manejados
durante el trabajo de laboratorio se recomienda tener uas cortas o en su defecto
procurar extrema limpieza.
10. Es de obligacin por equipo de trabajo, contar con los materiales bsicos necesarios
para la limpieza del rea y material de trabajo, como lo son: jabn, fibra, alcohol, y
franela.
11. Antes y despus de realizar cualquier trabajo experimental, se debern lavar las manos,
para evitar contaminaciones (personales y del medio).
12. Durante el proceso de sembrado de cultivos microbiolgicos se deber guardar
compostura, es decir no se deber de hablar y no se deber de caminar y/o correr
alrededor de las mesas de trabajo.
13. En aquellos casos en los que los microorganismos a manipular sean de carcter nocivo,
as como en el caso de manejar reactivos peligrosos; se deber, estrictamente,
maniobrar a dichos microorganismos y/o reactivos en campana de extraccin o flujo
laminar.
Se sugiere que para prcticas experimentales en las que se utilice el microscopio, por
mantenimiento de lentes de los oculares, no se use rmel o algn otro cosmtico en los ojos
y/o pestaas.
Pre-

Nombre de la prctica:
Prctica Pginas Pginas de la
Higiene y seguridad en el laboratorio de 1 8 1a8
microbiologa
Realiz: Revis: Autoriz:
Q.B. Sergio Pacheco Hernndez
Fecha: marzo 2008 Fecha: Fecha:

Pre-

Contenido Pgina
I. INTRODUCCIN 1
II. CONOCIMIENTOS PREVIOS 6
III. OBJETIVO 6
IV. METODOLOGIA 7
IV. 1. Materiales. 7
IV. 2. Requerimientos de seguridad. 7
IV. 3. Disposicin de residuos 7
V. RESULTADOS. 7
VI. DISCUSION. 8
VII. CONCLUSIONES. 8
VIII. BIBLIOGRAFIA 8
Pre-

INTRODUCCIN
El manejo sin riesgos de un laboratorio es responsabilidad del encargado. Esta

responsabilidad puede delegarse, reasignarse, abandonarse o ignorarse, pero cuando se
produce un accidente vuelve siempre sin excepcin a recaer en el encargado del laboratorio.
Este ltimo debe desarrollar y aplicar un programa de seguridad operativa que minimice con
eficacia los riesgos francos inherentes al laboratorio para todos los que estn expuestos
directa o indirectamente a ellos. Los riesgos potenciales del laboratorio pueden referirse a
materiales infecciosos, qumicos y a las instalaciones fsicas de la institucin. Un buen
programa de seguridad para un laboratorio debe abarcar consideraciones de
almacenamiento, uso y eliminacin de materiales riesgosos qumicos y radiactivos, operacin
y mantenimiento de las instalaciones, capacitacin del personal y vigilancia mdica.
Debemos destacar que los riesgos de exposicin a los agentes infecciosos no se limitan al
personal del laboratorio microbiolgico.
Aun aquellos laboratorios que no estn relacionados con el cultivo e identificacin de los
organismos patgenos, hay cierto riesgo de infeccin accidental como consecuencia de que
tales bacterias pueden crecer ocasionalmente en sustancias distintas a las patolgicas. Los
procedimientos tcnicos normales para mantener cultivos estriles o puros e impedir la
contaminacin de los productos de laboratorio, contribuyen de forma importante a la
seguridad de las personas y la mayor parte de los investigadores guardan normas
razonablemente altas de higiene personal y se lavan las manos despus de manejar cultivos
de cualquier clase y antes de tocar el resto de su persona, de manipular sus alimentos o
fumar (Collins,1980).
ANTECEDENTES Y CONOCIMIENTOS PREVIOS
Clasificacin de los agentes biolgicos por grupos de riesgo
Agente biolgico del grupo 1. Aqul que resulta poco probable que cause una enfermedad en
el hombre.
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Agente biolgico del grupo 2. Aqul que puede causar una enfermedad en el hombre y
puede suponer un peligro para los trabajadores, siendo poco probable que se propague a la
colectividad y existiendo generalmente profilaxis o tratamiento eficaz.
Agente biolgico del grupo 3. Aqul que puede causar una enfermedad grave en el hombre y
presenta un serio peligro para los trabajadores, con riesgo de que se propague a la
colectividad y existiendo frente a l generalmente profilaxis o tratamiento eficaz.
Agente biolgico del grupo 4. Aqul que, causando una enfermedad grave en el hombre,
supone un serio peligro para los trabajadores, con muchas probabilidades de que se
propague a la colectividad y sin que exista generalmente frente a l profilaxis o tratamiento
eficaz.
Niveles de contencin
La seguridad biolgica se fundamenta en tres elementos:

1) Las tcnicas de laboratorio
2) El equipo de seguridad (o barreras primarias)
3) El diseo de la instalacin (o barreras secundarias).
El trmino contencin se emplea para describir los mtodos que hacen seguro el manejo
de materiales infecciosos en el laboratorio. El propsito de la contencin es reducir al mnimo
la exposicin del personal de los laboratorios, otras personas y el entorno a agentes
potencialmente peligrosos.
Se suelen describir cuatro niveles de contencin o de seguridad biolgica, que consisten en
la combinacin, en menor o mayor grado, de los tres elementos de seguridad biolgica
descritos: tcnica microbiolgica, equipo de seguridad y diseo de la instalacin. Cada
combinacin est especficamente dirigida al tipo de operaciones que se realizan, las vas de
transmisin de los agentes infecciosos y la funcin o actividad del laboratorio.
Nivel de contencin 1
Es el nivel de seguridad requerido para los agentes biolgicos del grupo 1, es decir, los que
no producen enfermedad en el ser humano sano y de susceptibilidad conocida y estable a
los antimicrobianos. Es el utilizado habitualmente en los laboratorios de prcticas de
universidades o centros docentes donde se emplean cepas no patgenas (E. coli K12,
Saccharomyces cerevisiae, etc.). Ejemplos tpicos son todos los microorganismos que se
utilizan en la industria de la alimentacin para la elaboracin de quesos, cerveza, embutidos,
etc.
Es el obligado para agentes del grupo 2 como algunos que, perteneciendo a la propia flora
habitual del hombre, son capaces de originar patologa infecciosa humana de gravedad
moderada o limitada. Deben ser manipulados por personal especializado (tcnicos de
laboratorio, especialistas en Microbiologa) y son los que con ms frecuencia se estudian en
el Laboratorio de Microbiologa Clnica: estafilococos, Salmonella, etc.
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Debe utilizarse cuando se manipulan agentes biolgicos del grupo 3, microorganismos que
cursan con patologa grave, de difcil y largo tratamiento, que pueden curar con secuelas y
ocasionalmente producir la muerte. El mayor y ms frecuente peligro que entraan stos es
la infeccin adquirida a travs de aerosoles y por fluidos biolgicos. Por ello, las principales
medidas a tomar en este caso son la correcta manipulacin y la utilizacin de cabinas de
seguridad. En los laboratorios de Microbiologa Clnica los ejemplos ms tpicos de este tipo
de microorganismos son M. tuberculosis, Brucella, Coxiella burneti, etc. Slo pueden ser
procesados por personal calificado y en una zona con la infraestructura apropiada para el
Nivel de Contencin 3, es decir, con aire acondicionado independiente, sin recirculacin de
aire, con gradiente de presin, cabinas de bioseguridad, etc.
Nivel requerido cuando se procesa con certeza o se sospecha un agente especialmente
patgeno e infectocontagioso, extico o no, que produce alta mortalidad y para el que no
existe tratamiento y/o es poco fiable. Normalmente son microorganismos de dosis infectiva
baja y alta contagiosidad. Este nivel tambin puede utilizarse para trabajar con animales de
experimentacin infectados por microorganismos del grupo 4. Ejemplos de este nivel son los
arenavirus como el que produce la fiebre de Lassa y el virus Machupo, virus Ebola, etc.
Adems, deben incluirse en este nivel de contencin los microorganismos propios del grupo
3 que adquieran propiedades patgenas que los eleven al grupo 4.
Un ejemplo sera Mycobacterium boris multirresistente que puede causar fallecimiento por
fracaso teraputico.
Los laboratorios que realicen trabajos que impliquen la manipulacin de agentes biolgicos
de los grupos 2, 3 4 con fines de investigacin, desarrollo, enseanza o diagnstico
debern establecer medidas de contencin que se aplicaran segn la naturaleza de las
actividades, la evaluacin del riesgo para los trabajadores y las caractersticas del agente
biolgico de que se trate (Picazo, 2000).
Manejo de residuos peligrosos biolgico-infecciosos
Identificacin y envasado
En las reas de generacin de los establecimientos generadores, se debern separar y
envasar todos los residuos peligrosos biolgico-infecciosos, de acuerdo con sus
caractersticas fsicas y biolgicas infecciosas, conforme a la tabla 2 de esta Norma Oficial
Mexicana. Durante el envasado, los residuos peligrosos biolgico-infecciosos no debern
mezclarse con ningn otro tipo de residuos municipales o peligrosos.
Las bolsas debern ser de polietileno de color rojo translcido de calibre mnimo 200 y de
color amarillo traslcido de calibre mnimo 300, impermeables y con un contenido de metales
pesados de no ms de una parte por milln y libres de cloro, adems debern estar
marcadas con el smbolo universal de riesgo biolgico y la leyenda Residuos Peligrosos
Biolgico-Infecciosos.
Los recipientes de los residuos peligrosos punzocortantes debern ser rgidos, de
polipropileno color rojo, con un contenido de metales pesados de no ms de una parte por
milln y libres de cloro, que permitan verificar el volumen ocupado en el mismo, resistentes a
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fracturas y prdidas de contenido al caerse, destructibles por mtodos fsicos, tener
separador de agujas y abertura para depsito, con tapa(s) de ensamble seguro y cierre
permanente, debern contar con la leyenda que indique RESIDUOS PELIGROSOS
PUNZOCORTANTES BIOLOGICO-INFECCIOSOS y marcados con el smbolo universal de
riesgo biolgico.
Figura 1. Tabla 2 en la cual se indica la separacin de residuos biolgico-infecciosos.
Los recipientes de los residuos peligrosos lquidos deben ser rgidos, con tapa hermtica de
polipropileno color rojo o amarillo, con un contenido de metales pesados de no ms de una
parte por milln y libres de cloro, resistente a fracturas y prdidas de contenido al caerse,
destructible por mtodos fsicos, deber contar con la leyenda que indique "RESIDUOS
PELIGROSOS LIQUIDOS BIOLOGICO-INFECCIOSOS" y marcados con el smbolo universal
de riesgo biolgico.
OBJETIVO GENERAL
Explicar y observar las reglas bsicas de higiene y seguridad para los laboratorios de
microbiologa, dada la importancia que stos tienen.
OBJETIVOS PARTICULARES
Elaborar un reglamento sobre la seguridad e higiene en el laboratorio de microbiologa.

Elaborar guas de observacin para supervisar el cumplimiento de las normas
establecidas.
METODOLOGA
Parte A. Reglamento Interno del Laboratorio

Pre-

1. Elaborar un reglamento interno para el laboratorio, contemplando las normas de
seguridad del personal, manejo de reactivos, as como cuidados e higiene dentro de las
instalaciones del laboratorio para microbiologa.
Parte B. Disposiciones Federales
1. Investigar cual es la Norma Oficial Mexicana que establezca los requisitos para la
separacin, envasado, almacenamiento, recoleccin, transporte, tratamiento y
disposicin final de los residuos peligrosos biolgico-infecciosos que se generan en
establecimientos que prestan atencin mdica.
RESULTADOS
Parte A. Reglamento Interno del Laboratorio
Propuesta del reglamento de Laboratorio
Para el desarrollo de las prcticas es conveniente tener en cuenta algunas normas

elementales que deben ser observadas con toda escrupulosidad:
1. Antes de realizar una prctica, debe leerse para adquirir una idea clara de su objetivo,
fundamento y tcnica. (Los resultados deben ser siempre anotados cuidadosamente
apenas se conozcan).
2. Accidentes personales, tales como derrame de reactivos, cortes y quemaduras, deben
comunicarse inmediatamente al profesor.
3. El orden y la limpieza son esenciales en todas las experiencias de laboratorio. En
consecuencia, al terminar cada prctica se proceder a limpiar cuidadosamente el
material que se ha utilizado. Cada grupo de prcticas se responsabilizar de su zona de
trabajo y de su material.
4. Los productos inflamables (gases, alcohol, ter, etc.) deben mantenerse alejados de las
llamas de los mecheros. Si se manejan mecheros de gas se debe tener mucho cuidado
de cerrar las llaves de paso al apagar la llama.
5. Cuando no se utilizan los mecheros, stos deben guardarse y se debe estar seguro que
se les ha apagado al final de cada laboratorio.
6. Antes de utilizar un compuesto hay que fijarse en la etiqueta para asegurarse de que es
el que se necesita y de los posibles riesgos de su manipulacin.
7. Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como lupas y microscopios,
deben manejarse con cuidado evitando los golpes o el forzar sus mecanismos.
8. Todos los materiales de desecho que hayan entrado en contacto con microorganismos
(como pipetas usadas, placas petri o tubos), deben proceder posteriormente a su
esterilizacin.
9. Utilizar los recipientes adecuados para depositar los residuos peligrosos, biolgico -
infecciosos que se generen en la realizacin de la prctica. No tirar nada en los lavabos.
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El material de desecho no contaminado como papeles de envoltura depositarlos en los
recipientes de basura comn.
10. Usar siempre bata en el laboratorio.
11. Nunca deben sustraerse cultivos de microorganismos del laboratorio.
12. Lavarse las manos con jabn o con un desinfectante si es necesario, antes de dejar el
laboratorio.
13. Para la hora de llegada se darn 15 minutos de tolerancia.
14. Utilizar zapato cerrado.
15. Nunca se debe trabajar solo.
16. Entrar con el cabello recogido para las personas que lo tengan largo, no traer uas largas
adems de no usar rimel.
17. Utilizar, de preferencia, las campanas cuando se vacen los medios de cultivo.
18. Los medios inoculados deben colocarse en las cmaras de cultivo con su identificacin
respectiva, ej.: nmero de mesa, nombre, naturaleza del espcimen o sustrato del cual
se asla
19. Al estar sembrando procurar no hablar, para as evitar cultivos contaminados, adems de
no caminar alrededor de la mesa para evitar dicha situacin.
20. Los tubos de ensayo que contengan medios de cultivos o cultivos de microorganismos,
nunca deben abrirse en posicin vertical, sino lo ms horizontalmente posible (inclinados)
y para quitar el tapn se mantendrn inclinados con una mano y se abrirn con la otra,
que sostendr a su vez el asa. Una vez abierto, se flamea por algunos segundos el
orificio, repitiendo dicha operacin una vez realizada la siembra (el tapn nunca debe
dejarse sobre la mesa).
21. Antes de utilizar las asas con hilos de platino que sirven para las siembras, stas deben
flamearse al rojo en posicin vertical bajo la accin de la llama; tambin debe flamearse
el mango. Antes de efectuar la siembra debe esperarse algunos segundos a que se
enfren, pudiendo enfriarse tambin en el borde de la placa de Petri que contiene el
medio de cultivo. Inmediatamente despus de haberlas utilizado, deben flamearse
nuevamente.
22. Cuando se utilice luz ultravioleta debe tomarse en cuenta que la exposicin a esta
radiacin es peligrosa.
Parte B. Disposiciones Federales
Clasificacin de los residuos peligrosos biolgico-infecciosos
Para efectos de la NOM-087-ECOL-SSA1-2000 se consideran residuos peligrosos biolgico-

infecciosos los siguientes:
1. La sangre y los componentes de sta, slo en su forma lquida, as como los derivados
no comerciales, incluyendo las clulas progenitoras, hematopoyticas y las fracciones
celulares o acelulares de la sangre resultante (hemoderivados).
2. Los cultivos generados en los procedimientos de diagnstico e investigacin, as como
los generados en la produccin y control de agentes biolgicos.
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3. Utensilios desechables usados para contener, transferir, inocular y mezclar cultivos de
agentes infecciosos.
4. Los tejidos, rganos y partes que se remueven durante las necropsias, la ciruga o algn
otro tipo de intervencin quirrgica.
5. Las muestras biolgicas para anlisis qumico, microbiolgico, citolgico e histolgico,
excluyendo orina y excremento.
6. Los cadveres y partes de animales que fueron inoculados con agentes enteropatgenos
en centros de investigacin, bioterios y consultorios veterinarios.
7. Los recipientes desechables que contengan sangre lquida.
8. Los materiales de curacin empapados, saturados o goteando sangre o cualquiera de los
siguientes fluidos corporales: lquido sinovial, lquido pericrdico, lquido pleural, lquido
cfalo-raqudeo o lquido peritoneal.
9. Los materiales desechables que contengan esputo, secreciones pulmonares y cualquier
material usado para contener stos, de pacientes con sospecha o diagnstico de
tuberculosis o de otra enfermedad infecciosa segn sea determinado por la Secretara de
Salud mediante memorndum interno o el Boletn Epidemiolgico.
10. Los materiales desechables que contengan sangre, o secreciones de pacientes con
sospecha o diagnstico de fiebres hemorrgicas, as como otras enfermedades
infecciosas emergentes segn sea determinado por la Secretara de Salud mediante
memorndum interno o el Boletn Epidemiolgico.
11. Materiales absorbentes utilizados en las jaulas de animales que hayan sido expuestos a
patgenos entricos.
12. Los que han estado en contacto con humanos o animales o sus muestras biolgicas
durante el diagnstico y tratamiento, nicamente: tubos capilares, navajas, lancetas,
jeringas desechables con aguja, agujas hipodrmicas, de sutura, de acupuntura y para
tatuaje, bistures y estiletes de catter, excepto todo material de vidrio roto utilizado en el
laboratorio, el cual deber desinfectar o esterilizar antes de ser dispuesto como residuo
municipal.
DISCUSIN:
CONCLUSIONES:
Pre-

BIBLIOGRAFA
NOM-087-ECOL-SSA1-2000, Proteccin ambiental Salud ambiental - Residuos peligrosos

biolgico-infecciosos - Clasificacin y especificaciones de manejo. (Ver anexo)
Picazo, P. 2000. Procedimientos en Microbiologa Clnica. Recomendaciones de la Sociedad

Espaola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica.
MICROSCOPA Y MORFOLOGA 2 8 1a8
Pre-

MICROBIANA

Pre-

Contenido Pgina
I. INTRODUCCIN 2
II. ANTECEDENTES 4
III. CONOCIMIENTOS PREVIOS 5
IV. OBJETIVO 5
V. METODOLOGIA 6
V. 1. Material y equipo. 8
V. 2. Reactivos y soluciones. 8
V. 3. Requerimientos de seguridad 8
V.4. Disposicin de residuos 8
V. 5. Procedimiento. 9
V. 6. Diseo experimental (si lo hay)
VI. RESULTADOS. 9
VI.1 Clculos 10
VII. DISCUSION. 11
VIII. CONCLUSIONES. 11
IX. BIBLIOGRAFIA 11
Pre-

I. INTRODUCCION.
Para poder realizar una buena identificacin de microorganismos por medio de tinciones
requerimos tener un microscopio calibrado y en condiciones ptimas para su uso. El
microscopio es un aparato de precisin, hecho de materiales valiosos por obreros expertos.
Prestndole un cuidado razonable, dura por mucho tiempo, pero el menor descuido bien
puede arruinarlo.
El microscopio se debe llevar por su brazo y mientras no se usa, se debe colocar en su caja
o taparse adecuadamente para protegerlo contra el polvo. Cuando el microscopio se lleva de
una habitacin fra a una habitacin caliente, se debe permitir que se caliente poco a poco
antes de usarse.
Las lentes se deben guardar exquisitamente limpias. El polvo se debe aflojar, quitndose con
un cepillo de pelo de camello, y la lente se debe limpiar con papel para lentes. El vidrio ptico
es por lo general ms blando que el vidrio para ventana, y se puede rayar fcilmente por el
pao ordinario o cuando las partculas de polvo no se quitan antes de pulir. Hay papel
especial para lentes, y es poco econmico el no usarlo. Los objetivos secos, el condensador,
y los oculares se pueden limpiar con agua destilada cuando es necesario un lquido; un
objetivo de inmersin, y la lente superior del condensador, con xileno. La lente no se debe
empapar en xileno ni con otro disolvente porque la montura de la lente podra daarse, si se
mete ms all del cierre de la lente anterior en el objetivo.
De manipularse desmaadamente o si se deja caer, podra entorpecer con el ajuste de las
partes pticas del microscopio. As en ptimas condiciones se puede proceder a leer las
tinciones preparadas.
Tinciones simples
Azul de metileno (Tincin positiva). Permite teir el interior celular. Tie
microorganismos procariticos (vivos o muertos). Los eucariticos slo se tien si estn
muertos. Algunas estructuras, como los corpsculos meta cromticos, se tien ms
intensamente con este colorante que el resto de la clula.
Nigrosina (Tincin negativa). Se trata de un colorante aninico, que no penetra en el

interior celular. Proporciona una visin de la forma y el tamao celulares al observarse los
microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro.
Tincin Simple
Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tien con la misma
tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol). El Hidrxido de
potasio al 10% (solucin de KOH) permite ver elementos de hongos ya que el KOH digiere
parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la clula husped, pero no acta
sobre los polisacridos de las paredes celulares de los hongos. La tinta china o Nigrosina
permite observar clulas levaduriformes capsuladas Criptococcus, sobre todo en LCR. Los
polisacridos capsulares rechazan la tinta china y la cpsula aparece como un halo claro
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alrededor de los microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puede agregarse a las
preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos.
Preparacin en fresco o hmeda : para poder observar la movilidad de un microorganismo

es preciso que no est fijado. Consiste en suspender una gota, tomada directamente de la
muestra, sobre un portaobjetos y cubrindola, sin formar burbujas de aire, con un
portaobjetos se observa al microscopio de contraste de fases.
I. El microscopio, Calibracin
ANTECEDENTES
El microscopio es un instrumento que permite la observacin de organismos que no pueden

ser apreciados en detalle a simple vista, es decir de los microorganismos.
El tipo de microscopio ms utilizado es el microscopio ptico, que se sirve de la luz visible
para crear una imagen aumentada del objeto. El microscopio ptico ms simple es la lente
convexa doble con una distancia focal corta. Estas lentes pueden aumentar un objeto hasta
15 veces. Por lo general, se utilizan microscopios compuestos, que disponen de varias lentes
con las que se consiguen aumentos mayores. Algunos microscopios pticos pueden
aumentar un objeto por encima de las 2.000 veces.
Hay diversos microscopios pticos para funciones especiales. Uno de ellos es el microscopio
estereoscpico, que no es sino un par de microscopios de baja potencia colocados de forma
que convergen en el espcimen. Estos instrumentos producen una imagen tridimensional.
El microscopio de luz ultravioleta utiliza el rango ultravioleta del espectro luminoso en lugar
del rango visible, bien para aumentar la resolucin con una longitud de onda menor o para
mejorar el detalle absorbiendo selectivamente distintas longitudes de onda de la banda
ultravioleta. Dado que el vidrio no transmite las longitudes de onda ms cortas de la luz
ultravioleta, los elementos pticos de estos microscopios estn hechos con cuarzo, fluorita o
sistemas de espejos aluminizados. Adems, dado que la radiacin ultravioleta es invisible, la
imagen se muestra con fosforescencia en fotografa o con un escner electrnico. El
microscopio de luz ultravioleta se utiliza en la investigacin cientfica.
El microscopio en campo oscuro utiliza una luz muy intensa en forma de un cono hueco
concentrado sobre el espcimen. El campo de visin del objetivo se encuentra en la zona
hueca del cono de luz y slo recoge la luz que se refleja en el objeto. Por ello, las porciones
claras del espcimen aparecen como un fondo oscuro y los objetos minsculos que se estn
analizando aparecen como una luz brillante sobre el fondo. Esta forma de iluminacin se
utiliza para analizar elementos biolgicos transparentes y sin manchas, invisibles con
iluminacin normal.
El microscopio de fase ilumina el espcimen con un cono hueco de luz, como en el
microscopio en campo oscuro. Sin embargo, en el microscopio de fase el cono de luz es ms
estrecho y entra en el campo de visin del objetivo, que contiene un dispositivo en forma de
Pre-

anillo que reduce la intensidad de la luz y provoca un cambio de fase de un cuarto de la
longitud de onda. Este tipo de iluminacin provoca variaciones minsculas en el ndice de
refraccin de un espcimen transparente, hacindolo visible. Este tipo de microscopio es
muy til a la hora de examinar tejidos vivos, por lo que se utiliza con frecuencia en biologa y
medicina.
Microscopia de campo luminoso

En la microscopia de campo luminoso, el campo microscpico est intensamente iluminado y
los objetos que se estudian all aparecen ms oscuros. Por lo general, los microscopios de
este tipo dan aumentos tiles de unos 1000 dimetros.
Poder de resolucin
Es la capacidad de distinguir dos puntos adyacentes como distintos y separados.
El poder de resolucin de un microscopio est en funcin de la longitud de onda de la luz que
se usa y de la apertura numrica que es una caracterstica del sistema de lentes que se
explica a continuacin.
Apertura numrica
El ngulo determinado por el eje ptico y los rayos ms externos que an capta el objetivo
es una medida de la apertura del objetivo, es la mitad del ngulo de apertura. La magnitud de
este ngulo se expresa como un valor seno. El valor seno de la mitad del ngulo de apertura
se multiplica por el ndice de refraccin n del medio que llena el espacio entre el
cubreobjetos, y el objetivo de la apertura numrica:
AN = nsen
El lmite de resolucin, el objeto ms pequeo que pueda verse distintamente, se consigue

con la longitud de onda ms corta de luz visible y un objetivo que tenga el mximo de AN.
longitud de onda de la luz ( )

Poder de resolucin
AN objetivo AN condensado r
El objeto removible que puede verse con un microscopio tpico de luz es de 0.2m. La mayor
parte de los microscopios de los laboratorios estn equipados con tres objetivos de diferente
amplificacin cada uno. El grado de amplificacin se determina multiplicando el poder de
amplificacin del objetivo por el del ocular. Regularmente, se usa el ocular que amplifica 10
veces (Pelczar, 1982).
Manejo y uso del microscopio ptico compuesto
Partes de un microscopio ptico
Sistema ptico
Ocular: Lente situada cerca del ojo del observador. Ampla la imagen del objetivo.
Pre-

Objetivo: Lente situada cerca de la preparacin. Ampla la imagen de sta.
Condensador: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin.
Diafragma: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
Foco: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
Sistema mecnico
Soporte: Mantiene la parte ptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.
Platina: Lugar donde se deposita la preparacin.
Cabezal: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular.
Revlver: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos.
Tornillos de enfoque: Macromtrico que aproxima el enfoque y micromtrico que consigue el
enfoque correcto.
Manejo del microscopio ptico
1. Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de empleo y bajar la platina

completamente. Si el microscopio se recogi correctamente en el uso anterior, ya
debera estar en esas condiciones.
2. Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas.
3. Comenzar la observacin con el objetivo de 4x (ya est en posicin) o colocar el de 10
aumentos (10x) si la preparacin es de bacterias.
Para realizar el enfoque

Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo macromtrico.
Esto debe hacerse mirando directamente y no a travs del ocular, ya que se corre el riesgo
de incrustar el objetivo en la preparacin pudindose daar alguno de ellos o ambos.
Mirando, ahora s, a travs de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la
preparacin con el macromtrico y, cuando se observe algo ntida la muestra, girar el
micromtrico hasta obtener un enfoque fino.
Pasar al siguiente objetivo. La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente
con mover un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se
perdi por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir
la operacin desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la
preparacin y por ello es fcil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la
preparacin si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersin
si se observa una preparacin que ya se enfoc con el objetivo de inmersin.
Empleo del objetivo de inmersin

Bajar totalmente la platina. Subir totalmente el condensador para ver claramente el crculo de
luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habr que echar el aceite. Girar el
revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio camino entre ste y el de 40x.
Colocar una gota mnima de aceite de inmersin sobre el crculo de luz. Terminar de girar
suavemente el revlver hasta la posicin del objetivo de inmersin.
Pre-

Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota
de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente.
Enfocar cuidadosamente con el micromtrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de
inmersin y la preparacin es mnima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de
accidente es muy grande.
Una vez se haya puesto aceite de inmersin sobre la preparacin, ya no se puede volver a
usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se manchara de aceite. Por tanto, si desea
enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operacin desde el paso 3.
Una vez finalizada la observacin de la preparacin se baja la platina y se coloca el objetivo
de menor aumento girando el revlver. En este momento ya se puede retirar la preparacin
de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersin en posicin de observacin.
Limpiar el objetivo de inmersin con cuidado empleando un papel especial para ptica.
Comprobar tambin que el objetivo 40x est perfectamente limpio.
Mantenimiento y precauciones
Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posicin de
observacin, asegurarse de que la parte mecnica de la platina no sobresale del borde de la
misma y dejarlo cubierto con su funda. Cuando no se est utilizando el microscopio, hay que
mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y daen las lentes. Si no se va
a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para
protegerlo del polvo.
Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente
con un papel de filtro o, mejor, con un papel de ptica. No dejar el portaobjetos puesto sobre
la platina si no se est utilizando el microscopio. Despus de utilizar el objetivo de inmersin,
hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pauelos especiales para ptica o con
papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso se pasar el papel por la lente en un
solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay
que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo
de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden daar las lentes y
su sujecin.
No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macromtrico, micromtrico, platina,
revlver y condensador). El cambio de objetivo se hace girando el revlver y dirigiendo
siempre la mirada a la preparacin para prevenir el roce de la lente con la muestra. No
cambiar nunca de objetivo agarrndolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se est
observando a travs del ocular.
Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algn lquido,
secarlo con un pao. Si se mancha de aceite, limpiarla con un pao humedecido en xilol.
Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesin prctica y, al
acabar el curso, encargar a un tcnico un ajuste y revisin general de los mismos.
Pre-

Iluminacion de Khler
En microscopia, la iluminacin de la muestra es la variable ms importante para obtener

imgenes de alta calidad. No obstante, con frecuencia la mayora de los sofisticados y bien
equipados microscopios no pueden rendir las imgenes excelentes debido al uso incorrecto
de la fuente de luz, que conduce generalmente a la iluminacin inadecuada de la muestra.
Toda muestra correctamente iluminada debe estar libre de brillo y la luz dispersada
uniformemente en el campo visual.
Los cambios ms importantes en la microscopia surgieron a partir de los comienzos del siglo
XX, cuando el gran fsico Alemn, el Dr. August Khler, desarroll un nuevo sistema de
iluminacin, que an hoy en da se maneja y lleva su nombre. Esta es recomendada por
todos los fabricantes de los microscopios modernos del laboratorio permitiendo as que el
microscopista utilice el microscopio a su capacidad mxima.
La iluminacin de Khler es una tcnica de iluminacin utilizada en la mayora de los
microscopios, que consigue una iluminacin uniforme de la muestra y con ello el uso ptimo
del microscopio.
Los tres objetivos que persigue son:
Crear un campo uniforme de iluminacin sobre la muestra (donde la muestra est
desenfocada).
El diafragma de campo, est en el mismo plano de foco que la imagen. El diafragma de
campo puede ajustarse de forma que enfoque toda la muestra o nicamente una parte de
sta.
La apertura numrica de la fuente luminosa es ajustable (variando la apertura del diafragma),
sin que esto afecte al tamao del campo iluminado (Ramos, 2003).
OBJETIVO GENERAL
Realizar el estudio microscpico de los microorganismos procariotes y eucariotes,

adems de diferenciarlos.
Seleccionar las tinciones adecuadas para la observacin de grupos y caractersticas
Organizar e interpretar los resultados del estudio microscpico de los microorganismos.
Realizar tinciones simples.

Utilizacin de colorantes vitales.
Realizar tinciones diferenciales.
Realizar la calibracin del microscopio.
Pre-

MATERIALES Y MTODOS
Microscopio de campo claro

Frotis bacterianos
Papel para lentes
Diagrama de Flujo
Colocar el
microscopio en una Ajustar la distancia Cerrar
mesa que permita una interpupilar as como las diafragma de
cmoda observacin a dioptras campo
travs del ocular.
Abrir luz (ni tan

Abrir diafragma Bajar
amarilla ni tan
de iris condensador
blanca)
Buscar hexgono Abrir diafragma de

en campo as como Centrar el campo para corroborar
anillos de Newton hexgono que hexgono est en el
centro
Slo observar con

diafragma de iris y
condensador
Pre-

RESULTADOS
a) b)
Figura 1. Mala y buena iluminacin para el uso del microscopio (a y b).

Pre-

Figura 2. Obtencin de una iluminacin Khler.
II. Tinciones simples y hmedas
Antecedentes
Observacin microscpica
Para observar una muestra al microscopio ptico se puede recurrir a:
Preparacin hmeda: Se realiza colocando una gota de la suspensin de microorganismos
entre un porta y un cubreobjetos, se observa directamente.
Preparacin fijada: Se coloca una suspensin homognea de microorganismos en una gota
de agua sobre un portaobjetos y se fija mediante calor y agentes qumicos. Despus se tien
mediante diferentes tcnicas. Estas preparaciones se observan sin cubreobjetos y
habitualmente con objetivos de inmersin.
Las tinciones pueden ser simples, donde se utilizan un colorante. Se basan en el hecho de
que las clulas tienen una composicin qumica diferentes a la de su entorno, de modo que
ambos se comportan de forma diferente frente a un colorante. El colorante tie las clulas
(azul de metileno, safranina o nigrosina).
Estudia levaduras, en y se observan cocos en las levaduras. Estas clulas bacterianas
difieren desde el punto de vista qumico de su medio exterior y por eso se tien contrastando
con su alrededor.
Pre-

Azul de metileno (Tincin positiva)
Permite teir el interior celular. Tie microorganismos procariticos vivos o muertos. Los
eucarioticos slo se tien si estn muertos. Algunas estructuras, como los corpsculos
metacromticos, se tien ms intensamente con este colorante que el resto de la clula
(Olivas, 2004).
Nigrosina, tincin negativa o tincin de cpsula
Los organismos procariticos secretan en su superficie materiales viscosos y pegajosos,

suelen ser polisacridos y otras protenas. Se le llama cpsula o capa mucosa o glicoclix,
material polisacrido alrededor de la clula. La composicin de estas capas varan
dependiendo de la naturaleza qumica de cada organismo.
Se emplean algunos colorantes como la tinta china, si el glucoclix se deforma, no excluye

partculas y es difcil visualizar la llamada capa mucosa. Se ha visto que las bacterias con
cpsula resisten mejor la accin de las clulas fagocitarias del sistema inmunitario. Como las
capas de polisacrido retienen gran cantidad de agua, se piensa que el glucoclix puede
contribuir a la resistencia y a la desecacin.
Se trata de un colorante aninico, que no penetra en el interior celular. Proporciona una

visin de la forma y el tamao celulares al observarse los microorganismos brillantes sobre
un fondo oscuro (Brock, 2002).
OBJETIVOS GENERALES
Realizar el estudio microscpico de los microorganismos procariotas y eucariotas

adems de su diferenciacin
Seleccionaran las tinciones adecuadas para la observacin de grupos y caractersticas

Determinarn microscpicamente las dimensiones de los microorganismos.
Organizarn e interpretaran los resultados del estudio microscpico de los
microorganismos.
Pre-

MATERIALES Y REACTIVOS
Portaobjetos
Cubreobjetos
Asa
Mechero
Azul de metileno
Solucion salina isotnica
Nigrosina
Procedimiento
Parte A. Preparaciones en fresco

1. En un portaobjetos colocar una gota de la muestra ms una gota de solucin salina
isotnica y luego un cubreobjetos.
2. Observar con objetivo de 10, 20 o 40X.
Parte B. Preparaciones teidas en fresco

1. En un portaobjetos colocar una gota de la muestra ms una gota de solucin salina
isotnica.
2. Agregar una gota de colorante (azul de metileno).
3. Observar a 10, 20 o 40X.
Parte C. Tincin Positiva (Frotis Teido)

1. Poner una gota de agua en el portaobjetos y extender en ella la muestra utilizando el
asa de siembra.
2. Parar el portaobjetos varias veces por encima de la llama del mechero sin permitir que
llegue a hervir, hasta que se seque.
3. Aadir azul de metileno y esperar 2 minutos
4. Lavar con agua
5. Secar
6. Observar primero en el objetivo 40X, luego se aade aceite de inmersin y se observa
con el objetivo 100X.
Parte D. Tincin negativa

1. Colocar una gota de Nigrosina sobre uno de los extremos del portaobjetos
2. Extender la muestra en la gota con el asa de siembra.
3. Realizar un frotis con un segundo portaobjetos se extiende la muestra de modo que
cubra toda la superficie del primero.
4. Secar al aire
5. Observar primero 40X y luego a 100X con aceite de inmersin
Pre-

RESULTADOS
III. Tinciones Diferenciales
ANTECEDENTES
Las tinciones diferenciales se denominan as por que son capaces de diferenciar estructuras
e incluso microorganismos que poseen caractersticas superficiales diferentes.
Tincin de Gram
Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se
utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar
una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram
positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y Bacteria Gram negativa a las que
se visualizan de color rosa.
Los fundamentos de la tcnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las
bacterias Gram positivas y Gram negativas.
La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglucano,
adems de dos clases de cidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y
unido a la membrana plasmtica, se encuentra el cido lipoteicoico, y ms en la superficie, el
cido teicoico que est anclado solamente en el peptidoglucano (tambin conocido como
murena).
Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se
encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior (de composicin distinta a la
interna) por medio de lipoprotenas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una
membrana exterior por lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de protena,
fosfolpido y lipopolisacrido.
Pre-

Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente debido a estas diferencias
constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su
rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor
proporcin que las Gram negativas.
La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a que la membrana
externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos, como por ejemplo la
mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglicano que posee es demasiado delgada
como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se form previamente, y por
lo tanto este complejo se escapa, perdindose la coloracin azul-violcea. Pero por el
contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular ms resistente y con mayor
proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino
que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse el
complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azul-violcea.
El primer paso en cualquier tincin debe ser siempre la fijacin con calor. Posteriormente el
cristal violeta penetra en todas las clulas bacterianas (tanto Gram positivas como Gram
negativas).
El lugol est formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual est
presente para solubilizar el iodo. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en
solucin acuosa con el cristal violeta.
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloracin, ya que en la
misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se
decoloran, mientras que los Gram negativos s lo hacen.
Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin de contraste.
Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica. Despus
de la coloracin de contraste las clulas Gram negativas son rojas, mientras que las Gram
positivas permanecen azules.
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la tcnica. Sirve para hacer una tincin
de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al trmino del protocolo,
las Gram positivas se vern azul-violceas y las Gram negativas, se vern rosas (si no se
hizo la tincin de contraste) o rojas (si se us, por ejemplo, safranina).
Tincin de cido-alcohol resistente
Se basa en que ciertos microorganismos no son desteidos por una mezcla de cido y
alcohol si han sido previamente teidos con fucsina fenicada. Se dice que son
microorganismos cido-alcohol resistentes. Una vez realizada la decoloracin con esta
mezcla se utiliza un colorante de contraste (el Azul de metileno) para poder observar las
clulas sensibles a la decoloracin por cido-alcohol. Son microorganismos cido-alcohol
resistentes las micobacterias, por la especfica composicin de su pared celular, y algunos
actinomicetos, como Nocardia. Algunos microorganismos patgenos son cido-alcohol
resistentes: Mycobacterimum tuberculosis (tuberculosis), M. leprae (lepra).
Las clulas cido-alcohol resistentes permanecen teidas de fucsia, ya que retienen el primer
colorante, mientras que las no resistentes se decoloran con el cido-alcohol y se teirn de
azul con el colorante de contraste.
Pre-

MATERIAL Y REACTIVOS
Mechero
Asa
Portaobjetos Cubreobjetos
Vaso de precipitados
Tripie
Papel filtro
Pipeta Paster
Pipetas de 1 mL graduada
Cultivo bacteriano
Violeta cristal
Yodo-lugol
Etanol al 75 %, etanol al 95 %
acetona o alcohol-acetona
Safranina
Fuscina
Azul de metileno
Mezcla cido-alcohol
Microscopio
Diagrama de Flujo Parte A. Tincin de Gram

Pre-

Depositar la muestra
Fijar el frotis: con un Con el asa tomar contenida en el asa
mechero flamear el asa y un poco de muestra en un portaobjetos.
esperar que se enfre Extender la muestra
Enjuagar al chorro
delgado de la llave, en Cubrir la muestra Esperar a que se
la parte superior del con cristal violeta, seque. Flamear con
portaobjetos durante 1 min el mechero
Colocar alcohol- Poner safranina 1 min,

Poner yodo-lugol acetona 20 seg. enjuagar y dejar secar.
durante 1 min Enjuagar y dejar Observar al microscopio
Enjuagar secar
Parte B. Tincin cido alcohol-resistente
Cubrir con fucsina Calentar la

Fijar el frotis preparacin por 5min
con mechero
Decolorar con
mezcla cido- Lavar con agua el No dejar que
alcohol, 20 seg resto del colorante hierva, aadir ms
fucsina si es
necesario
Teir con azul de

Lavar con agua metileno, 1min. Secar y observar al
Enjuagar con agua microscopio
Pre-

RESULTADOS
Tincin de Gram positiva
Tincin Gram Negativa
Tincin cido-alcohol resistente

Pre-

IV. Utilizacin de colorantes vitales. Identificacin y descripcin de la morfologa de bacterias
esporuladas y capsuladas
ANTECEDENTES
Los procedimientos que ponen de manifiesto diferencias entre las clulas bacterianas o en
partes una clula se conoce como tcnica de coloraciones diferenciales. Son algo mas que
elaboradas que la tcnica simple en la que las clulas se someten a una sola solucin
colorante o reactivo colorante. Las tinciones se combinan qumicamente con el protoplasma
bacteriano; si la clula no ha muerto el proceso termina de hacerlo. El mtodo, por
consiguiente, es bastante drstico y puede producir artificios.
Las tinciones mas frecuente son sales. Las tinciones bsicas consisten en un catin
coloreado unido a un anin incoloro, mientras las cidas constituyen exactamente lo
contrario, unido a dos cationes. Las clulas bacterianas son abundantes en cidos nucleicos,
los cuales portan cargas negativas en formas de fosfatos.
Los colorantes cidos no tien a las clulas bacterias, y por tanto, pueden utilizarse para teir
al fondo con un color de contraste.
Las tinciones bsicas tien uniformemente en las clulas bacterianas, a menos que antes de
destruyan el ARN del citoplasma. Tambin se pueden usar tcnicas de tincin especiales
para flagelos, membranas celulares, paredes celulares, grnulos, nucletidos y esporas.
Tipo de Tincin Descripcin

Las bacterias acidorresistentes son las que retiene la
carbolficsina, aun cuando intente descolorarlas con un mezcla de
Acidorresistente alcohol y cido clorhdrico. Las bacterias acidorresistentes se
tien de color rojo; el resto adquiere el color del colorante de
contraste en este caso el verde o azul.
Este procedimiento consiste en la tincin de fondo con un
colorante cido para dejar las clulas incoloras en contraste.
Negativa Comnmente se utiliza el colorante negro llamado nigrusna. El
mtodo sirve para observar bacterias o estructuras que
difcilmente se tien con las tcnicas directas.
Los flagelos son estructuras demasiado finas para poder ser
visibles en el microscopio de luz. Sin embargo si se tratan con
una suspensin coloidal inestable de sales de cidos tnico para
formar un precipitado denso en la pared celular y en los flagelos,
De los flagelos
se pueden poner de manifiesto su presencia y disposicin en las
clulas. De esta manera el dimetro aparenta que la estructura
aumento de tamao con fuscina bsica los hace visibles en el
microscopio ptico.
La cpsula se pone de manifiesto mediante una coloracin
Cpsula negativa o una modificacin de esta. Uno de los mtodos de
tincin de la cpsula incluye el tratamiento de las bacterias con
Pre-

un solucin caliente de cristal violeta seguido por un lavado con una
solucin de sulfato de cobre. El CuSO4 tambin imparte color al
fondo y esto resulta en que la clula y el fondo aparezcan teido en
color azul oscuro mientras la cpsula aparece de color azul plido.
Los ncleos se pueden teir por la tincin de Feulgen la cual es
Ncleo
especfica para el ADN.
Las esporas se observan de la manera mas simple como cuerpos
refringentes intracelulares en suspensiones de bacterias sin teir,
Esporas la parte de las esporas relativamente impermeable, las esporas
comnmente se tien con verde de malaquita y carbolfucsina o
carbolfucsina
Una caracterstica taxonmica importante de las bacteria es su
respuesta a la tincin a de Gram esta caracterstica parece ser
fundamental, reaccin a la tincin se correlaciona a con muchas
otras propiedades morfolgicas en maneras relacionadas
filogenticamente. Microorganismo potencialmente grampositivo
puede verse como tal cuando concurren un conjunto de particular
de condiciones ambientales en un cultivo joven. El procedimiento
para tincin de Gram se inicia con la aplicacin de un colorante
bsico el cristal de violeta. Luego se aplica una solucin de yodo
en este momento todas las bacterias de tien de azul.
Continuacin las clulas se tratan con alcohol las clulas
grampsitiva contienen el cristal violeta-yodo y permanecen de
color azul; en cambio las gramnegativa se descoloran
completamente por el alcohol. Por ultimo se aplican un colorante
de contraste safranina, que es un colorante rojo. De esta manera,
las clulas gramnegativas, previamente descoloradas, toman el
Gram colorante de contraste y las clulas grampositivas ahora
aparecen prpura.
La base de la reaccin diferencial de Gram es la estructura de la
pared celular. Esta tcnica diferencial es una de las de uso ms
comn en microbiologa. El frote bacteriano teido se somete a
las soluciones siguientes en el orden en que se indica: cristal
violeta, alcohol y safranina o alguna otra solucin de contraste
conveniente.
Las bacterias gramnegativas contienen un gran porcentaje mas
alto de lpidos que de las bacterias grampositivas. Las paredes
celulares de la bacterias gramnegativas son tambin mas
delgadas que las grampositivas con alcohol extrae lpidos con lo
cual se aumenta la porosidad o permeabilidad de la pared celular
gramnegativa. As el complejo cristal violeta-yodo (CV-I) puede
extraerse en los organismos gramnegativos y de esta manera se
destien las paredes celulares de las bacterias grampositivas, por
su composicin diferente (bajo contenido lpido) se deshidratan
Pre-

alcohol y se logra extraer el complejo (CV-I).
En las bacterias (CV-I) queda retenido en la pared despus del
tratamiento con etanol, la cual se supone se supone causa una
disminucin de en el dimetro de los poros glucopptido o
pptidoglicano de la pared celular. Las bacterias gramnegativas
tienen una cantidad mucho menor de ppidoglicano con ligaduras
cruzadas menos extensas que en las paredes de las bacterias
grampositivas.
OBJETIVO GENERAL
Seleccionar las tinciones adecuadas para la observacin de grupos y caractersticas

Determinar la utilizacin de colorantes vitales.

Identificar y describir a microorganismos por su morfologa.
Determinar y caracterizar las bacterias esporuladas y capsuladas.
Pipeta de 1 ml.
Tubo de ensayo.
Placa de petri.
Portaobjetos
Mechero
Equipo de tincin
Estufa
Microscopio
Colorante tinta china
Solucin verde de malaquita (5%)
Solucin de safranina (0.5%)
Solucin salina estril
Medio de cultivo para el microorganismo.
Suspensin del microorganismo.
Azul de metileno
Pre-

METODOLOGA
Parte A. Tincin de Esporas
1. Preparar frotis bacterianos.

2. Teir con verde de malaquita. Colocar un pedacito de papel filtro encima de la muestra
sobre el porta.
3. Aadir el colorante hasta empapar bien el papel filtro. De esta manera se evitara que el
colorante salpique y manche toda la zona de trabajo. Con unas pinzas colocar la muestra
encima de la llama del mechero de forma que el colorante humee durante 5min.
4. Evitar que la muestra hierva, aadir ms colorante si este se evapora: es importante que
la muestra no se seque.
5. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
6. Teir con safranina (1min).
7. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
8. Secar la preparacin.
9. Observar la preparacin al microscopio.
Parte B. Tincin negativa de cpsulas
1. Seleccionar portaobjetos que estn perfectamente limpios.

2. Tomar unas pocas gotas de los medios de cultivo y depositarlas en sendos portaobjetos.
3. Aadir una gota de tinta china a cada preparacin y mezclar bien.
4. Colocar suavemente un cubreobjetos sobre cada suspensin de clulas con tinta china.
Evitar que se formen burbujas.
5. Colocar los portaobjetos con los cubreobjetos entre dos papeles absorbentes. Presionar
con los dedos sobre el portaobjetos. El exceso de suspensin ser absorbido por los
papeles.
6. Tirar el papel de un contenedor para Material contaminado y lavarse las manos con
jabn desinfectante.
7. Examinar al microscopio; trabajando con el diafragma del condensador cerrado para
aumentar el contraste de las clulas.
Pre-

Diagrama de Flujo
Parte A. Tincin de Esporas
Parte B. Tincin negativa de cpsulas

Pre-

RESULTADOS
DISCUSIN DE RESULTADOS
CONCLUSIN
BIBLIOGRAFA
Ramos, E. C. 2003. Manual del laboratorio de instrumentacin bsica. Universidad

Autnoma de Veracruz. Facultad de Bioanlisis.
Pelczar, M. 1982. Microbiologa. Cuarta edicin. McGraw Hill, Mxico, D.F.: 46-47.
Brock T. 2002. Biologa de los Microorganismos. Editorial Omega.
Olivas, Evangelina; Alarcn, Luis. 2004. Manual de prcticas de microbiologa Bsica y

Microbiologa de Alimentos. Universidad Autnoma de Ciudad Jurez. Mxico.
Fernndez Escartn, Eduardo. 2000. Microbiologa e Inocuidad de los alimentos. 1a ed.,

Universidad Autnoma de Quertaro. Mxico.
http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Gram
http://microral.wikispaces.com/18.+Bacterias+acido-alcohol+resistentes.
http://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/general.php?Mostrar=baar
Pre-

El manejo de los cultivos puros 3 8 1a8

Pre-

Contenido Pgina
I. INTRODUCCIN 1
III. OBJETIVO 6
IV. METODOLOGIA 7
IV. 1. Materiales. 7
IV. 2. Requerimientos de seguridad. 7
IV. 3. Disposicin de residuos 7
V. RESULTADOS. 7
VI. DISCUSION. 8
Pre-

I INTRODUCCION.
Un cultivo puro esta formado de poblaciones de clulas derivadas de una sola clula. El
cultivo puro representa las condiciones artificiales para el desarrollo de las bacterias y otros
microorganismos y las condiciones impuestas a los microorganismos mediante el manejo de
laboratorio. Existen diferentes tcnicas por medio de las cuales las diferentes especies en
una muestra natural pueden ser aisladas y desarrollarse como cultivo puro.
II. ANTECEDENTES
Esterilizacin significa dejar libre de microorganismos y es un proceso til para desarrollar

slo las poblaciones de microorganismos que se desean.
Los procesos que se utilizan para esterilizar son los que se ilustran en el siguiente diagrama:
Pre-

Para comprobar que el proceso de esterilizacin se efecto de manera correcta, se recurre a
uso de Indicadores biolgicos como el Bacillus Estereotehermophylus o se incuban cajas
petri con medio de cultivo para mtodos estndar a 37C por 24-48hr despus de su
esterilizacin.
Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar
su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material
alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de
los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado ms de 10.000 medios de cultivo
diferentes.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir
una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno
adecuada, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe
contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo
microorganismo contaminante.
La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares en
composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos
medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y Peptona a la que se aadirn otros
ingredientes.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de cultivo.
Se lica completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40
grados. Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no
es atacado por aquellas que crecen en l.
La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes
bacterias provocan su licuacin.
En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento
como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se
adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para
detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El
suero y la sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los microorganismos
menos resistentes.
Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la
formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el
Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH bsico y amarillo en pH cido. La
Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayora de las
bacterias Gram-positivas).
Pre-

III. CONOCIMIENTOS PREVIOS.
1. Cmo debemos de preparar un medio de cultivo?

2. Cules son los principales componentes de los medios de cultivo?
3. Qu procedimientos de esterilizacin debo de emplear para esterilizar un
medio de cultivo?.
4. Cules son las formas de cultivar para lograr un buen aislamiento y obtener un
cultivo puro?
IV. OBJETIVO GENERAL
Realizar una buena preparacin de material microbiolgico, as como elaboracin de

cultivos puros.
IV.1 OBJETIVOS PARTICULARES
Cultivaran y conservaran adecuadamente cepas puras de bacterias y hongos.

Prepararan material de vidrio y medios de cultivos de uso comn en el laboratorio de
microbiologa.
Seleccionaran adecuadamente los medios de cultivo y mtodos de esterilizacin para
algunos de los casos ms frecuentes en el laboratorio de microbiologa.
incubacin a las bacterias aerobias, anaerobias y hongos.
Organizaran e interpretaran las caractersticas morfolgicas macroscpicas y
microscpicas de diversos microorganismos.
Pre-

V. MATERIALES Y REACTIVOS
Autoclave u olla de presin

Agar para mtodos estndar
Cajas petri de vidrio
Matraces Erlenmeyer
Pipetas
Mecheros
Esptulas
Algodn
Papel de estraza
VI. METODOLOGA
Parte A. Esterilizacin del Material en autoclave
1. Preparacin del material de vidrio a esterilizar.

2. Envolver todo material en papel de estraza.
3. Antes de envolver las pipetas, colocarles una pequea torunda de algodn en la parte
superior de estas.
4. Los tubos de ensaye con rosco, no necesitan ser envueltos, slo hay que cerrarlos sin
apretar.
5. El material no debe de tocar el agua, ni estar cerca de las paredes de la autoclave o la
olla de presin.
Parte B. Esterilizacin de material en olla de presin
1. Colocar agua hasta poco antes de la rejilla que se encuentra hasta el fondo.
2. Colocar el material a esterilizar y los medios de cultivo preparados, evitando que el papel
se moje, que el material toque las paredes de la olla, y que el material est muy
encimado.
3. Cuando est listo todo el material, se coloca la tapadera y se espera a que salga en
forma constante vapor por la vlvula, cuando esto suceda, colocar la perilla que cubre la
vlvula y esperar a que llegue a una presin de 15lb.
4. Una ves que llegue a la presin de 15lb, se debe mantener as por 15min.
5. Cuando transcurra el tiempo indicado, se debe esperar que la olla enfrie y que el material
est a temperatura ambiente.
6. Llenar las cajas petri con aprox. 20 ml de agar, en un ambiente estril.
7. Almacenar el material, en caso de no usarse de inmediato.
8. Para verificar que el material y los medios de cultivo estn estriles, se puede utilizar un
indicador biolgico o incubar una porcin de los medios de cultivo por 24hr.
9. Observar si existe crecimiento microbiano.
Pre-

Parte C. Preparacin del medio de cultivo
1. Pesar en un matraz Erlenmeyer la cantidad de agar que seala el producto, de acuerdo a

la cantidad de medio que se requiera.
2. Disolver con agua destilada.
3. Colocar en la boca del matraz una torunda de algodn y un capuchn de papel de
estraza.
4. Calentar hasta ebullicin.
5. Meter a la autoclave u olla de presin.
Diagrama de Flujo
Pre-

VII. RESULTADOS
Seleccin de medios de cultivo
Antecedentes
Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones adecuadas y en
condiciones fsicas ptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Estos medios
son esenciales en el Laboratorio de Microbiologa por lo que un control en su fabricacin,
preparacin, conservacin y uso, asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los
resultados obtenidos. En los laboratorios de microbiologa se utilizan diferentes tipos de
medios de cultivo que pueden ser preparados en forma lquida o en forma slida.
Usualmente para preparar un medio slido se parte de un medio lquido al que se le aade
un agente solidificante como el agar, la gelatina o la slicagel. Los medios de cultivo se
pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus constituyentes en:
a) Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias complejas de origen animal o
vegetal, las que son usualmente complementadas por la adicin de minerales y otras
sustancias. En ellos no se conocen todos los componentes ni las cantidades exactas
presentes de cada uno de ellos.
b) Medios definidos o sintticos: son los medios que tienen una composicin qumica
definida cuali y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigacin.
De acuerdo al uso del medio de cultivo, stos se clasifican en:
Pre-

c) Medios de enriquecimiento: son medios lquidos que favorecen el crecimiento de un tipo
de microorganismo en particular. Permiten aumentar el nmero de microorganismos de
ese tipo. Usualmente contienen una o ms sustancias inhibidoras del crecimiento de los
microorganismos con excepcin de los que se quieren cultivar.
d) Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios
slidos y estn diseados para el aislamiento de microorganismos especficos.
e) Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos derivados de
la actividad microbiana de los microorganismos. No contienen ningn tipo de sustancia
con actividad antimicrobiana. Permiten revelar caractersticas fisiolgicas de los
microorganismos.
Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus
constituyentes bsicos o por simple rehidratacin de productos asequibles comercialmente
(medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo
deshidratados porque, adems de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad
de obtener resultados reproducibles.
Recomendaciones
Para su preparacin se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:

1. Prepararlos slo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores que
suministren productos de calidad.
2. Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiolgica y fisicoqumica
adecuada.
3. Utilizar material de vidrio bien lavado y enjuagado con agua destilada o desmineralizada.
4. Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilizacin.
5. Nunca se deben exceder las condiciones sealadas por el fabricante.
Material y Reactivo
Cajas petri
Agar selectivo (dependiendo del MO que se desee aislar)
Mecheros
Olla de presin
Asa para sembrar
Metodologa
Parte A. Seleccin del microorganismo
1. Seleccionar el Microorganismo que se desea aislar.

2. Investigar las necesidades y requerimientos para su desarrollo, as como el medio de
cultivo en el que se da dicho desarrollo.
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3. Preparar el material y el medio de cultivo que se utilizar.
4. Esterilizar todo el material a usar.
5. Llenar cajas petri con 20ml de medio de cultivo en ambiente estril.
6. Aislar el microorganismo de su habitad natural.
7. Con un asa de platino y en un lugar estril inocular el microorganismo en las cajas petri
estrles.
8. Incubar en el ambiente requerido por el microorgnismo.
Diagrama de Flujo
RESULTADOS
Pre-

VERIFICACIN DE LA EFICACIA DE ESTERILIZACIN: RECUENTO DE
MICROORGANISMOS
ANTECEDENTES
El crecimiento de una poblacin bacteriana puede ser entendido desde diferentes

perspectivas y de acuerdo a stas se puede llegar a determinar la medida del crecimiento
mediante diversas metodologas, que se dividen en dos principalmente:
Mtodos directos
Recuento microscpico
Recuento electrnico
Mtodos indirectos
Medida de la biomasa
Determinacin de cidos nuclecos
Determinacin de nitrgeno
Incorporacin de precursores radiactivos
Medida de consumo de nutrientes o de produccin de algn metabolito por
unidad de tiempo
Dispersin de la luz, turbidimetra.
Medida de consumo de nutrientes o produccin de algn metabolito por unidad de tiempo
Ejemplo: Consumo de oxgeno (QO2) y consumo de carbnico (QCO2), determinados por el

respirmetro de Warburg. Produccin de cidos.
El respirometro de Warburg (1926) usado extensivamente por Don Bloodgood en la
universidad de Purdue y por H. Huekelekian en la universidad de Rutgers fu una
modificacin del " manmetro de sangre-gas" desarrollado por Haldane y Barcroft (1902). El
trabajo pionero de Sawyer, de Nichols y de Rohlich (1939) en el estudio y el desarrollo de las
curvas de la utilizacin del oxgeno en lodos activados, fue hecho usando los dispositivos
manomtricos que ellos desarrollaron para satisfacer su necesidad de utilizar muestras ms
grandes y de sistemas mas hermticos - Estos sistemas, sin embargo, requeran la adicin
manual de aire atmosfrico para suplir el oxgeno. Analistas expertos eran necesarios para
funcionar y vigilar visualmente las lecturas del manmetro. La interpretacin era aburrida y
dispendiosa ya que no existan aparatos automatizados para la manipulacin de los datos.
John W. Clark en la universidad de estado de nuevo Mxico a fines de los aos 50 desarroll
y report un dispositivo en el cual el oxgeno fue generado por una pila electroltica, que
tambin funcion como un manmetro, asociado a un reactor cerrado. Cuando el dispositivo
es accionado por la reduccin de la presin en el recipiente de la prueba causado por el
retiro qumico del CO2 generado por la respiracin bacteriana, el oxgeno fue producido por
Pre-

una corriente controlada de corriente continua. El valor integrado de la corriente proporcion
una indicacin del oxgeno consumido. Una de las primeras aplicaciones de aparato Voith-
Sapromat (desarrollado por Popel en 1964) fue un procedimiento manual para evaluar el
efecto de varios deshechos en degradacin de la peptona. Liebmann y Offhaus tambin
colaboraron en procedimientos para determinar la DBO5 y la toxicidad de algunos elementos
en el agua.
Figura 3. Botella respiromtrica
El Mtodo Respiromtrico, para la determinacin de la DBO5 se basa en medir el consumo

de oxgeno, o la produccin de CO2, en una Botella Respiromtrica. Este objetivo se logra
entre otras formas (Mtodo Manomtrico) midiendo la variacin de la presin en la botella,
mediante un manmetro lo suficientemente sensible. Otros mtodos respiromtricos
propiamente dichos miden la produccin de CO2 u otros gases como Metano, Anhdrido
Sulfhdrico, etc. dentro de la botella.
En el Mtodo Clsico, para la determinacin de la DBO5, se calcula la diferencia entre el
Oxgeno Disuelto en la muestra o en una dilucin de la misma, entre el da 0 y el da 5. Este
mtodo tiene muchas limitaciones, siendo una de las principales la pequea cantidad de
oxgeno disponible en la muestra. Usualmente unos 10 mg/lt a nivel del mar, y menos de 7
mg/Lt a nivel de Bogot (2540 m.s.n.m.). Si tenemos en cuenta que la muestra deber
terminar la prueba con al menos 1 mg/Lt, (algunas normas especifican terminar con al menos
2 mg/Lt) se observa que el oxgeno total disponible para la prueba ser alrededor de 5 mg/Lt.
En el supuesto caso de que se trabajase con Botellas de 0.5 Lt de capacidad, la cantidad
absoluta de oxgeno disponible sera de tan solo 2.5 mg. En la mayora de los Laboratorios
usualmente se trabaja con Botellas de 300 ml., lo cual disminuye aun ms la cantidad de
oxgeno disponible para la prueba. Esta pequea cantidad a determinar hace que pequeos
errores en la manipulacin de la prueba produzcan grandes diferencias (errores) en el
resultado.
Pre-

En el mtodo Respiromtrico, trabajando con botellas de 1 lt de capacidad, llenas con medio
litro de muestra o dilucin de muestra, se cuenta hasta con 125 mg de Oxgeno, contenidos
en el aire presente en la cmara superior de la botella. Y se puede contar aun con mayor
cantidad de oxgeno en caso de trabajar con volmenes inferiores de muestra. En este caso,
el oxgeno disuelto, fuere cual fuere su contenido inicial en la muestra (exceptuando
muestras altamente sobresaturadas) no tiene casi incidencia en el resultado. Por lo general
esta por debajo de 2.5 mg frente a los 125 mg presentes en la cmara superior. Esto es un
error mximo del 2 %.
Absorcin del CO2
En el mtodo llamado mtodo manomtrico, se mide el vaco creado por el consumo de

oxgeno causado por la muestra.
Para que el mtodo basado en la medicin manomtrica del vaco causado en la botella
funcione adecuadamente es necesario absorber el CO2 formado de alguna manera. De lo
contrario no habra cambio de presin en las botellas ya que el volmen de CO 2 producido
podra ser igual o casi igual al volmen de Oxgeno consumido.
La absorcin del CO2 puede hacerse de varias maneras. 1. Adecuando el poder buffer de la
solucin en ensayo para absorber la totalidad del CO2, en forma de Bicarbonato disuelto en
el lquido y 2. Absorbiendo el CO2 mediante algn hidrxido alcalino en un recipiente
apropiado en contacto con la fase gaseosa de la botella.
En el presente artculo analizaremos ambas opciones aunque en principio consideramos que
adecuar el poder buffer de la solucin de ensayo es especialmente adecuado para la
determinacin de la Demanda Bioqumica de Oxgeno en 5 das en aguas y el mtodo de
absorber el CO2 en un recipiente con reactivos especiales insertos en la botella
respiromtrica es mas adecuado para la determinacin de la respiracin en muestras slidas
como suelos, deshechos orgnicos, lodos secos etc.
Capacidad de absorcin de CO2 del sistema difosfato-monofosfato
La cantidad de CO2 producida en el mtodo respiromtrico, al igual que la cantidad de

oxgeno consumida, es relativamente ms grande que la producida en el mtodo clsico.
Esto requiere entonces de una adecuacin del poder buffer de la solucin de ensayo. Para
adecuar el poder buffer de la solucin de ensayo a las nuevas condiciones es necesario
conocer la capacidad de absorcin del CO2 del sistema Difosfato-Monofosfato dentro del
rango de pH permisible o compatible con un crecimiento adecuado de los microorganismos
presentes en la muestra en ensayo.
Como base terica para la absorcin del CO2 dentro del sistema tenemos la siguiente
ecuacin:
Na2HPO4 + CO2 + H2O -------------> NaHCO3 + NaH2PO4 (1)
De acuerdo con la anterior reaccin 142 mg de Fosfato Disdico anhidro absorberan 44 mg

de CO2.
Pre-

La anterior reaccin es reversible y a medida que procede hacia la derecha se va reduciendo
el pH del medio de tal manera que esta misma condicin paraliza el desarrollo de la reaccin
en un punto intermedio de la transformacin del Fosfato Disdico en Fosfato Monosdico.
Creemos que no todo el Fosfato Disdico logra transformase en Fosfato Monosdico. Para
saber que tanto CO2 logra capturar una solucin de Fosfato Disdico se llev a cabo el
siguiente experimento:
Se prepar una solucin de Fosfato Monosdico (NaH 2PO4.H2O) de 2 gr/Lt. Se titul con
NaOH 0.1 N hasta viraje incipiente de la Fenolftaleina (Aproximadamente pH = 8.5-9.0). En
este punto la solucin se satur con CO2 permitiendo as que se desarrolle la reaccin (1) en
la mayor extensin posible. Acto seguido se expuls el CO2 libre mediante agitacin y barrido
con aire. Despus se titul en reversa con NaOH 0.1 N nuevamente hasta viraje incipiente de
la fenolftaleina.
Se considera que la cantidad de CO2 fijado por el sistema es directamente proporcional a la
cantidad de NaOH consumida en la segunda titulacin.
Los datos del ensayo fueron los siguientes:
Titulacin del Fosfato Monosdico

Alcuota de solucin de Fosfato Monosdico = 25 ml
Cantidad de NaOH 0.1 N usado en la titulacin inicial = 3.65 ml Esta cantidad coincide casi
exactamente con la cantidad terica necesaria para la transformacin de todo el Fosfato
Monosdico en Fosfato Disdico segn la ecuacin siguiente:
NaH2PO4 + NaOH -------------------> Na2HPO4 + H2O
Fijacin de CO2
Alcuota de solucin de Fosfato Monosdico = 50 ml
Cantidad de NaOH 0.1 N usado en la titulacin inicial = 7.2 ml
Saturacin con CO2 y eliminacin del Sobrante con Aire.
Titulacin en reversa con NaOH 0.1 N = 4.5 ml
De acuerdo con la ecuacin:
NaOH + CO2 --------> NaHCO3
40 gr de NaOH neutralizan 44 gr de CO2
Entonces 4.5 ml de NaOH 0.1 N neutralizarn 4.5 x 4 x 44/40 = 19.8 mg de CO 2

Pre-

Lo cual quiere decir que los 100 mg de Fosfato Monosdico (50 ml de solucin de
NaH2PO4*H2O de 2 gr/lt) utilizados, equivalentes a 87 mg de Fosfato Monosdico Anhidro y
transformados en 102.9 mg de Fosfato Disdico anhidro tienen capacidad para absorber 19.8
mg de CO2 transformndolo en Bicarbonato de Sodio.
Al comparar el resultado terico segn la ecuacin (1) con la cantidad resultante de este
ltimo ensayo se hace evidente que no todo el Fosfato disdico utilizado inicialmente logra
transformarse en Fosfato Monosdico. En consecuencia, la cantidad de Fosfato Disdico que
se debe utilizar como Buffer en la prueba respiromtrica deber ser de como mnimo de
102.9 mg por cada 19.8 mg de CO2.
Absorcion del CO2 en recipiente aparte inserto en la botella con hidrxido de sodio
Esta forma de absorber los gases tambin funciona adecuadamente y consiste en colocar en
la cmara de aire encima del lquido, un recipiente perforado, en el cual se coloca hidrxido
de sodio como material absorbente para el CO2. Este material absorbe rpidamente el CO2
producido. Se ha observado que la botella requiere algo de agitacin para la adecuada y
rpida absorcin del CO2. De lo contrario la difusin del CO2 desde la parte inferior de la
botella hacia el recipiente de absorcin puede resultar demasiado lenta. Para la Absorcin se
debe tener en cuenta la siguiente ecuacin:
2 NaOH + CO2 -----------> Na2CO3 + H2O
As que 80 gr de NaOH absorbern 44 gr de CO2

Para una botella respiromtrica de 1105 ml de capacidad, llena de CO 2 puro a 20 C, se
requieren 1.105x0.8878x80/44 = 1.784 gr de NaOH y para una Botella normal con medio litro
de muestra, suponiendo que se agotara completamente el oxgeno de la cmara y que se
generan 125 x 44/32 = 171.8 mg de CO2 se requieren
171.8 x 80/44 = 312 mg de NaOH. En la prctica se recomienda colocar 1 gr de NaOH.
Dispersin de Luz
Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partcula en suspensin, parte de la luz
es reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida. La nefelometra
mide la luz dispersada por una solucin de partculas. La turbidimetra mide la luz dispersada
como un decrecimiento de la luz transmitida a travs de la solucin. En relacin a la longitud
de onda y al tamao de la partcula pueden existir tres tipos de dispersin.
Los mtodos de dispersin de la luz son las tcnicas ms utilizadas para monitorear el
crecimiento de los cultivos bacterianos. Son muy tiles y poderosos pero pueden llevar a
resultados errneos. Principalmente, dan informacin sobre el peso seco (contenido
macromolecular).
Turbidimetra
La turbidimetra mide la reduccin de la transmisin de luz debido a partculas de una

suspensin y cuantifica la luz residual transmitida.
Pre-

Estudios tericos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos
de bacterias, independientemente del tamao celular, tienen casi la misma absorbancia por
unidad de concentracin de peso seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la
absorbancia es directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamao
celular del microorganismo. Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por
partcula o por UFC (Unidad Formadora de Colonia) cuando los tamaos de las clulas
bacterianas son diferentes. Por esta razn, para estimar el nmero de microorganismos
totales o el nmero de microorganismos viables de una suspensin bacteriana debe
realizarse una "curva de calibracin" con cada tipo de microorganismo, slo de esta forma es
posible relacionar Absorbancia (Densidad ptica) con el nmero de microorganismos totales
o con UFC.
Figura 4. Absorbancia en funcin del Peso Seco.
Absorbancia = K x Peso Seco
K: constante que vara con la longitud de onda utilizada y representa la inversa del peso seco
del microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor de la absorbancia
(1/W 0).
Peso seco: Concentracin celular bacteriana expresada en unidades de peso seco (g/ml-
mg/ml).
Pre-

Figura 5. Absorbancia en funcin del Peso Seco.
La relacin directa entre la absorbancia y el peso seco slo se aplica para suspensiones
diluidas de bacterias. Estas suspensiones no deben tener una absorbancia mayor a 0.3, ya
que valores mayores producen desviaciones de la ley de Beer. Sin embargo, el
inconveniente de utilizar suspensiones diluidas puede involucrar un mayor error de pipeteo y
menor sensibilidad por el bajo nivel de absorcin.
Figura 6. Absorbancia en funcin del Nmero de Microorganismos Totales.
En estos grficos se puede apreciar que suspensiones diluidas de dos microorganismos

diferentes con igual peso seco tienen la misma absorbancia, mientras que para el mismo
nmero de microorganismos totales la absorbancia de cada suspensin es distinta.
Pre-

CULTIVO PURO DE MICROORGANISMOS
ANTECEDENTES
Luego que se ha preparado un medio de cultivo puede ser inoculado, e incubado, cubriendo
las condiciones adecuadas para favorecer el crecimiento de un cultivo axnico o puro, es
decir, de un cultivo que contiene slo un tipo de microorganismos, para obtener y mantener
un cultivo axnico o puro es esencial la evitar la entrada en el de otros microorganismos, de
esta manera se han diseado tcnicas microbiolgicas para evitarlos. Un mtodo importante
para obtener y asegurar la pureza de un cultivo es el uso de medios slidos en placas de
Petri. Los medios de cultivo se preparan con frecuencia en forma semislida o slida
mediante la adicin al medio lquido de un agente solidificante, como agar agar. Los medios
slidos aseguran que las clulas se inmovilizan, y les permiten crecer y formar masas
aisladas visibles que son llamadas colonias, estas pueden ser de forma y tamao variable
dependiendo del organismo, las condiciones del cultivo y el suministro de nutrientes y de
otros parmetros fisiolgicos. Algunas bacterias pueden producir pigmentos que dan color a
las colonias, y hacen fcil su distincin, la observacin de las colonias permiten reconocer la
pureza del cultivo, las placas que contengan ms de un tipo de colonia no fueron sembradas
con un cultivo axnico o puro, las placas Petri se usan como un criterio para establecer la
pureza en los cultivos de microorganismos.
Tcnicas de inoculacin para la obtencin de cultivos puros
Los microorganismos crecen en poblaciones mixtas y complejas que contienen varias

especies. Esto presenta un problema pues no se puede estudiar adecuadamente un nico
tipo de microorganismo en un medio mixto. Se necesita un cultivo puro, es decir, una
poblacin de clulas que procede de una nica clula, para caracterizar una especie
individual. Por esta razn es imprescindible recurrir a mtodos de laboratorio que permitan y
aseguren la obtencin de cultivos axnicos o puros.
Tcnica asptica
Puesto que los microorganismos son ubicuos, los medios de cultivo deben ser esterilizados
antes de usarse. Una vez preparado un medio de cultivo estril, se puede inocular un cultivo
puro y cultivarlo nuevamente. Esto requiere el uso de la tcnica asptica. Esta tcnica
consiste en una serie de procedimientos que evitan la contaminacin durante la manipulacin
de los cultivos y de los medios de cultivo estriles. Cuando las placas o tubos se abren
deben manejarse de tal modo que los contaminantes del aire no penetren. La transferencia
asptica de un cultivo desde un tubo con medio a otro, se realiza habitualmente con el asa o
aguja de siembra previamente esterilizada a la llama por incandescencia. Los cultivos en los
que ha habido crecimiento se pueden transferir luego a la superficie de placas con agar,
donde se desarrollaran colonias. La toma y resiembra por extensin de una colonia aislada
Pre-

es un mtodo idneo para obtener cultivos axnicos o puros a partir de mezclas complejas
que contienen muchos microorganismos diferentes.
Siembra en profundidad
Esto puede emplearse tanto con bacterias y hongos, ya que puede generar colonias
aisladas. La muestra original se diluye varias veces para reducir la poblacin microbiana lo
suficiente, con el fin de obtener colonias separadas cuando se siembren, en seguida se
mezclan volmenes pequeos de varias muestras diluidas con agar lquido, enfriado hasta
aproximadamente 45 centgrados, la mezcla se vierte en seguida en placas de cultivo estril.
La mayora de las bacterias y hongos no se destruye con una exposicin breve al agar
caliente. Se deja solidificar el agar, cada clula se fija a un lugar y se forma una colonia
individual. El nmero total de colonias equivale al nmero de microorganismos viables en la
muestra diluida. Las colonias que crecen en la superficie pueden usarse para inocular un
medio fresco, es decir, puede recurrirse a la resiembra para la preparacin de cultivos puros.
Siembra en placa por extensin y en estras
Si se extiende una mezcla de clulas en la superficie de una placa con agar, de forma que
se busque que cada clula crezca formando una colonia independiente, es decir, una
formacin o agrupacin microscpicamente visible de microorganismos en un medio slido,
cada colonia representa un cultivo puro. La siembra por extensin es una forma directa,
adems de fcil de conseguir este resultado. Se coloca un volumen pequeo de una mezcla
microbiana diluida conteniendo alrededor de 100 y 200 clulas, o menos, al centro de una
placa de agar y se extiende uniformemente sobre la superficie con una varilla doblada de
vidrio estril. Las clulas dispersadas desarrollan colonias aisladas.
Las colonias puras tambin se pueden obtener mediante siembra en estras. Se pasa la
mezcla microbiana a un extremo de la placa de agar con un asa de inoculacin o un hisopo y
se extiende formando estras sobre la superficie. En algn punto de este procedimiento,
algunas clulas individuales se desprenden del asa al frotarlas sobre la superficie y
desarrollan colonias separadas. Un buen aislamiento depende de la separacin adecuada de
las clulas individuales.
OBJETIVO GENERAL
Realizar y mantener cultivos puros de un microorganismo aislado.
Cultivaran y conservaran adecuadamente cepas puras de bacterias.

incubacin a las bacterias aerobias y anaerobias.
Pre-

MATERIAL Y REACTIVO
Autoclave u olla de presin

Agar para mtodos estndar
Cajas petri de vidrio
Matraces Erlenmeyer
Mecheros
Esptulas
Algodn
Papel de estraza
METODOLOGA
Parte A. Cultivo Puro
1. Preparar el volumen de Agar necesario como se indica en el frasco

2. Calentar el agar hasta que hierva, esterilizar por 15 minutos a 121 C y 15 libras
3. Dejar enfriar un poco el agar y verter en la caja Petri, estando en la zona estril.
4. Esterilizar el asa de inoculacin en la flama del mechero
5. Acercar el cultivo previo o la mezcla a la zona estril, cuidar de no contaminar
6. Tomar un inoculo con el asa esterilizada
7. Colocar la mezcla microbiana en un extremo de la caja Petri y extender sobre la
superficie formando estras abiertas
8. Incubar durante 24 horas a 37 C, observar la formacin de colonias independientes
Pre-

RESULTADOS
Pre-

CONSERVACIN DE CULTIVOS PUROS
ANTECEDENTES
EI xito en la preservacin de los cultivos microbianos es esencial para las actividades de

investigacin o industriales basadas en la actuaci6n de estos microorganismos. Las cepas
valiosas se tienen que conservar durante largos periodos de tiempo libres de cambios
fenotpicos adversos.
Adems, y tomando como ejemplo los procesos de elaboracin de alimentos fermentados
donde participan cultivos microbianos, nos encontramos con que el xito de la produccin
depende principalmente y directamente de las tcnicas de procesamiento utilizadas, pero lo
que permite estandarizar y mantener una calidad uniforme del producto final es en una gran
parte la correcta selecci6n, conservacin, manipulacin y resiembra o propagacin de los
cultivos.
La elecci6n del mtodo de conservaci6n utilizado debe permitir mantener las caractersticas
del microorganismo por las cuales fue seleccionado.
En la industria alimentaria los cultivos microbianos se guardan en pequeas cantidades
conocidas como Gu/tivQS de reserva. Cuando se reactivan para su utilizacin industrial, se
tienen que utilizar sistemas de siembra a gran escala con el objetivo de obtener el volumen
necesario para inocular los fermentadores de produccin.
Un cultivo de aplicaci6n industrial tiene que reunir unas determinadas caractersticas:
Contener el mximo nmero de clulas viables.

Estar libre de contaminantes.
Ser activo en las condiciones de procesamiento.
Par esta razn el mantenimiento de cultivos es extremadamente importante. No existe un
mtodo universal para mantener los cultivos de microorganismos.
La selecci6n del mtodo tiene que basarse en la naturaleza del cultivo y en las ventajas e
inconvenientes del mtodo escogido. Si el microorganismo aun no se conoce del todo es
aconsejable utilizar varios mtodos de conservaci6n.
Los cultivos de microorganismos se siembran en medios estriles y en condiciones de
asepsia, y se mantienen activos aplicando alguno de los siguientes mtodos:
1. Reduciendo o controlando su actividad metablica a travs de la refrigeracin. Este
mtodo solo es aplicable durante periodos cortos de almacenaje (por ejemplo en
medios lquidos o tubos inclinados de Agar nutritivo).
2. Conservacin mediante
Congelacin
Deshidrataci6n
Normalmente se concentran o se separan de los productos residuales de su metabolismo, a
continuaci6n se resuspenden en medio estril y se procede a la etapa final de conservaci6n
por alguno de los dos mtodos mencionados.
Este sistema permite mantener los cultivos durante largos periodos de tiempo y la viabilidad
de los cultivos conservados depende de:
Pre-

1. EI medio de cultivo base.
2. EI mtodo de concentracin.
3. La rpida eliminaci6n de metabolitos.
4. La naturaleza del medio de suspensi6n.
5. Las condiciones de deshidrataci6n 0 congelaci6n.
6. La presencia de agentes crioprotectores (en la congelaci6n).
7. La velocidad de descongelaci6n (en el caso de cultivos congelados).
Conservacin en refrigeracin
EI objetivo general de la refrigeraci6n es incrementar la vida til de los cultivos, y en

consecuencia incrementar sus posibilidades de conservacin.
Generalmente hace falta hacer resiembras en medio fresco a intervalos regulares. Es
un procedimiento laborioso y que consume mucho tiempo. El intervalo entre las
transferencias depende de la temperatura y la humedad de almacenamiento. Los tubos
de cultivos almacenados en contenedores que no permiten la perdida de humedad pero
si el intercambio de gases, a una temperatura entre 5-8C necesitan transferencias
cada 6-8 meses. Las condiciones que permiten que se de una deshidrataci6n rpida del
cultivo requieren intervalos de transferencia mas cortos.
Conservacin por congelacin
La congelacin se puede emplear como mtodo de conservacin de cultivos

bacterianos, por ejemplo, para la elaboracin de productos fermentados. La mayor tasa
de destruccin bacteriana se observa inmediatamente tras la congelacin, despus se
reduce notablemente y lIega a estabilizarse durante largos periodos de tiempo. Por eso,
aunque el nmero de supervivientes disminuya, la congelacin es un mtodo efectivo
para mantener la viabilidad de las bacterias. Cuanto menor sea la temperatura de
almacenamiento, mayor ser la supervivencia de las bacterias. Para conseguir una
mnima destruccin de las bacterias interesa que la cristalizacin sea extracelular y que
las bacterias se deshidraten parcialmente impidindose la nucleacin intracelular, pero
no lo suficiente como para que se reduzca su viabilidad. En los medios suelen incluirse,
adems, agentes crioprotectores (glicerol, clara de huevo, leche, etc.).
EI principal problema del mantenimiento de microorganismos a temperaturas por debajo
del punta de congelacin es la muerte durante los procesos de congelaci6n y
descongelaci6n. Si los microorganismos pueden sobrevivir a temperaturas del orden o
por debajo de -20C seguidas de un recalentamiento rpido hasta la temperatura
ambiente es posible conservarlos congelados.
La supervivencia de los microorganismos a los procesos de congelacin y
descongelacin depende de (1) el numero inicial de clulas viables; (2) la tasa de
congelaci6n y descongelaci6n; (3) la temperatura de congelacin y almacenamiento (de
0 a -20C son mas destructivas que <-200C); (4) tiempo de almacenamiento; (5)
presencia de protectores fsicos.
Pre-

Los principales inconvenientes de este sistema son los costes de los equipos y del
mantenimiento, y los danos mecnicos que se pueden provocar en las clulas.
Agentes crioprotectores
Estos agentes facilitan el flujo de agua a travs de la membrana celular y protegen

estructuras moleculares y supra-moleculares a travs de diferentes formas de accin.
Son compuestos qumicos no txicos, can facilidad para atravesar la membrana celular y
acumularse intracelularmente. Se mantienen en forma amorfa durante el proceso de
congelacin y son capaces de unir electrolitos a molculas de agua para retrasar la
congelacin. Entre otros efectos protectores, sirven para compensar la diferencia de presin
osmtica que se genera cuando empieza a congelarse la superficie de la clula y se
incrementa la concentracin de solutos en el medio que Ie rodea. De esta manera se evita
una perdida excesiva de agua que podra provocar la deshidratacin y destrucci6n de las
clulas.
Conservacin en nitrgeno liquido
La actividad metablica de los microorganismos puede ser reducida considerablemente

almacenndolos a temperaturas muy bajas (-196C) lo cual se puede lograr utilizando la
refrigeracin can nitrgeno Lquido. Hongos, bacterias, virus, algas, levaduras y cultivos de
tejidos de animales y plantas han sido preservados satisfactoriamente mediante este mtodo.
La tcnica consiste en obtener el crecimiento del cultivo hasta lograr la mxima densidad
celular en fase estacionaria, resuspender las clulas en un agente crioprotector (como par
ejemplo glicerol al 10% estril a dimetil sulf6xido DMSO
al 10%) Y congelar la suspensin en viales cerrados hermticamente (-35C) antes de
conservarlos en nitrgeno lquido. EI cultivo puede sufrir perdidas de viabilidad durante las
etapas de congelacin y descongelacin pero no se han apreciado una reducci6n importante
durante el periodo de almacenamiento. Mediante esta tcnica se puede lograr mantener la
viabilidad de cultivos durante un periodo de varios aos.
Generalmente, se considera como deshidratacin un procedimiento que permite eliminar por
vaporizacin o sublimacin la mayor parte del agua de un producto lquido o solido. Por el
contrario, la concentracin (por evaporacin, congelacin, filtracin a travs de una
membrana, concentracin osmtica, centrifugacin, prensado mecnico, extracci6n de agua
por disolventes) solo retira cierta proporcin de esa agua. La concentracin constituye, a
veces, una fase previa a la deshidratacin de productos Lquidos.
Liofilizacin
Llamada anteriormente crio-desecaci6n, la liofilizacin, cuyo nombre procede de la industria

farmacutica, es un proceso de secado cuyo principio consiste en sublimar el hielo de un
Pre-

producto congelado. EI agua del producto pasa, por tanto, directamente del estado solido al
estado de vapor, sin pasar por el estado lquido.
EI proceso de liofilizaci6n consiste esencialmente en dos etapas: 1) el producto se congela y
2) el producto se seca por sublimaci6n directa del hielo bajo una presi6n reducida.
Ventajas de la liofilizacin:
La temperatura de trabajo es muy baja y por 10 tanto los productos termolbiles no se
alteran.
No existe peligro de oxidacin por la ausencia de aire durante el procesado.
No hay agua libre, por lo tanto no hay peligro de hidrolisis ni de crecimiento microbiano.
AI evaporarse el hielo, quedan poros que permiten una rehidratacin o reconstitucin rpida.
La humedad residual es baja.
La duracin de la conservacin es larga.
Son productos de peso ligero que no necesitan cadenas de refrigeracin para su distribucin.
Pero tambin presenta algunos inconvenientes:
EI coste de las instalaciones y los equipos es muy elevado (alrededor de tres veces el de los
otros mtodos).
Altos costes de energa (tambin alrededor de tres veces el de los otros mtodos).
Proceso lento y largo (un ciclo habitual puede ser de 4-8 horas para liofilizar 2 gramos de
producto).
Los productos liofilizados pueden volver a su estructura original por adicin de agua. La
estructura esponjosa del producto liofilizado permite una rpida rehidratacin del mismo. Las
caractersticas del producto re hidratado son anlogas a las que posea el producto inicial.
Atomizacin
EI mtodo de secado por atomizacin es uno de los mas importantes mtodos utilizados para
secar determinados productos lquidos: leches concentradas, extractos concentrados de
caf, huevos, extractos de levadura, casena, zumos de frutas, te, sangre y otros
concentrados proteicos, etc. Para ello, se "atomiza" (es decir, se transforma en aerosol 0
niebla) una soluci6n 0 una suspensi6n mas 0 menos viscosa del producto; las pequeas
gotas lquidas as formadas se arrastran y deshidratan en una corriente de aire dando un
polvo seco antes de caer sobre las paredes inferiores del aparato.
Las partculas de polvo al final del proceso tienen una forma de esferas 0 fragmentos de
esferas vacas en su interior que permiten una fcil rehidratacin.
La calidad del producto tratado no se altera mucho debido a que la intensa evaporaci6n
protege el producto del efecto que tendra la elevada temperatura del aire caliente (el
proceso de evaporacin absorbe buena parte del calor aportado). En realidad la energa
aportada en forma de calor cede al producto el calor latente de vaporizaci6n haciendo que el
incremento de temperatura de las partculas (debido al calor sensible) sea muy bajo.
Adems, la tasa de reacciones degradativas disminuye a bajos contenidos de humedad, y
eso favorece que el corto tiempo de exposici6n de la partcula seca a temperaturas elevadas
(entre 4 y 6 segundos si se utiliza un nebulizador a presi6n y hasta 30 segundos si el
nebulizador es centrifugo) no comporte un deterioro importante del producto.
Las ventajas del secado por atomizacin, son las siguientes:
Pre-

Las especificaciones de los polvos permanecen constantes a 10 largo del secadero cuando
las condiciones de secado son constantes.
Es una operaci6n de secado continua y fcil y se puede adaptar a un control automtico
completo.
Existe un amplio intervalo de disertos de secaderos que se pueden aplicar a materiales
sensibles al calor, corrosivos y abrasivos.
Las desventajas mas grandes de los atomizadores son los costes de instalaci6n, eficacia
trmica, calor residual y manejo del aire agotado en condiciones de saturaci6n 0 cercanas a
ella.
OBJETIVO GENERAL
Conocer las diferentes tcnicas de conservacin de cultivos microbianos puros.
Conservar integro el microorganismo de trabajo.

Comprender el fundamento de la tcnica utilizada.
MATERIAL Y REACTIVOS
Cajas petri
Asas de platino
Tubos de 15x100
METODOLOGA
Una vez aislado el microorganismo en cuestin, para conservarlo se hicieron subcultivos

cada mes aproximadamente y para asegurar que no hubiera cambios se hicieron pruebas
bioqumicas.
RESULTADOS
Pre-

CONCLUSIONES:
BIBLIOGRAFA:



Pre-

OBTENCIN Y PREPARACIN DE 4
CULTIVOS PUROS

Pre-

Contenido Pgin
a
I. INTRODUCCIN 6
III. OBJETIVO 7
IV. METODOLOGIA 8
IV. 1. Material y equipo. 8
IV. 2. Reactivos y soluciones. 8
IV. 3. Requerimientos de seguridad 8
IV.4. Disposicin de residuos 8
IV. 5. Procedimiento. 9
IV. 6. Diseo experimental (si lo hay)
V. RESULTADOS. 9
V.1 Clculos 10
VI. DISCUSION. 11
Pre-

INTRODUCCIN:
La identificacin es un proceso por el cual debemos determinar a qu especie pertenece una

determinada cepa bacteriana, mediante la comparacin de una serie de caractersticas que
pueden ser puestas en evidencia en el laboratorio y que han sido estudiadas para la gran
mayora de las especies bacterianas.
Cuanto ms semejanza haya entre las caractersticas obtenidas en el laboratorio y las que
habitualmente presenta una determinada especie, mayor ser la probabilidad de que esa
cepa problema pertenezca a dicha especie. Las caractersticas utilizadas en la identificacin
de cada grupo de microorganismos dependen de las posibilidades de cada laboratorio,
fundamentalmente econmicas y de cualificacin del personal.
Tradicionalmente la identificacin de una cepa bacteriana comienza con la visualizacin de
un frotis de la colonia aislada al que se le ha realizado una tincin de Gram: Bsicamente los
cuatro grandes grupos que nos encontraremos en este primer paso son los siguientes: Cocos
Gram positivos, Cocos Gram negativos, Bacilos Gram negativos y Bacilos Gram positivos.
La identificacin puede realizarse tambin sobre grupos de microorganismos con
caractersticas especiales que veremos especficamente cuando tratemos a dichos grupos,
como son: Micobacterias, Anaerobios, Rickettsias y Chlamydias, Micoplasmas, Espiroquetas,
Actinomices y Nocardias.
ANTECEDENTES:
Los laboratorios deben utilizar una rutina especfica que vaya realizando de forma secuencial
o simultnea una serie de pruebas que nos permitir ir diferenciando las especies ms
importantes desde el punto de vista infeccioso. Quizs las ms utilizadas cuantitativamente
sean las pruebas bioqumicas que nos permiten determinar caractersticas metablicas de
los microorganismos objeto de identificacin, aunque las reacciones de aglutinacin o
precipitacin utilizadas son ms rpidas y ms especficas.
Las pruebas podramos clasificarlas fundamentalmente en aquellas que nos permiten la
identificacin de Gram positivos y pruebas para identificacin de Gram negativos, aunque
hay una serie de pruebas comunes a ambos grupos que vamos a enumerar (Figura 1).
Una bacteria es un complejo ser vivo con un sistema de estructuras y molculas
intracelulares en parte similar al nuestro. La presencia de ciertos enzimas hace que las
bacterias puedan actuar sobre algunos substratos y transformarlos; la ausencia de un enzima
determinado impedir esa transformacin o al menos la retardar, si el proceso puede
desarrollarse siguiendo otra va. La presencia de determinadas molculas, ya provenga de la
propia estructura bacteriana, ya sean subproductos de su metabolismo intermediario, puede
ponerse de manifiesto mediante una serie de reacciones qumicas adecuadas. Casi todos los
miembros de una misma especie bacteriana deben poseer un sistema metablico similar, por
Pre-

lo que las enzimas y metabolitos presentes en la bacteria, no diferirn mucho entre s. La
dificultad en la identificacin de una especie bacteriana estriba en que los enzimas o
molculas responsables de determinados procesos metablicos no siempre se expresan
fenotpicamente. Si todos los miembros de una misma especie reaccionaran idnticamente
ante determinados substratos y poseyeran siempre las mismas rutas metablicas, el
problema de la identificacin sera mnimo.
El problema reside en que no siempre pueden ponerse de manifiesto las mismas
transformaciones enzimticas o la presencia de determinados metabolitos. Esto hace que
tengamos que utilizar simultneamente una gran diversidad de pruebas (pruebas
bioqumicas) y comparar los resultados obtenidos con aquellas especies que presentan una
mayor coincidencia.
Figura 1. Pruebas de identificacin bacteriana.
Las pruebas bioqumicas, unidas a otras caractersticas de identificacin, hacen fiables casi
en un 100% los procedimientos rutinarios de identificacin bacteriana. Determinadas pruebas
son especficas de gnero o de especie en un 99,99.Sin embargo, en ningn caso, el
procedimiento de identificacin puede darnos una certeza absoluta sobre las conclusiones
Pre-

obtenidas. nicamente nos indicar cul es la especie a la que el microorganismo
identificado tiene mayor probabilidad de pertenecer. Las pruebas para realizar una
identificacin bacteriana deben partir de un cultivo puro donde las colonias estn
perfectamente aisladas.
Las pruebas de identificacin bioqumica pueden clasificarse en funcin de la parte del
metabolismo que est influyendo, y as tenemos:
Pruebas bioqumicas del metabolismo respiratorio

Catalasa
Citocromo-oxidasa
Pruebas bioqumicas del mecanismo de produccin de energa

Oxidacin-Fermentacin
Reduccin de nitratos a nitritos
Rojo de metilo
Voges Proskauer
Pruebas bioqumicas del metabolismo hidrocarbonado

Fermentacin de hidratos de carbono
Utilizacin del citrato
Beta galactosidasa (ONPG)
Pruebas bioqumicas del metabolismo proteico:

Hidrlisis de la gelatina
Hidrlisis de la urea por ureasa
Produccin de indol
Produccin de cido sulfhdrico
Fenilalanina desaminasa (TDA)
Prueba de las decarboxilasas
LDC
ODC
ADH
Pruebas bioqumicas para la deteccin de exoenzimas:

Cogulasa
Fosfatasa
Desoxirribonucleasa
Descripcin de las pruebas bioqumicas ms comunes empleadas en la identificacin

de microorganismos.
1. Indol
Pre-

El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptofano. Las
bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con
produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produccin de indol es una caracterstica
importante para la identificacin de muchas especies de m.o.
Principio
La prueba de indol est basada en la formacin de un complejo rojo cuando el indol
reacciona con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo
del reactivo de Kovacs descrito ms adelante. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en
triptofano.
Medios y reactivos
Caldo triptfano
Peptona o digerido pancretico de casena 2g

Cloruro de sodio 0,5 g
Agua destilada 100 ml
Reactivo de Kovacs
Alcohol amlico o isoamlico 150 ml
p-dimetilaminobenzaldehdo 10 g
HCl conc. 50 ml
Procedimiento
Inocular el caldo triptofano con el m.o. en estudio e incubar a 35C durante 18 a 24 horas. Al
finalizar este perodo, aadir 5 gotas de reactivo por la pared interior del tubo.
Interpretacin
El desarrollo de un color rojo intenso en la interfase del reactivo y el caldo, segundos
despus de aadir el reactivo indica la presencia de indol y un resultado de la prueba
positiva.
Controles
Escherichia coli: positivo
Klebsiella pneumoniae: negativo (mayora de las cepas)
2. Rojo de Metilo - Voges-Proskauer (RM VP)
Principio
Una de las caractersticas taxonmicas que se utilizan para identificar los diferentes gneros
de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporcin de productos de fermentacin que se
originan por la fermentacin de la glucosa. Se conocen dos tipos generales: la fermentacin
cido-mixta y la fermentacin del 2,3 butanodiol. En la fermentacin cido mixta se forman
Pre-

fundamentalmente lctico, actico y succnico, adems de etanol, H 2 y CO2. En la va del
butanodiol se forman cantidades menores de cido (acetato y succinato) y los principales
productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2.
El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo de viraje entre 6,0 (amarillo) y 4,4
(rojo), que se utiliza para visualizar la produccin de cidos por la va de fermentacin cido
mixta. El acetil-metil-carbinol (o acetona) es un producto intermediario en la produccin de
butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxgeno la acetona es oxidada a diacetilo.
Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia
Medios y reactivos
Caldo RM/VP
Peptona 7g
Glucosa 5g
Fosfato dipotsico 5 g
Agua destilada 1L
pH = 6,9 0,1
Indicador de pH rojo de metilo
Rojo de metilo 0,1 g en 300 mL de etanol 95

Agua destilada 200 ml
Revelador VP
alfa-naftol (solucin al 5% en etanol 95)
Solucin de KOH al 40% en agua destilada
Procedimiento
Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no ms de 24 horas del m.o. en estudio.
Incubar a 35C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubacin transferir 1 mL
del caldo a un tubo limpio para VP. En el caldo restante revelar RM agregando unas 4 - 8
gotas del indicador rojo de metilo. Para revelar VP agregar 0,6 ml (10 gotas) de alfa-naftol al
5% y 1 gota de KOH al 40%. Agitar cuidadosamente para exponer el medio al oxgeno
atmosfrico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos.
Interpretacin
La prueba RM es positiva si se desarrolla un color rojo estable. Esto indica que la produccin
de cido es suficiente para producir el viraje del indicador y el m.o. ferment la glucosa por la
va de cido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es
considerado como positivo.
La prueba VP es positiva si se desarrolla un color rojo-fucsia luego de 15 minutos, que indica
la presencia de diacetilo, producto de oxidacin de la acetona.
Pre-

Controles
RM positivo, VP negativo: Escherichia coli
RM negativo, VP positivo: Enterobacter aerogenes
3. Utilizacin de Citrato
La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono es una prueba til en la identificacin
de enterobacterias.
Principio
La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con
citrato como nica fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinizacin del medio.
Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH
7,6.
Medios y reactivos
Medio de Simmons
Fosfato dicido de amonio 1 g
Fosfato dipotsico 1g
Cloruro de sodio 5g
Citrato de sodio 2g
Sulfato de magnesio 0,2 g
Agar 15 g
Azul de bromotimol 0,08 g
Agua destilada c.s.p. 1L
pH = 6,9
Procedimiento
Se inocula la superficie del agar inclinado con una sola estra en el pico. Utilizar un cultivo de
24 horas en un medio slido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden
producir falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inculo. Incubar a
35C durante 4 das.
Interpretacin
El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estra, acompaado o
no de un viraje del indicador al azul.
Controles
Positivo: Klebsiella spp.
Negativo: E.coli
4. Descarboxilacin de lisina y ornitina

Pre-

La descarboxilacin de aminocidos es llevada a cabo por descarboxilasas y se forman
aminas y CO2. Cada descarboxilasa es especfica para un aminocido y la reaccin es
completa e irreversible. Los aminocidos ensayados habitualmente para la identificacin son
lisina, ornitina y arginina.
Principio
El caldo descarboxilasa de Moeller es el medio base ms comnmente usado para la
determinacin de las descarboxilasas en enterobacterias. Se prepara un tubo con el medio
conteniendo el aminocido a ensayar y un tubo control con medio base sin aminocido. Se
cubren con una capa de aceite mineral (vaselina lquida) para hacer el medio anaerobio de
manera que ocurra la fermentacin de la glucosa que contiene. Durante las primeras etapas
de la incubacin en ambos tubos se observar viraje del indicador de pH del medio al cido,
por la fermentacin de la glucosa. Luego, si el aminocido es descarboxilado, se forman
aminas que provocan un retorno al color original del medio o un viraje al alcalino.
Medios y reactivos
Base de Moeller
Peptona 5g
Extracto de carne 5g
Glucosa 0,5 g
Piridoxal 0,005 g
Prpura de Bromocresol 0,01 g
Rojo de cresol 0,005 g
pH final = 6,0
Caldo Lisina o Ornitina de Moeller

Preparar igual al medio base y agregar 10 g del aminocido (1% de concentracin final de la
forma levo, utilizar el doble si se usa la forma dl del aminocido ya que solo la levo es activa).
Agregar aceite mineral para formar una capa de 1 cm de espesor.
Procedimiento
Inocular con un cultivo puro de 24 horas un tubo de base de Moeller con el aminocido a
estudiar (lisina u ornitina) y un tubo de la base (control sin aminocido). Incubar a 35C
durante 18 a 24 horas.
Interpretacin
El ensayo puede ser ledo si en el tubo control se observa crecimiento y viraje del indicador al
amarillo indicando que se dio la fermentacin de la glucosa y un descenso de pH que permite
la activacin de las descarboxilasas. El retorno al color azul-violeta en el tubo que contiene el
Pre-

aminocido indica una reaccin positiva debida a la liberacin de aminas por
descarboxilacin.
Controles
Descarboxilacin de lisina positiva: Enterobacter aerogenes
Descarboxilacin de lisina negativa: Enterobacter cloacae
Descarboxilacin de ornitina positiva: Serratia spp
Descarboxilacin de ornitina negativa: Klebsiella spp.
5. Fenilalanina desaminasa
La fenilalanina es un aminocido que por desaminacin oxidativa forma un cetocido, el

cido fenilpirvico. Slo los gneros Proteus y Providencia poseen la fenilalanina
desaminasa, lo que permite diferenciarlas del resto de las Enterobacterias.
Principio
La prueba de la fenilalanina se basa en la deteccin del cido fenilpirvico luego del
desarrollo del m.o. en un medio que contiene fenilalanina. Para eso se agrega cloruro frrico
que forma un complejo de color verde con el cido fenilpirvico. El medio de cultivo no puede
contener extractos de carne o peptonas por su contenido variable en fenilalanina.
Medios y reactivos
Agar fenilalanina
DL fenilalanina 2g
Extracto de levadura 3g
Cloruro de sodio 5g
Fosfato de sodio 1g
Agar 12 g
pH = 7,3
Cloruro frrico
Cloruro frrico 10 g
HCl concetrado 2,5 g
Agua destilada c.s.p. 100 ml
Procedimiento
Inocular el agar en pico de flauta con un cultivo puro de 24 horas e incubar a 35C durante
18-24 horas. Luego de transcurrido el perodo de incubacin, agregar 4 o 5 gotas de reactivo
de cloruro frrico, directamente sobre la superficie del agar.
Pre-

Interpretacin
La aparicin inmediata de un color verde intenso indica la presencia de cido fenilpirvico y
una prueba positiva.
Controles
Positivo: Proteus
Negativo: Escherichia coli
6. TSI (Triple Sugar Iron)
El agar triple azcar hierro es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la
capacidad de produccin de cido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un nico
medio. Tambin permite la deteccin de la produccin de H 2S. Es un medio til para la
identificacin de enterobacterias.
Principio
El agar se prepara en forma de pico de flauta. Esto determina que existan dos cmaras de
reaccin dentro del mismo tubo. La porcin inclinada (pico) expuesta en toda su superficie al
oxgeno es aerobia y la porcin inferior (fondo) est protegida del aire y es relativamente
anaerobia.
Al crecer un m.o. en el TSI, el pico tiende a virar al pH alcalino (color
rojo por el rojo fenol) por la produccin de aminas, debido a la
utilizacin aerobia de las peptonas. En el fondo del tubo -donde no
hay oxgeno- la degradacin de peptonas es menor y no se generan
aminas, de manera que se pueden detectar la produccin de
pequeas cantidades de cido (color amarillo por el rojo fenol). Si se
inoculan m.o. no fermentadores no se formarn cidos, pero por la
produccin de aminas en el pico, todo el medio quedar rojo.
La glucosa en el TSI est en una proporcin 10 veces menor que la
lactosa y la sacarosa. Si el TSI es inoculado con una bacteria fermentadora de glucosa pero
no de lactosa ni de sacarosa, la cantidad de cido producida por fermentacin ser baja
(porque la cantidad de glucosa inicial es baja). En las primeras horas (10 a 16 hs) de
incubacin se producir viraje del indicador al amarillo en todo el tubo (pico y fondo), pero al
continuar la incubacin, el pico del tubo retornar al rojo por la produccin de aminas debida
a la degradacin aerobia de las peptonas antes descrita.
Si el m.o. fermenta la lactosa y/o la sacarosa, como las concentraciones de estos azcares
son 10 veces mayores a la glucosa, se producir gran cantidad de cido (que no puede ser
neutralizado por la produccin de aminas en la superficie), por lo tanto todo el tubo (pico y
fondo) virar al color amarillo (cido).
La produccin de H2S a partir de tiosulfato se pone en evidencia por precipitacin del sulfuro
ferroso (negro). Como esta reaccin se da preferencialmente en medio cido, un
ennegrecimiento del fondo del tubo (que puede cubrir todo el fondo del tubo y enmascarar el
color amarillo) se lee como fermentacin de algunos de los azcares del medio. Adems
Pre-

puede observarse la produccin de gas (H2 y CO2), ya sea como burbujas en el fondo del
tubo, por ruptura del agar o desplazamiento del mismo hacia la superficie.
Medios y reactivos
TSI
Extracto de carne 3g
Extracto de levadura 3 g
Peptona 15 g
Proteosa peptona 5g
Lactosa 10 g
Sacarosa 10 g
Glucosa 1g
Cloruro de sodio 5g
Sulfato ferroso 0,2 g
Tiosulfato de sodio 0,3 g
Agar 12 g
Rojo fenol 0,024 g
Agua destilada 1L
pH = 7,4 0,2
Procedimiento
Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5
mm del fondo del tubo. Tras retirar la punta del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia
uno y otro lado. Incubar a 35 C durante 18-24 hs, pero no ms de 24 hs..
Interpretacin y Controles
Para el TSI siempre se informa el resultado en el siguiente orden: pico, fondo, produccin de
gas y H2S.
Pico alcalino/fondo alcalino (Alc/Alc/gas-/H2S-)

No hay fermentacin de azcares. Caracterstica de bacterias no fermentadoras como Ej.
Pseudomonas sp
Pico alcalino/fondo cido (Alc/A/gas-/ H2S-)

Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. No hay produccin de gas ni de
H2S. Ej. Shigella spp.
Pico alcalino/fondo cido (Alc/A/gas-/ H2S+)

Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. No hay produccin de gas, si de
H2S. Ej. Salmmonella typhi.
Pico alcalino/fondo negro (Alc/A/gas+/H2S+)

Pre-

Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, produccin de gas y produccin de
cido sulfhdrico. Ej. Salmonella spp. (la mayora de las especies de Salmonella).
Pico cido/fondo cido (A/A)

Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse H 2S o no. E.coli (A/A/H2S -)
A estos resultados se les agrega el resultado de la produccin de gas. Ej. A/A/gas+/H 2S-.
7. LIA (Lysine iron agar)
Este ensayo permite diferenciar los m.o. que producen descarboxilacin o desaminacin de
la lisina. Se puede detectar adems la produccin de H2S. Es muy utilizado en las tcnicas
de bsqueda de Salmonella, principalmente para descartar otras bacterias que dan colonias
de aspecto similar en los medios diferenciales utilizados durante el aislamiento selectivo.
Principio
Durante las primeras etapas de la incubacin el fondo virar el indicador de pH del medio al
cido (amarillo) por la fermentacin de glucosa. Luego, si el aminocido es descarboxilado se
formarn aminas que provocan un retorno al color original del medio o hacia un viraje al
bsico (color violeta).
En la desaminacin se produce un cido carboxlico y NH3 y se visualiza en la superficie la
aparicin de un color rojo intenso. La produccin de H 2S a partir de tiosulfato se visualiza por
la precipitacin de sulfuro ferroso de color negro.
Medios y reactivos
Peptona 5g
Extracto de levadura 3g
Glucosa 1g
L-lisina HCl 10 g
Citrato frrico amnico 0,5 g
Tiosulfato de sodio 0,04 g
Prpura de bromocresol 0,02 g
Agar 15 g
Agua destilida 1L
pH = 6,7 0,2
Interpretacin y controles
pico alcalino/fondo alcalino/H2S +, descarboxilacin de lisina positiva. Ej.: Salmonella
choleraesuis.
pico rojo/fondo cido/H2S-, desaminacin de lisina positiva, descarboxilacin de lisina
negativa. Ej.: Proteus mirabilis.
pico alcalino/fondo cido/H2S- descarboxilacin de lisina negativa. Ej. E. coli
pico alcalino/fondo cido/H2S+ descarboxilacin de lisina negativa, produccin de H2S. Ej.
Citrobacter freundii.
Pre-

8. Coagulasa
La coagulasa es una enzima proteica con actividad semejante a la protrombina, capaz de

transformar el fibringeno en fibrina, provocando la formacin de un cogulo visible en un
sistema analtico adecuado. Se cree que la coagulasa funciona in vivo, produciendo una
barrera en el sitio de infeccin estafilocccica. En el laboratorio, la prueba de coagulasa se
utiliza ms comnmente para diferenciar al Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) de
otros Staphylococcus.
Principio
La coagulasa se halla presente en dos formas, libre y fija, cada una de las cuales posee
diferentes propiedades que requieren el uso de tcnicas de determinacin diferentes:
a) Coagulasa fija (prueba en portaobjetos): la coagulasa fija est unida a la pared celular
bacteriana. Los hilos de fibrina formados entre las clulas suspendidas en plasma (que
contiene fibringeno) provocan su aglutinacin, indicada por la presencia de agregados
visibles en el portaobjetos.
b) Coagulasa libre (prueba en tubo): la coagulasa libre es una enzima extracelular que se
halla presente en los filtrados de cultivos. Cuando una suspensin de bacterias
productoras de coagulasa se mezcla en partes iguales con plasma en un tubo de ensayo,
se forma un cogulo visible como consecuencia de la utilizacin de los factores de
coagulacin del plasma de manera similar a cuando se aade trombina.
Medios y reactivos
Plasma coagulasa (Difco, o BBL)

Cultivo de Staphylococcus de 24 horas en un agar nutriente o caldo nutriente.
Procedimiento
1. Prueba en portaobjetos: Colocar una gota de agua destilada sobre un portaobjetos.
Emulsionar suavemente el organismo en estudio en la gota de agua de manera de
obtener una suspensin cargada homognea. Agregar una gota de plasma reconstituido
junto a la gota de la suspensin del m.o. Mezclar bien con el ansa. Inclinar el
portaobjetos hacia uno y otro lado, observando la formacin inmediata de un precipitado
granular o de grumos blancos.
2. Prueba en tubo: Colocar aspticamente 0,5 ml de plasma reconstituido en el fondo de un
tubo estril. Aadir 0,5 ml de cultivo de 24 horas (o suspensin en suero fisiolgico de un
cultivo en placa). Mezclar por rotacin el tubo, evitando remover o agitar el contenido.
Colocar en bao de agua a 37C y observar cada hora hasta 4 horas y luego a las 24
horas, la formacin de un cogulo visible.
Figura 2. Prueba de coagulasa en tubo

Pre-

Interpretacin
Prueba en portaobjetos: una reaccin positiva se detecta usualmente en 15 a 20 segundos
por la aparicin de un precipitado granular. La prueba se considera negativa si no se observa
aglutinacin en 2 a 3 minutos. Esta prueba es solo presuntiva y todos los cultivos que den
resultados negativos o positivos tardos deben verificarse mediante la prueba en tubos ya
que algunas cepas de Staphylococcus aureus no producen coagulasa fija.
Prueba en tubos:
1+: pequeos cogulos no organizados.
2+: pequeos cogulos organizados.
3+: gran cogulo organizado.
4+: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando se invierte el tubo.
Se consideran positivos los grados 3+ y 4+
Controles
Positivo: S.aureus
Negativo: S.epidermidis:
9. Ureasa
La urea es una diamida del cido carbnico que puede ser hidrolizada con liberacin de
amonaco y dixido de carbono.
Principio
La ureasa es una enzima que poseen muchas especies de m.o. que pueden hidrolizar urea
de acuerdo a la siguiente reaccin qumica:
Urea + 2H2O CO2 + H2O + 2NH3
El amonaco reacciona en solucin para formar carbonato de amonio, producindose
alcalinizacin y aumento de pH del medio.
Medios y reactivos
El caldo urea y agar urea de Christensen son los dos medios mas comnmente usados en
los laboratorios para la deteccin de la ureasa de m.o.
Pre-

Caldo de Stuart
Extracto de levadura 0,1 g
Fosfato monopotsico 9,1 g
Fosfato disdico 9,5 g
Urea 20 g
Rojo fenol 0,01 g
Agua 1L
pH = 6,8
Agar urea de Christensen

Peptona 1g
Glucosa 1g
Cloruro de sodio 5g
Fosfato monopotsico 2g
Urea 20 g
Rojo fenol 0,012 g
Agar 15 g
Agua 1L
pH = 6,8
Procedimiento
Inocular el caldo con una ansada cargada con el cultivo puro del m.o. o estriar la superficie
del agar. Incubar a 35C durante 24 hs.
Interpretacin
Los m.o. que hidrolizan urea rpidamente pueden producir reacciones positivas en 1 a 3 hs.
Las especies mas lentas pueden requerir 3 o mas das.
Caldo: una coloracin rojiza indica alcalinazacin e hidrlisis de urea
Agar: una coloracin rojiza en el medio indica hidrlisis de urea positiva. Los degradadores
lentos producen coloracin parcial (generalmente el pico), los rpidos producen coloracin en
todo el tubo. Si no hay hidrlisis el medio permanece con el colo original (amarillo) y se
observa crecimiento.
Controles
Positivo: Proteus sp
Negativo: Escherichia coli
Las pruebas inmunolgicas utilizan las reacciones de aglutinacin para poner en evidencia
antgenos bacterianos. Las ms utilizadas son pruebas de aglutinacin para deteccin de:
Staphylococcus aureus, Estreptococos beta hemolticos, Streptococcus pneumoniae,
Serotipos de Salmonella, Serotipos de E. coli, Haemophilus influenzae, Neisseria
meningitidis.Por ltimo, las pruebas de sensibilidad utilizan una caracterstica de los
microorganismos frente a una sustancia qumica o antimicrobiano que consiste en la
sensibilidad o resistencia constante frente a dicha sustancia, lo cual nos puede permitir
Pre-

confirmar o descartar la presencia del microorganismo. Las pruebas de susceptibilidad ms
utilizadas son: sensibilidad a Novobiocina, sensibilidad a Optoquina, a Bacitracina a
Metronidazol y Sulfatiazol.
Salmonella typhi
Es una bacteria Gram-negativo facultativa en forma de vara en el mismo pertenece a la

familia Enterobacteriaceae, bacterias conocidas como "entricas". La Salmonella vive en el
intestino tanto en animales de sangra caliente, como sangre fra. En los seres humanos, el
gnero Salmonellae es causa de las dos enfermedades conocidas como salmonelosis: fiebre
entrica (fiebre tifoidea), resultante de la invasin de bacterias en el torrente sanguneo, y la
gastroenteritis aguda, como resultado de una infeccin de los alimentos / intoxicacin.
Figura 3. Salmonella typhi

Tabla 1. Pruebas bioqumicas caractersticas para la diferenciacin de la bacteria Salmonella
spp.
Prueba bioqumica Resultado

Prueba de movilidad Positiva
Fermentacin de lactosa , glucosa, maltosa y
Negativa
manitol
Indol Negativa
Rojo de metilo Positiva
Citrato Positiva
Descarboxilacin de lisina Positiva
Ureasa Negativa
Descarboxilacin de ornitina Positiva
Crecimiento en presencia de KCN Negativa
Fenilalanina deaminasa Negativa
Gelatinasa Negativa
Pseudomona aeruginosa
Pre-

Es una bacteria Gram negativa, aerbica pertenecientes a la familia Pseudomonadaceae. La
familia incluye otros gneros, que, junto con otros organismos, son las bacterias
informalmente conocidos como pseudomonas. Estas bacterias son habitantes comunes de
los suelos y el agua. Se producen regularmente en la superficie de las plantas y de vez en
cuando en las superficies de los animales. Las pseudomonas son bien conocidas por los
microbilogos de plantas porque son uno de los pocos grupos de bacterias que son
verdaderos agentes patgenos de las plantas. De hecho, Pseudomonas aeruginosa, de vez
en cuando es un agente patgeno de las plantas. Sin embargo si son bacterias patgenas
para el ser humano, debido a que son los agentes causales de enfermedadescomo
endocarditis, infecciones del sistema nervioso central, del tracto urinario, dermatitis entre
otras.
Las Pseudomonas aisladas pueden producir tres tipos de colonias. Son microorganismos
aislados del suelo o el agua y suele producir una pequea y spera colonia. Algunos tipos
forman colonias con apariencia de huevo frito, que es grande, liso, con cantos planos y una
elevada aparicin.
Figura 4. Morfologa macroscpica de las Pseudomonas

Tabla 2. Pruebas bioqumicas caractersticas para la diferenciacin de la bacteria
Pseudomona aeruginosa.
Prueba bioqumica Resultado

Citocromo Oxidasa Positiva
Catalasa Positiva
Reduccin de nitratos Positiva
Pre-

OBJETIVOS GENERAL
Lograr identificar el microorganismo presente en un cultivo puro, mediante la realizacin

de pruebas bioqumicas.
Realizar las siguientes pruebas bioqumicas: Indol, coagulasa, catalasa, citocromo

oxidasa, Fermentacin de manitol, de lactosa, de glucosa, desaminacin de lisina, de
ornitina,de arginina reduccin de nitratos, hemlisis, produccin de H 2S, Voges-
Proskauev, desarrollo de la presencia de KCN, Rojo de metilo, Utilizacin de citrato,
Hidrlisis de urea, de lecitina, gelatinasa, Descarboxilacin de :arginina, lisina,
fenilalanina y utilizacin de manitol, para la verificacin de la identidad de un cultivo del
cual se sospecha la presencia de Salmonella typhi y de otro del cual se dice contiene
Pseudomona aeruginosa.
Los ya previamente descritos en los antecedentes, de acuerdo a cada prueba.

Tubos de ensaye de 15X150 con rosca, (con el agar correspondiente previamente
esterilizados)
1 Gradilla
2 Cajas petri
Matraz erlenmeyer de 125mL
Esptula
Probeta de 100mL
Asa de nicromo
Bolsa de algodn
Autoclave
Pre-

Diagrama de Flujo
Parte A. Procedimiento (Para cada una de las pruebas descrito en los antecedentes)
Contar con todos los

tubos previamente Sembrar al MO en Incubar el tiempo
preparados, as como el cada uno de los necesario en cada
material necesario tubos o ponerlo en prueba
contacto
RESULTADOS:
DISCUSIN DE RESULTADOS:
CONCLUSIONES:
Pre-

BIBLIOGRAFA:


Faria, J. F. 1974. Algunas Caractersticas de Calidad Qumica de leche cruda del Distrito
Perij del Estado Zulia. (Trabajo de Ascenso). Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad
del Zulia.
Pre-

EVALUACIN DEL CRECIMIENTO 5
BACTERIANO

Pre-

Contenido Pgin
a
I. INTRODUCCIN 6
III. OBJETIVO 7
IV. METODOLOGIA 8
V. RESULTADOS. 9
V.1 Clculos 10
VI. DISCUSION. 11
Pre-

INTRODUCCIN
En Microbiologa, la palabra crecimiento se define como un incremento en el nmero de

clulas. El crecimiento es un componente esencial de la funcin microbiana, ya que en la
naturaleza cualquier clula tiene un periodo de vida finito y la especie se mantiene como
resultado del crecimiento continuo de la poblacin. Adems de la comprensin de los
aspectos bsicos del crecimiento microbiano, muchas situaciones prcticas hacen necesario
el control del crecimiento bacteriano
ANTECEDENTES
La clula bacteriana es una mquina sinttica capaz de duplicarse a s misma. Los procesos
bioqumicos del crecimiento celular bacteriano suponen no menos de 2000 reacciones de
una gran variedad de tipos. Algunas de estas reacciones son transformaciones de la energa.
Otras suponen la biosntesis de pequeas molculas, las unidades bsicas de las
macromolculas, as como los diversos cofactores y coenzimas necesarios para las
reacciones enzimticas. Sin embargo, las principales reacciones celulares sintticas
consisten en reacciones de polimerizacin, por las que los polmeros se forman a partir de
los monmeros. Una vez que se fabrican los polmeros, est dispuesto el escenario para los
procesos finales del crecimiento: el ensamblaje de las macromolculas y la formacin de las
estructuras celulares como pared celular, membrana citoplasmtica, flagelos, ribosomas,
cuerpos de inclusin, complejos enzimticos, etc.
Fisin binaria
Es un proceso en el cual de la divisin de una clula resultan dos (2) clulas, usualmente
ambas clulas hijas tienen el mismo tamao y forma. Este es el proceso ms comn y sin
duda el ms importante en el ciclo de crecimiento de las poblaciones bacterianas. En un
cultivo en crecimiento la clula bacteriana aumenta de tamao, replica su ADN y la pared
celular y la membrana citoplasmtica comienzan a crecer hacia adentro a partir de
direcciones opuestas formando una particin conocida como septo. A cada lado del septo se
ubica una copia del cromosoma bacteriano y los otros constituyentes celulares que le
permitan a cada clula hija vivir como clula independiente. Luego se separan como dos
clulas hijas resultantes de la divisin de la clula madre original.
Existen en las bacterias otros procesos reproductivos pero son menos comunes, por ejemplo
especies del gnero Streptomyces producen muchas esporas reproductivas por
microorganismo y cada espora da origen a un nuevo microorganismo. Otras bacterias como
las del gnero Nocardia, presentan extensos crecimientos filamentosos los cuales se
fragmentan en pequeas unidades que al desarrollarse originan nuevos microorganismos.
Algunas bacterias como las especies del gnero Hyphomicrobium se reproducen por
Pre-

gemacin, lo cual consisten en que una clula madre emite un brote, ste aumenta de
tamao y posteriormente se separa como una nueva clula.
Figura 1. Proceso general de la fisin binaria en una procariota con forma de bacilo. Para
simplificar el nucleoide se representa como un crculo sencillo verde.
Crecimiento de poblaciones
Se define crecimiento como un aumento en la cantidad de constituyentes y estructuras

celulares, cuando hay crecimiento en ausencia de divisin celular hay aumento en el tamao
y peso de la clula. Mientras que cuando el crecimiento es seguido de divisin celular hay un
aumento en el nmero de clulas.
Es importante distinguir entre el crecimiento de clulas individuales y el crecimiento de
poblaciones, ya que en los microorganismos debido a su pequeo tamao no se hacen
estudios de crecimiento individual sino estudios de crecimiento de poblaciones.
El crecimiento de una poblacin es el aumento del nmero de clulas como consecuencia de
un crecimiento individual y posterior divisin. El crecimiento de una poblacin ocurre de una
manera exponencial. El crecimiento exponencial es una consecuencia del hecho de que cada
clula se divide dando dos (2) clulas hijas, las cuales al dividirse darn cada una dos clulas
hijas, as es que en cada perodo de divisin la poblacin se duplica.
La velocidad de crecimiento exponencial se expresa como tiempo de generacin (G) y este
se define como el tiempo que tarda una poblacin en duplicarse. Los tiempos de generacin
varan ampliamente entre los microorganismos, algunos crecen rpidamente y presentan
Pre-

tiempos de generacin de unos 30 minutos y otros tienen tiempos de generacin de varias
horas o incluso das.
Parmetros del crecimiento
Cuando se inocula una bacteria en un medio y ha transcurrido el tiempo de generacin de

este microorganismo, se forman dos clulas, despus de otra generacin cuatro clulas
despus de la tercera generacin ocho clulas.
Figura 2. La velocidad de crecimiento de un cultivo microbiano. (a) Datos de una poblacin

que se duplica cada 30 minutos. (b) Datos representados en escala aritmtica (ordenada
izquierda) o en escala logartmica (ordenada derecha).
Es decir en cada generacin sucesiva se duplica la poblacin. La relacin que existe entre el
nmero de clulas y las generaciones de un cultivo creciendo en forma exponencial, puede
deducirse matemticamente de la manera siguiente:
Pre-

Si se sustituye en la ecuacin anterior log 2 por su valor 0.3010, se tiene que 1/0.3010 = 3.3
n = 3.3 log y/x
Por consiguiente, aplicando la ecuacin anterior puede calcularse el nmero de generaciones
que han tenido lugar, siempre que se conozca la poblacin inicial x, y la poblacin y despus
del tiempo t.
El tiempo de generacin G es igual a t (tiempo transcurrido en fase exponencial para llegar
de x a y) dividido por el nmero de generaciones n, o sea:
G= t/n
Curva de crecimiento
En un sistema cerrado o cultivo en medio no renovado, tambin conocido como cultivo

monofsico, se obtiene una curva de crecimiento tpica como la que se indica en la siguiente
figura.
Pre-

Figura 3. Curva de crecimiento tpica de una poblacin bacteriana.
Esta curva de crecimiento puede dividirse en distintas fases llamadas fase de latencia, fase
exponencial, fase estacionaria y fase de muerte.
Fase de latencia
Cuando una poblacin bacteriana es inoculada en medio fresco, el crecimiento usualmente

no comienza de inmediato sino despus de un tiempo llamado de latencia, que puede ser
corto o largo dependiendo de las condiciones.
La fase de latencia representa un periodo de transicin para los microorganismos cuando
son transferidos a una nueva condicin. En esta fase se producen las enzimas necesarias
para que ellos puedan crecer en un nuevo medio ambiente. En esta fase no hay incremento
en el nmero de clulas, pero hay gran actividad metablica, aumento en el tamao
individual de las clulas, en el contenido proteico, ADN y peso seco de las clulas.
Si un cultivo que est creciendo en fase exponencial es inoculado al mismo medio de cultivo
bajo las mismas condiciones de crecimiento, no se observa fase de latencia y el crecimiento
exponencial sigue a la misma velocidad. Si el inoculo se toma de un cultivo viejo (fase
estacionaria) y se inocula en el mismo medio, generalmente se presenta la fase de latencia
esto se debe a que las clulas generalmente agotan una serie de coenzimas esenciales u
otros constituyentes celulares y se requiere cierto tiempo para su resntesis. Tambin se
observa latencia cuando el inculo est formado por clulas que han sido daadas pero no
muertas, bien sea por tratamiento con calor, radiaciones o sustancias qumicas, puesto que
requieren reparar dicho dao. En el caso de que una poblacin se transfiera de un medio de
cultivo rico a un medio pobre, se observa latencia puesto que es necesario que las clulas
para poder seguir creciendo tengan una serie de enzimas para poder sintetizar algunos
metabolitos esenciales que no estn presentes en el medio.
Pre-

Fase exponencial o fase logartmica
Es el perodo de la curva de crecimiento en el cual el microorganismo crece

exponencialmente, es decir que cada vez que pasa un tiempo de generacin la poblacin se
duplica. Bajo condiciones apropiadas la velocidad de crecimiento es mxima. Las
condiciones ambientales (temperatura, composicin del medio de cultivo, etc.) afectan a la
velocidad de crecimiento exponencial.
Fase estacionaria
En cultivos en recipientes cerrados una poblacin no puede crecer indefinidamente en forma

exponencial. Las limitaciones del crecimiento ocurren ya sea por agotamiento de algn
nutriente esencial, por acumulacin de productos txicos, porque se alcance un nmero de
clulas elevado para el espacio disponible o por una combinacin de las causas anteriores.
Este periodo durante el cual cesa el crecimiento se conoce como fase estacionaria.
Fase de muerte
Si la incubacin contina despus de que una poblacin microbiana alcanza la fase

estacionaria, las clulas pueden seguir vivas y continuar metabolizando, pero va a comenzar
una disminucin progresiva en el nmero de clulas viables y cuando esto ocurre se dice que
la poblacin ha entrado en fase de muerte.
Medicin del crecimiento bacteriano
El recuento de microorganismos es la determinacin del nmero de microorganismos

presentes en una muestra. Frecuentemente es conveniente su determinacin pero adems
de la dificultad que presentan los resultados no permiten excesiva fiabilidad.
El crecimiento microbiano se mide por cambios sucesivos en el nmero de clulas o por el
aumento de peso de la masa de las clulas. Hay varios mtodos para enumerar las clulas o
estimar la masa de stas.
Cuantificacin de productos
Rendimiento del crecimiento y efectos de un nutriente limitante
Cuando el crecimiento bacteriano est limitado por una concentracin baja de un nutriente
esencial, el crecimiento neto final o rendimiento celular aumenta con la cantidad inicial del
nutriente limitante. sta es la base de los bioanlisis para cuantificar vitaminas y otros
factores de crecimiento. La velocidad de crecimiento aumenta tambin con la concentracin
del nutriente, pero de manera hiperblica. La forma de la curva parece que refleja el grado de
captacin de un nutriente por las protenas microbianas transportadoras. A niveles de
nutrientes suficientemente altos, los sistemas de transporte se saturan y la velocidad de
crecimiento no sigue aumentando con la concentracin del nutriente.
Pre-

La cantidad de masa microbiana producida a partir de un nutriente puede expresarse
cuantitativamente como rendimiento del crecimiento. (Y, yield).
Y = masa de microorganismos formada

masa de sustrato consumido
Y se expresa en gramos de clulas formadas por gramo de sustrato utilizado, o como

rendimiento molar del crecimiento (gramos de clulas por mol de nutriente consumido), esto
es un ndice de eficacia de conversin de nutrientes en materia celular.
Nucleasa Termoestable
S. aureus produce una nucleasa termoestable con mayor rapidez y en mayor cantidad que la
enterotoxina responsable de la intoxicacin. La endonucleasa puede detectarse
experimentalmente como un ndice de la presencia de S. aureus incluso en concentraciones
demasiado bajas para que hayan producido unas cantidades detectables de enterotoxina.
Lisado de Limulus
Usado para deteccin de endotoxinas (derivadas del lipopolisacrido LPS de las bacterias
Gram negativas). Se basa en la aglutinacin de extractos de amebocito de sangre de Limulus
(cangrejo de mar) producido por cantidades del orden de picogramos de LPS. Puede
detectar 300 clulas de E. coli. El mtodo detecta clulas viables y no-viables. Es muy
rpido.
Sondas de cidos Nucleicos
Sirven para identificar microorganismo desconocidos por medio de Southern.
PCR
Mtodo para detectar nmero extremadamente bajos de microorganismos con una cierta
rapidez basada de la produccin de copias de genes especficos de un microorganismo en
cuestin.
Medida de ATP
Se detecta la presencia de ATP usando luciferasa, aunque hay algunos problemas

experimentales que hacen que la tcnica sea controvertida.
Radiometria
Medida de la transformacin de un substrato con 14C en 14CO2: el tiempo necesario para

detectar el 14CO2 es inversamente proporcional a la cantidad de microorganismos presente.
Pre-

Substratos Fluoro y Cromognicos: Se aaden como aditivos a los medios de cultivos
para facilitar y acelerar la deteccin de los microorganismos.
Recuento de microorganismos por Mtodos Directos
Antecedentes
El recuento de microorganismos es la determinacin del nmero de microorganismos

presentes en una muestra. Frecuentemente es conveniente su determinacin pero adems
de la dificultad que presentan los resultados no permiten excesiva fiabilidad.
Clasificacin de las tcnicas
1. Mtodos Indirectos
Son aquellos en los que no se encuentran el nmero de microorganismo sino que se calcula
a partir de otros parmetros. Los dividiremos en 3 grupos:
a) Determinacin analtica de molculas: pertenecientes al microorganismo. Por ejemplo:
protenas y ADN.
b) Mtodos Gravimtricos: basados en la determinacin del peso seco.
c) Mtodos Turbidimtricos: son los ms utilizados.
2. Mtodos Directos
En ellos a cada uno se considera una unidad. Hay 3 tipos:

a) Mtodos directos totales: determinacin del nmero de microorganismos vivos y
muertos. Son mtodos microscpicos y entre ellos destacamos:
Mtodo de Breed o recuento de extensiones teidas,
Mtodo de Wright
Mtodo de recuento en cmara.
b) Directos culturales: contabilizan nicamente los microorganismos vivos, el mas
utilizado: recuento de viables en placa.
c) Semidirectos totales: por medio de contadores electrnicos de partculas.
(Olivas, 2004)
Recuento microscpico directo
Este mtodo permite determinar el nmero de clulas microbianas, por observacin en el

microscopio. La muestra puede utilizarse tal cual, (si es lquida como leche o cultivos puros
en medio lquido), o puede prepararse una dilucin tal como se realiza para otros mtodos de
recuento. Se basa en contar microorganismos en una cantidad conocida de muestra
utilizando frotis coloreados, cmaras del tipo de las de contar glbulos, o las especialmente
Pre-

diseadas para contar hongos en alimentos como la cmara de Howard. Se determina el
nmero total de clulas presentes (viable y no viables) Ocasionalmente se pueden utilizar
colorantes que indiquen diferentes estados metablicos de las clulas. Por ejemplo en un
recuento en cmara de un cultivo de levaduras con azul de metileno, se pueden distinguir las
clulas viables (no absorben el colorante, se vern transparentes) de las no viables
(absorben el colorante y se vern azules) (Olivas, 2004).
Mtodo de Wright
Se marca sobre un portaobjetos limpio y desengrasado, un cuadrado de 1 cm de lado. Sobre
la superficie opuesta del portaobjetos, se deposita en el centro 0,01 mL de muestra ya sea
con ansa calibrada o con micropipeta. Se extiende por todo el cuadrado con ansa. Se deja
secar en posicin horizontal. Se fija y colorea, ya sea por Gram o con azul de metileno 1
minuto (mtodo de Breed para leche). Se observa por inmersin, contando los m.o. en cada
uno de varios campos. El nmero de campos a contar depende del nmero de m.o. por
campo y del factor del microscopio. Se transcribe la tabla que se propone para el recuento
directo en leche (Standard Methods for the Examination of Dairy Products APHA)
Nmero de campos a contar segn el factor del microscopio y el nmero de

microorganismos:
Microorganismos Factor del microscopio

por campo 300 000 400 000 500 000 600 000
Menos de 1 30 40 50 60
1 a 10 20 20 20 30
Ms de 10 10 10 10 20
Clculo del factor del microscopio
Con objetivo de 40 x, o 100 x, se mide el radio del campo utilizando un portaobjetos

calibrado, o el retculo de una cmara cuenta glbulos. Si se utiliza el de 40 x, luego debe
hacerse la correccin utilizando el factor 40/100 para llevarlo al aumento de trabajo.
Se calcula el rea del campo: r2
El nmero de campos por cm2 es: 1 / r2
Si se extendi en 1 centmetro cuadrado 0,01 mL de muestra, el nmero de campos por
mililitro, llamado Factor del Microscopio (FM), se calcula de la siguiente forma:
FM = 100 / r2 donde r se expresa en cm, o FM = 10000/ r2 con r en mm.
Una vez contado el nmero de m.o. en los campos que corresponde, se promedia, y
multiplica por el Factor del microscopio; de esa forma se obtiene el resultado que se expresa
en trminos de:
Recuento microscpico directo = N microorganismos por mL
Determinacin de la masa celular
Turbidimtrico
Pre-

Este mtodo da informacin sobre el contenido de macromolculas, y no sobre el nmero de
clulas. En el laboratorio de microbiologa se usa un colormetro, o un espectrofotmetro y se
mide la absorbancia de la suspensin de m.o. en comparacin con un blanco que es el
medio esterilizado, y sin sembrar. Cuanto mayor es el nmero de clulas en suspensin,
tanto menor es el porcentaje de luz que atraviesa el medio. Se cumple una ley similar a la de
Lambert-Beer y expresando la relacin en trminos de masa microbiana y absorbancia, la
ecuacin es la siguiente:
W
A= k x W:
donde:
A : Absorbancia
k: constante
W: masa celular
La grfica correspondiente construida con valores reales muestra una desviacin a medida
que aumenta la masa microbiana. Para utilizar la medida de la absorbancia como mtodo de
recuento, es necesario hacer para cada m.o. una curva de calibracin, midiendo el nmero
de m.o. por otro mtodo de recuento. El mtodo se emplea fundamentalmente para preparar
inculos, cuando se trabaja con cultivos puros (Fernndez E, 2000).
Recuento de clulas viables
En el recuento microscpico directo se cuentan tanto clulas vivas como muertas, pero en
muchos casos nicamente interesa contar clulas viables.
Pre-

Figura 4. Dos mtodos de realizar una determinacin de clulas viables (recuento en placa).
En cada caso la muestra se diluye normalmente antes de sembrar.
Se define como clula viable, aquella clula que es capaz de dividirse y forma una progenie y
la manera usual para realizar un recuento de clulas viables es determinando el nmero de
clulas en la muestra, capaces de formar colonias sobre un medio de cultivo slido (agar) y
esto se conoce como recuento en placa. En este procedimiento se realizan diluciones
seriadas de la muestra y se inoculan pequeos volmenes conocidos, de cada una de las
diluciones, en placas de Petri conteniendo un medio slido adecuado estril y se extiende
con una varilla de vidrio (mtodo de siembra en placa por extensin o diseminacin) o en
placas de Petri estriles a las cuales se les adiciona un medio slido fundido y enfriado a
45C y se mezclan bien (mtodo de siembra por incorporacin o de vertido en placa), luego
se incuban en las condiciones optimas hasta que aparezcan las colonias correspondientes.
Se asume que cada colonia proviene de la divisin sucesiva de una sola clula, conociendo
el volumen sembrado y la dilucin de la cual proviene y contando el nmero de colonias en la
placa correspondiente se puede calcular el nmero de clulas viables en la muestra. Debido
a que es difcil saber si una sola bacteria dio origen a una colonia, se expresa usualmente el
nmero de clulas viables como unidades formadoras de colonias (UFC). Para realizar el
recuento se seleccionan las placas de la que contengan entre 25 y 250 colonias.
Pre-

Figura 5. Procedimiento para la determinacin de viables usando diluciones seriadas de la

muestra y el mtodo del vertido en placa.
Dilucin de las suspensiones celulares antes de la siembra en placa
En los dos mtodos sealados anteriormente es importante que el nmero de colonias que
aparezcan en las placas no sea demasiado grande, pues algunas colonias se podran
fusionar dando estimaciones errneas. Tambin es importante que el nmero de colonias no
sea demasiado bajo para que el clculo sea estadsticamente significativo. En la prctica, el
nmero de colonias por placa oscila entre 30 y 300.
Para obtener el nmero apropiado de colonias casi siempre se diluye la muestra. Como
raramente se sabe de antemano el nmero de clulas viables, normalmente se hace ms de
Pre-

una dilucin. Lo ms frecuente es realizar diluciones decimales de la muestra. En la mayor
parte de los casos se realizan diluciones seriadas para alcanzar la dilucin final deseada.
Fuentes de error en el recuento en placa
El nmero de colonias que se obtiene en una determinacin de viables no slo depende del
tamao del inculo sino tambin de lo adecuado que sea el medio de cultivo y de las
condiciones de incubacin, as como de la duracin de la incubacin. Las clulas
depositadas en la placa no se desarrollarn todas en colonias a la misma velocidad y si se
emplea un tiempo corto de incubacin, se obtendrn menos colonias de las posibles.
Adems, el tamao de las colonias vara y si se desarrollan colonias muy pequeas pueden
pasar desapercibidas en el recuento. Es habitual establecer las condiciones de incubacin
(medio, temperatura y tiempo) que permitan obtener el mayor nmero de colonias para un
determinado organismo y usar luego estas mismas condiciones. La determinacin de viables
puede ser sujeta a grandes errores y, si se desean recuentos precisos, han de hacerse con
cuidado y hacer las placas de las diluciones por duplicado. Hay que advertir que una
agrupacin de dos o ms clulas slo producir una colonia, de modo que el recuento de
viables ser errneamente menor. El recuento de viables se expresa a menudo como
unidades formadoras de colonias obtenidas, ms que como nmero de clulas viables.
Pese a estas dificultades, el recuento de viables suministra una buena informacin sobre el
nmero de clulas viables y este procedimiento se usa ampliamente. El mtodo tiene la
ventaja de una elevada sensibilidad: se pueden contar muestras con pocas clulas, lo que
permite una deteccin muy sensible de la contaminacin microbiana de productos o
materiales. Adems, el uso de medios selectivos y de ciertas condiciones de cultivo permite
contar, mediante la determinacin de viables, tipos celulares particulares en una poblacin
mixta de microorganismos.
Factores fsicos y qumicos que influyen en el crecimiento bacteriano
Temperatura: Cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento adecuada. Si

consideramos la variacin de la velocidad de crecimiento en funcin de la temperatura de
cultivo, podemos observar una temperatura mnima por debajo de la cual no hay crecimiento;
a temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la velocidad de crecimiento con
la temperatura de cultivo hasta que se alcanza la temperatura ptima a la que la velocidad es
mxima. Por encima de esta temperatura ptima, la velocidad de crecimiento decae
bruscamente y se produce la muerte celular.
El aumento de la velocidad de crecimiento con la temperatura se debe al incremento
generalizado de la velocidad de las reacciones enzimticas con la temperatura. Se denomina
coeficiente de temperatura a la relacin entre el incremento de la velocidad de reaccin y el
de temperatura. En trminos generales, la velocidad de las reacciones bioqumicas suele
aumentar entre 1.5 y 2.5 veces al aumentar 10C la temperatura a la que tienen lugar.
La falta de crecimiento a temperaturas bajas se debe a la reduccin de la velocidad de las
reacciones bioqumicas y al cambio de estado de los lpidos de la membrana celular que
pasan de ser fluidos a cristalinos impidiendo el funcionamiento de la membrana celular.
Pre-

La muerte celular a altas temperaturas se debe a la desnaturalizacin de protenas y a las
alteraciones producidas en las membranas lipdicas a esas temperaturas.
Es importante tener en cuenta que a temperaturas bajas, el metabolismo celular es lento y
las clulas paran de crecer; aunque suelen morir. Sin embargo, cuando la temperatura es
superior a la ptima, se produce la muerte celular rpidamente y las clulas no pueden
recuperar su capacidad de divisin si baja posteriormente la temperatura. Esto permite
esterilizar por calor y no por fro.
Hay varios tipos de microorganismos en funcin de sus temperaturas de crecimiento mnima,
mxima y ptima.
Tipo de Temperatura Temperatura Temperatura

microorganismo mnima ptima mxima
Mesfilo 5 - 15 30 - 45 35 47
Psicrfilo -5 + 5 12 - 15 15 20
Psicrtrofo -5 + 5 25 - 30 30 35
Termfilo 40 - 45 55 - 75 60 - 90
Los microorganismos psicrtrofos son mesfilos que pueden crecer a temperaturas bajas.
Por tanto, se les puede considerar como psicrfilos facultativos. Esto es importante desde el
punto de vista aplicado porque cuando se encuentran contaminando alimentos, son capaces
de crecer en condiciones de refrigeracin (4 - 8C) y de producir infecciones en los
consumidores del alimento (30 - 35 C).
pH
Es un parmetro crtico en el crecimiento de microorganismos ya que cada tipo de

microorganismo tiene un rango de pH en el que puede vivir adecuadamente, fuera de este
rango muere.
El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las clulas ya que, en
muchos casos, la obtencin de energa metablica depende de la existencia de una
diferencia en la concentracin de protones a ambos lados de la membrana citoplsmica.
El pH interno en la mayora de los microorganismos est en el rango de 6,0 a 8,0. Los rangos
de pH tolerables por diferentes tipos de microorganismos son, tambin, distintos. Hay
microorganismos acidfilos que pueden vivir a pH = 1.0 y otros alcalfilos que toleran pH =
10.0.
Hay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el pH del medio de
crecimiento suele tender a bajar durante el cultivo. Por otra parte, la bajada del pH del medio
que producen ciertos microorganismos les confiere una ventaja selectiva frente a otros
competidores. As, por ejemplo, las bacterias lcticas que producen grandes cantidades de
cido lctico como consecuencia de su metabolismo primario reducen el pH del medio a
valores inferiores a los soportables por otras bacterias competidoras (llegan a bajar el pH del
Pre-

medio hasta 4.5). De esta forma, las bacterias competidoras mueren y las lcticas se
convierten en la poblacin dominante.
La bajada del pH se puede deber a varios factores, uno de los cuales es la liberacin de
cidos orgnicos de cadena corta (frmico, actico, lctico) por ciertas bacterias.
En este sentido, hay que tener en cuenta que la accin bactericida de estos cidos orgnicos
de cadena corta es ms potente que la debida nicamente a la bajada del pH que producen.
Esto es, los cidos orgnicos de cadena corta son txicos para algunas bacterias por s
mismos.
El efecto letal del pH cido sobre los microorganismos tiene aplicacin en la conservacin de
alimentos acidificndolos. De esta forma, la adicin de cido actico en forma de vinagre
permite la conservacin de alimentos perecederos (escabeches, por ejemplo) y la produccin
de cidos en el curso de fermentaciones naturales permite alargar la vida de los alimentos
(coles fermentadas, por ejemplo).
Potencial redox
Nos indica la capacidad del substrato para aceptar o donar electrones, esto es: sus
caractersticas oxidantes o reductoras. Uno de los factores que intervienen en el potencial
redox, aunque no el nico, es la concentracin de oxgeno [O 2].
Hay microorganismos que requieren ambientes oxidantes para crecer, mientras que otros
necesitan ambientes reductores. El metabolismo de ambos tipos de microorganismos
presenta diferencias notables. El requerimiento de condiciones oxidantes o reductoras no
debe confundirse con la necesidad de presencia o ausencia de oxgeno para que se
produzca el crecimiento.
En general, cuando un microorganismo requiere un ambiente oxidante se dice que desarrolla
un metabolismo oxidativo (o respirativo) mientras que los microorganismos que requieren
ambientes reductores (o menos oxidantes) realizan un metabolismo fermentativo.
Un microorganismo es aerobio cuando necesita oxgeno para vivir y es anaerobio cuando o
bien no lo necesita (anaerobios facultativos como las bacterias entricas, o como
Saccharomyces cerevisiae; o anaerobios aerotolerantes como las bacterias lcticas) o
cuando muere en presencia de oxgeno (anaerobios estrictos como los clostridios).
Hay microorganismos que, aunque viven en presencia de oxgeno, no son capaces de
utilizarlo como aceptor final de electrones y deben desarrollar un metabolismo fermentativo
(los estreptococos, por ejemplo).
Por otra parte, hay microorganismos que pueden desarrollar ambos tipos de metabolismo.
Esto es: en presencia de oxgeno desarrollan un metabolismo oxidativo y en su ausencia,
fermentativo. El rendimiento de los procesos fermentativos es menor que el de los
respirativos: las bacterias y las levaduras producen menos biomasa cuando crecen
fermentando que cuando lo hacen respirando.
En el curso de ciertas reacciones metablicas redox se forman compuestos altamente
reactivos (radicales libres, formas superxido) que pueden daar las protenas, membranas y
cidos nucleicos produciendo la muerte de las clulas. Las clulas se defienden de estos
compuestos reactivos mediante las enzimas de: superxido dismutasa (SOD) y catalasa. Los
anaerobios estrictos carecen de SOD y de catalasa o tienen niveles muy bajos de estas
Pre-

enzimas de forma que no pueden sobrevivir en presencia de oxgeno. La deteccin de estas
enzimas tiene valor taxonmico (Madigan, et. al., 2004).
OBJETIVO GENERAL
Evaluar mediante diferentes mtodos el crecimiento bacteriano
Seleccionar y aplicar diversas tcnicas para determinar el crecimiento bacteriano.

Evaluar el crecimiento bacteriano por diversos mtodos.
Seleccionar mtodos adecuados de evolucin del crecimiento microbiano para casos
especficos.
Pipeta de 1 ml
Tubo de ensayo
Portaobjetos
Mechero
Equipo de tincin
Microscopio
Solucin salina estril
Medio de cultivo para el microorganismo
Suspensin del microorganismo
Azul de metileno
Cajas petri
Matraz Erlenmeyer de 250 y 500 ml
Tubos de ensaye de 13 x 100 con rosca estriles
Pipetas de 1 ml graduada estriles
Pipetas de 5 ml graduada estriles
Gradilla
Jeringas
Algodn
Papel peridico
Tripie
Autoclave (olla Express)
Incubadora
Plato caliente
Agar mtodo estndar
Caldo de tioglicolato
Solucin Salina Isotnica (S.S.I)
Pre-

METODOLOGA
Parte 1. Recuento directo en placa
1. Tomar 1ml de la solucin problema, homogeneizarla y aadirlo a 9 ml de solucin salina

estril (suspensin 1/10).
2. Homogeneizar.
3. Tomar 1ml y pasarlo a otro tubo con 9ml de solucin salina estril (suspensin 1/100).
4. Repetir la operacin.
5. De cada dilucin se siembran un mnimo de tres placas estriles. Depositar en cada una
6. 1ml del inculo correspondiente y agregar 10ml de medio de cultivo, imprimiendo un
movimiento de rotacin con el fin de homogeneizar la muestra.
7. Dejar solidificar e incubar a una temperatura adecuada segn el tipo de microorganismo.
8. Contar las placas cuyo nmero de colonias este entre 30300.
9. Hay que homogeneizar la muestra perfectamente.
10. El medio y las condiciones de cultivo deben ser las idneas para el microorganismo
estudiado.
Interpretacin de Resultados
En primer lugar se calcula la media aritmtica de las colonias contadas en las placas
seleccionadas, esta se multiplica por la inversa de la dilucin a la que se ha efectuado el
recuento, con lo que se obtendr el nmero de microorganismos viables por ml de muestra.
Parte 2. Cmara de Breed
Se basa en contar los microorganismos de un volumen determinado de suspensin de los

mismos tras la extensin y tincin de sta.
1. Marcar un porta un cuadrado de 1cm de lado con ayuda de papel milimetrado.

2. Invertir el porta y depositar en el cuadrado 10 _l de la suspensin.
3. Dejar secar al aire o en estufa.
4. Fijar a la llama.
5. Teir con azul de metileno 3 minutos.
6. Lavar, secar y observar con objetivo de inmersin.
7. Contar los microorganismos existentes en 25 campos distintos situados en la diagonal.
Interpretacin de Resultados
Para el clculo del microorganismo se tiene en cuenta:

Cada divisin del objetivo micromtrico mide 10mm (=0.01mm=0.001cm)
Pre-

Para determinar el nmero de campos microscpicos que exiten en la preparacin con la
formula:
Obtener el valor medio de organismos por campo microscpicos en 10 campos.

Calcular el nmero de bacterias que hay en la preparacin (0.01mL) y en 1mL del cultivo con
la frmula:
Diagrama de Flujo
Poner en 10 tubos Preparar el agar Esterilizar

de ensaye 9 mL de mtodo estndar y el material
S.S.I y en 25 tubos caldo
9.9 ml de S.S.I.
Tomar este tiempo como

Incubar el to. y hacer un recuento de Inocular en el
inoculo a 37 C clulas viables por el caldo (20 ml)
mtodo de diluciones Escherichia coli.
Obtener n, con n
Realizar un recuento El nmero de diluciones = 2logb/B, donde b
de clulas viables, varia dependiendo el es el nm Final de
mtodo de diluciones tiempo, se realizaron 5 y se microorganismos
a las 2, 4, 8, 16, 24, 36, sembraban las tres ms y B el inicial de
48, 72, 96 horas. diluidas
Obtener G = t/n donde t =

tiempo de duracin de la fase
logartmica y G es el tiempo
de generacin de la bacteria
Pre-

RESULTADOS
Pre-

PROCEDIMIENTOS APLICADOS
Anlisis microbiolgico de la leche, anlisis microbiolgico del agua
Antecedentes
Desde la antigedad se sabe que los alimentos son un excelente transmisor de
enfermedades infecciosas. Incluso hoy en da, a pesar de que existe mayor informacin
acerca de los microorganismos y su transmisin an as, sigue representando un gran
problema. El aumento de nuevos patgenos transmitidos por alimentos hace que los
consumidores seamos ms conscientes de dichas transmisiones y que exijamos alimentos
cada vez ms seguros. Por otra parte, el desarrollo microbiano destruye grandes cantidades
de alimentos, causando problemas econmicos y una considerable prdida de importantes
nutrientes. Por ello es importante la realizacin del monitoreo biolgico de dichos alimentos
logrado a partir de la realizacin de un anlisis microbiolgico. Por estas razones se plantea
en la siguiente unidad de trabajos experimentales, la realizacin de un anlisis microbiolgico
a un determinado alimento, teniendo como objetivo principal el adiestramiento del estudiante
ante la realizacin de ste tipo de exmenes de laboratorio comunes en la rutina de trabajo
en empresas alimentarias como parte de los esquemas de calidad necesarios en la
elaboracin de un producto. Cabe sealar que el procedimiento seguido para la elaboracin
de dicho anlisis microbiolgico se basa en los mtodos descritos por las Normas Oficiales
Mexicanas como; NOM-111-SSA1-1994, NOM-112-SSA1-1994, NOM-113-SSA1-1994,
NOM-114-SSA1-1994, NOM-121-SSA1-1994 entre otras.
De igual forma se plantea la realizacin de un anlisis microbiolgico de aguas (que se hace

necesario en la formacin acadmica del estudiante), de una muestra elegida por el alumno,
con el fin de determinar la carga microbiana presente en la muestra, debido a que el agua es
un compuesto vital para el ser humano y que de tanto su utilizacin como su consumo se
derivan una gran cantidad de enfermedades causadas por microorganismos patgenos. ste
anlisis microbiolgico ala igual que el anlisis realizado para los alimentos se fundamenta
en las Normas Oficiales Mexicanas como la NOM-230-SSA1-2002.
El anlisis microbiolgico de alimentos (leche y agua) no tiene carcter preventivo sino que
simplemente es una inspeccin que permite valorar la carga microbiana. Por tanto, no se
puede lograr un aumento de la calidad microbiolgica mediante el anlisis microbiolgico
sino que lo que hay que hace es determinar cules son los puntos de riesgo de
contaminacin o multiplicacin microbiana; base de la profilaxis y calidad posterior en la
manipulacin, transporte y manejo de alimentos tan importantes como lo son el agua y la
leche.
Para enjuiciar la calidad de las aguas se recurre a parmetros tanto fsicos como qumicos y
biolgicos Los parmetros bacteriolgicos tienen mayor importancia para dictmenes
higinicos ; es preciso hallar el nmero de grmenes saprfitos o de coliformes (tanto fecales
como totales) y de bacterias procedentes del intestino humano como indicadores de la
Pre-

contaminacin debido a que la calidad del agua es de vital importancia para el ser humano
ya que un agua libre de microorganismos representa un ndice menor de posibles infecciones
y por ende una mejor calidad de vida para el hombre. Por su parte alimentos como la leche
debido a sus mltiples sustancias constituyentes es un excelente medio de cultivo para
microorganismos. Por ello, la medidas para la determinacin del nmero de microorganismos
presentes en ella comienzan desde su recoleccin en el establo, hasta los diversos procesos
trmicos empleados para eliminar o frenar el crecimiento de los microorganismos.
Anlisis microbiolgico del agua
Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son bacilo gram negativos, inmviles o

mviles con flagelos pertricos se desarrollan en medios artificiales y todas las especies
forman cido o cido y gas a partir de glucosa. Su composicin antignica es un mosaico
que interrelaciona serolgicamente varios gneros y aun familias, muchas de estas bacterias
son parsitos de animales y otros patgenos. Para enjuiciar la calidad de las aguas se
recorre a parmetro fsico qumico y biolgico. Los parmetros bacteriolgicos tienen mayor
importancia para dictmenes higinicos; es preciso hallar el nmero de grmenes saprfitos
o de coliformes y de bacterias procedentes del intestino humano como indicadores de la
contaminacin. Conviene destacar la importancia que tienen las cifras de coli y coliformes,
pertenecientes a las enterobacterias que fermentan lactosa con produccin de gas y cido.
Para determinar el nmero de estas bacterias se suele emplearse un medio selectivo para
este tipo de bacterias.
Las bacterias coliformes son aquellas bacterias de morfologa bacilar, Gram (-), aerobias o
anaerobias facultativas, oxidasa negativas, no esporgenas, que fermentan la lactosa con
produccin de cido y gas a 37 C en un tiempo mximo de 48 horas.
Este grupo comprende los gneros Escherichia, Citrobacter, Kebsiella y Enterobacter,
pertenecientes a la familia Enterobacteriaceas. El mtodo consiste en la determinacin del
nmero de coliformes mediante siembra de distintos volmenes del agua a analizar en series
de tubos conteniendo medio de cultivo lquido lactosado y resiembra en medios de cultivo
selectivos con incubacin a temperaturas adecuadas. Se basa en la capacidad de estos
organismos para producir gas a partir de la lactosa. Se desarrollar solo la prueba presuntiva
que consiste en un procedimiento de criba en el que una reaccin negativa excluye la
presencia del grupo coliforme y una reaccin positiva indica su posible presencia.
Se recoge el agua a analizar en un recipiente esterilizado y se conserva en el frigorfico, un
mximo de 6 horas antes del anlisis.
Anlisis microbiolgico de la leche
l nmero total de microorganismos presentes en la leche o sus derivados por unidad de

volumen o de peso es indicativo de las condiciones sanitarias de produccin y conservacin,
as como de la vida comercial del producto. Recuentos bacterianos muy altos en leche cruda
son indicativos de fuerte contaminacin durante las operaciones de ordeo, manipulacin o
almacenamiento, o bien de conservacin a temperatura de refrigeracin insuficientes para
Pre-

retardar al crecimiento microbiano. En productos lcteos pasteurizados, altas cuentas
bacterianas indican deficiente procesamientos y/o mala conservacin.
Los valores obtenidos en los recuentos bacterianos de estos productos se toman como base
para su clasificacin en diferentes grados de calidad. De all la gran importancia que esta
determinacin reviste, tanto desde el punto de vista del control de calidad a nivel de las
industrias del ramo, como del control sanitario de las agencias gubernamentales.
Los mtodos comnmente utilizados para el recuento total de microorganismo en la leche y
sus productos son el macroscpico en placas de agar y el microscpico directo. Ambos
mtodos al igual que otras tcnicas microbiolgicas aplicadas a estos productos,
generalmente se rigen por las normas establecidas por la Asociacin Americana de Salud
Publica (Standard Methods for the Examination of Dairy Products) que a su vez han sido
recomendadas y traducidas por la Organizacin Panamericana de la Salud (Normas para el
Examen de Productos Lcteos).
Cuando las muestras de leche o derivados lcteos se destinan a anlisis de tipo
microbiolgicos, es necesario tomar una serie de precauciones que adems de garantizar la
obtencin de muestras verdaderamente representativas, eviten la contaminacin por fuentes
externas y la proliferacin de la carga bacteriana ya presente en los productos.
Entre esas precauciones destacan las siguientes:
a. Todos los equipos empleados en la toma de muestras deben encontrarse estriles y
desinfectados antes de cada recoleccin. Por ejemplo, para tomar varias muestras de
leche cruda puede emplearse un probador adecuado que se va esterilizando en un
bao de agua hirviente (1 minuto) o una solucin que contenga 250 a 500 ppm de cloro
residual (esterilizacin qumica) cuyo exceso se elimina por enjuague en agua estril a
fin de evitar que el desinfectante contamine el producto, donde actuara como inhibidor
microbiano.
b. Tomar precauciones para evitar la contaminacin externa, incluso de las manos de la
persona que hace la operacin.
c. Recolectar porciones representativas (no menos de 150 g) directamente de tanques,
recipientes de transporte o pesada, pero no de envases al por menor, los cuales deben
tomarse completos en numero proporcional al lote.
d. Tomar adems las precauciones sealadas para muestras destinada al anlisis fsico o
qumico (1:1) con el propsito de obtener, conservar e identificar muestras
representativas, excepto en lo que se refiere a la adicin de preservativos, los cuales
solo pueden adicionarse para recuentos bacterianos por el mtodo microscpico directo
(0,08 % de formaldehdo para un anlisis a efectuarse dentro de las 36 horas que
siguen a la recoleccin) pero nunca para otros exmenes microbiolgicos.
Las muestras de leche u otros derivados fluidos pasteurizados se pueden recolectar desde
varios puntos:
a. A la salida de la leche de la seccin de calentamiento o de enfriamiento del
pasteurizador.
b. Del tanque de almacenamiento donde se mantienen el producto ya pasteurizado antes
de ser envasado
c. De la envasadora despus del envasado, retirando un numero de envases
representativo del lote.
Pre-

Para leche pasteurizada se exige lo siguiente:
a. Recuentos de Aerobios Mesfilos: mximo: 2,0 x 10 4 ufc/mL
b. Coliformes Totales: mximo: 93 NMP/mL.
Por su parte la leche bronca se clasifica de acuerdo al contenido de microorganismos
Leche y sus procesos para la eliminacin de microorganismos
La leche tal como llega del establo (leche cruda) suele someterse a los siguientes
tratamientos (alternativos):
1. Pasteurizacin (o pasterizacin) Calentamiento progresivo del producto hasta 63-72
C.Antiguamente la operacin duraba 30 minutos pero en la actualidad este tiempo se ha
reducido hasta un cuarto de minuto al utilizar intercambiadores de placa. stos consisten,
en esencia, en una serie de placas acopladas con dos lquidos que circulan en
direcciones opuestas sin mezclarse: por un lado la leche y por otro el agua caliente. El
proceso industrial suele constar de cuatro fases:
a) Tratamiento trmico.
b) Mantenimiento de la leche en ambiente estril y refrigerado hasta el envasado
definitivo.
c) Homogeneizacin (disminucin mediante turbulencias y choques del tamao de las
partculas grasas).
d) Envasado (vidrio, plstico,breaks...).
2. UHT (ultra high temperature). Proceso similar a la pasterizacin, pero durante el que
prcticamente se llega a esterilizar la leche debido a la aplicacin de altas temperaturas
(entre 120 y 140C) durante un tiempo breve (entre escasos segundos y un minuto).
Existen dos procedimientos: calentamiento indirecto (muy similar a la pasterizacin, pero
trabajando con otros parmetros) y calentamiento directo, en el que la leche llevada
primero a 80C experimenta un choque trmico que lleva su temperatura hasta 140C.
Este choque trmico puede realizarse, a su vez, utilizando dos variantes distintas,
inyeccin de vapor sobrecalentado en la leche o, bien, por inyeccin de gotculas de
leche en vapor. El proceso industrial comprende las siguientes etapas:
a) Calentamiento de la leche hasta 80C.
b) Choque trmico.
c) Enfriamiento rpido de la leche recalentada.
d) Homogeneizacin.
e) Envasado (generalmente en breaks).
3. Esterilizacin. Destruye todos los microorganismos de la leche y sus esporas. Hace aos
se utilizaban los tratamientos discontinuos (botellas en autoclave), pero actualmente se
tiende a realizar el proceso en esterilizadores de flujo continuo. En autoclave tradicional
se llegaba a 30 minutos con temperaturas de 110C. En flujo continuo se llega a
segundos de contacto con el calor, con temperaturas de 145C. El contenido de las
botellas en el autoclave adquira color ligeramente parduzco y un regusto a quemado.
Por eso tenan poca aceptacin. Hoy da la leche UHT hace innecesaria la esterilizacin
total. En las leches pasterizadas hay un ligero descenso (10%) de vitamina B1 y de cido
flico junto a otro mayor de vitamina C (25%) respecto a la leche cruda. En las leches
UHT se mantienen estas prdidas y adems se registran prdidas del 10% en el
contenido de vitaminas B6 y B12. La accin del calor sobre las sustancias de la leche se
Pre-

traduce tambin en disminucin del pH, menor valor nutritivo, cambios organolpticos,
retraso de la coagulacin, prdidas de aromas y de sabores.
OBJETIVO GENERAL
Realizar dos tipos de anlisis microbiolgicos, de relevante importancia en el rea de

salud pblica.
Realizar un anlisis microbiolgico en cuanto al conteo de coliformes totales por medio

del mtodo de placa, en agua contaminada.
Determinar cualitativamente la presencia de coliformes fecales por el mtodo del nmero
ms probable.
Determinar la cualitativamente la presencia o ausencia de microorganismos en diferentes
muestras de leche (tanto bronca como pasteurizada), por medio de anlisis fsico-
microbiolgico.
0.5mL Alcohol
20mL de muestra de leche
Azul de metileno
Muestra de agua
Caldo lactosado
Agar bilis rojo violeta
18 Tubos con rosca de 18x150
3 Cajas petri desechables
1 matraz erlenmeyer de 250mL
15 tubos de ensaye de 12x75
1 gradilla
1 esptula
Incubadora
Autoclave
4 pipetas cerolgicas de 1mL
Pre-

METODOLOGA
Parte A. Determinacin de pH
1. Preparar el potencimetro de acuerdo con las instrucciones del aparato y haciendo la

calibracin con la solucin buffer de pH conocido (4 y 7).
2. Ajustar el control de temperatura del aparato a la temperatura de la muestra.
3. Medir el pH y anotar los resultados.
Parte B. Prueba de alcohol
1. En un tubo de ensayo colocar 5 mL de la muestra homognea y 5 mL de etanol. Tapar el

tubo.
2. Mezclar suavemente los lquidos invirtiendo el tubo 2 o 3 veces, sin agitacin.
3. Observar a contraluz e inclinando el tubo en varias direcciones si ha ocurrido floculacin
o coagulacin de la mezcla. Anotar las observaciones.
Parte C. Reduccin de azul de metileno
1. Colocar los tubos de ensayo estriles con sus tapones en la gradilla y adicionar a cada
uno 1 mL de la solucin de azul de metileno.
2. Con pipeta o medidor estril, colocar 10 mL de cada muestra a analizar en cada uno de
los tubos sin mezclar. Rotular.
3. Durante la preparacin de las diferentes muestras, los tubos pueden mantenerse en un
bao de agua fra (0 - 5 C) pero nunca por ms de 2 horas.
4. Una vez preparados todos los tubos, llevarlos al bao mara regulado a 36 C junto con
un tubo patrn (leche sin indicador). Cuando la temperatura de la muestra alcance 36
1 C, mezclar el contenido de los tubos por inversin (3 veces) para obtener perfecta
distribucin del colorante y de la crema; tapar el bao Mara para mantener los tubos al
abrigo de la luz.
5. Comenzar a contar el tiempo de reduccin (decoloracin) en el momento en que se
invierten los tubos y observar su color frecuentemente durante la primera media hora, sin
agitarlos. Una muestra se considera reducida cuando presenta 4/5 decoloradas.
Parte D. Lacto fermentacin
1. Colocar en tubos de ensayo rotulados 10 mL de cada muestra.

2. Tapar los tubos y llevarlos a una estufa de 36C durante 24 horas.
3. Pasado el tiempo de incubacin observar las caractersticas de la muestra y anotar las
observaciones. Clasificar las muestras de acuerdo con los tipos sealados.
Pre-

Diagrama de Flujo
Recuento en placa de coliformes totales
En los tres tubos de 18x150 se

depositan 9.9mL de S.S.I y al primero
se le agregan 0.1ml de muestra
problema, mientras que a los siguientes
se les agrega 0.1ml de tubo inmediato
anterior.
Se toma 1ml de cada tubo y se

transfiere a una caja petri esteril sobre la
que se vaca el agar a temperatura
adecuada, se dejan solidificar y se
incuban
Pre-

Nmero ms probable de coliformes fecales
Se preparan 15 tubos de ensaye con

aproximadamente 10 ml de caldo
lactosado c/u dentro de ellos se deposita
un tubo de 12x75
Se depositan 10mL (en los primeros 5

tubos) 1ml en los siguientes 5 tubos y
0.1mL en los ltimos 5 tubos de la
muestra de agua a analizar y se incuban.
Anlisis microbiolgico cualitativo de leche
Depositar 0.5mL de etanol en Agitar vigorosamente y

un tubo de ensaye y 5ml de la observar la formacin de
muestra de leche a analizar. grumos
Incubar por 20 minutos y Tomar 15ml de la muestra de leche en

observar el cambio de color otro tubo de ensaye y agregarle una
gota de azul de metileno
RESULTADOS:
Pre-

Nmero ms probable de coliformes fecales
Anlisis microbiolgico cualitativo de leche
CONCLUSIONES
Pre-

BIBLIOGRAFA


del Zulia.
Pre-

CONTROL DE MICROORGANISMOS 6


Pre-

Contenido Pgina
I. INTRODUCCIN 6
III. OBJETIVO 7
IV. METODOLOGIA 8
V. RESULTADOS. 9
V.1 Clculos 10
VI. DISCUSION. 11
Pre-

INTRODUCCIN
En la parte final de este manual se describe a otro de los anlisis microbiolgicos de rutina
que el estudiante de microbiologa deber saber realizar con efectividad debido a que forma
parte del trabajo diario en la industria farmacutica: El anlisis microbiolgicos de los
medicamentos debido a que por razones tanto sanitarias como econmicas, se hace
indispensable para la industria farmacutica implementar el control de la calidad ambiental
que asegure que los productos se fabriquen de manera uniforme y controlada, de acuerdo
con las normas de calidad adecuadas al uso que se pretende dar a los productos, conforme
a las condiciones exigidas para su comercializacin, y que cumplan satisfactoriamente los
requerimientos microbiolgicos, farmacolgicos y teraputicos.
Debido a la gran demanda de stos en la formulacin teraputica y a su caracterstica de ser

medicamentos especialmente riesgosos en su manipulacin, su fabricacin plantea requisitos
especiales para minimizar los riesgos de contaminacin microbiana, de partculas y de
pirgenos. La garanta de calidad reviste una importancia especial, y esta fabricacin debe
seguir estrictamente mtodos de preparacin y procedimientos establecidos y validados
cuidadosamente mediante la Farmacopea.
ANTECEDENTES
Calidad Microbiolgica
La calidad es el grado de excelencia que posee un producto, en qu grado es bueno para

cumplir su finalidad. Un producto ser de buena calidad cuando cubra los requisitos
establecidos por el cliente, rena las caractersticas esperadas por los consumidores, se
acoja a la legislacin vigente e incorpore a lo largo del tiempo todas las nuevas y cambiantes
exigencias.
La calidad puede medirse desde distintos puntos de vista, sin embargo, destacan los
relacionados con la calidad microbiolgica, debido a su relacin directa con la garanta en
cuanto a salud humana.
En este ambiente surge el trmino Calidad Microbiolgica, como un elemento de evaluacin
de la satisfaccin de los requisitos microbiolgicos que debe tener un producto, tanto desde
el punto de vista sanitario como comercial. Cuando es la salud del consumidor la que est
expuesta a un riesgo, la legislacin es severa
Concepto de Control Microbiolgico
Para alcanzar la calidad microbiolgica es necesario aplicar pasos ordenados a travs de la

cadena de produccin. A lo largo de esta cadena pueden ir sumndose fallos que llevan a
obtener un producto con caractersticas distintas a las deseadas por el consumidor y la
empresa. Por esta razn la garanta de esta calidad se basa en el control de la presencia y
multiplicacin de los microorganismos en el nicho ecolgico peculiar constituido por el
Pre-

sustrato que proporciona el producto y por el tipo de ambiente en que se conserva o
mantiene. Los problemas microbiolgicos suelen presentarse cuando no se alcanza el efecto
deseado por el procesado o por los sistemas de conservacin y esto suele ser consecuencia
de errores en la manipulacin o procesado. La deteccin de dichos errores, su rpida
correccin y prevencin en el futuro, son el principal objetivo de cualquier sistema de control
microbiolgico.
Anlisis microbiolgico de los alimentos
El anlisis microbiolgico de alimentos no tiene carcter preventivo sino que simplemente es

una inspeccin que permite valorar la carga microbiana. Por tanto, no se puede lograr un
aumento de la calidad microbiolgica mediante el anlisis microbiolgico sino que lo que hay
que hacer es determinar cules son los puntos de riesgo de contaminacin o multiplicacin
microbiana para que sean evitados siguiendo lo descrito por las Normas Oficiales Mexicanas.
La prevencin, por tanto, est en evitar manufacturar productos de baja calidad
microbiolgica y no en comprobar la calidad microbiolgica de los ya elaborados.
En el desarrollo del proceso de produccin y manipulacin del alimento hay que hacer un
anlisis del riesgo consistente en determinar el peligro para la salud humana de un factor
patgeno presente en un alimento y el medio de como puede reducirse ese riesgo. Este
riesgo depende de de la DMI (Dosis Mnima Infectiva) del microorganismo y de los valores
del mismo que se encuentren en el alimento; as mismo hay que valorar la carga inicial de
microorganismos en cada una de las raciones del alimento, y el nmero de raciones o partes
consumidas por la poblacin en un determinado tiempo.
Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un alimento, la
tcnica comnmente utilizada es la cuenta en placa. En realidad esta tcnica no pretende
poner en evidencia todos los microorganismos presentes. La variedad de especies y tipos
diferenciables por sus necesidades nutricionales, temperatura requerida para su crecimiento,
oxgeno disponible, etc., hacen que el nmero de colonias contadas constituyan una
estimacin de la cifra realmente presente y la misma refleja si el manejo sanitario del
producto ha sido el adecuado. Por otra parte el recuento de termoflicos, psicroflicos y
psicotrficos es importante para predecir la estabilidad del producto bajo diferentes
condiciones de almacenamiento. Para obtener resultados reproducibles y por lo tanto
significativos, es de suma importancia seguir fielmente y controlar cuidadosamente las
condiciones. Esta tcnica puede aplicarse para la estimacin de microorganismos viables en
una amplia variedad de alimentos. El fundamento de la tcnica consiste en contar las
colonias, que se desarrollan en el medio de eleccin despus de un cierto tiempo y
temperatura de incubacin, presuponiendo que cada colonia proviene de un microorganismo
de la muestra bajo estudio. El mtodo admite numerosas fuentes de variacin, algunas de
ellas controlables, pero sujetas a la influencia de varios factores.
La preparacin de la muestra alimenticia a analizar se es descrita en la Norma Oficial
Mexicana NOM-110-SSA1-1994, mientras que el procesos del recuento de mesfilos
aerobios (realizado en sta unidad de practicas experimentales) se encuentra en la NOM-
092-SSA1-1994.
Pre-

Anlisis microbiolgico del Agua
La vigilancia de la calidad del agua es fundamental para reducir los riesgos de transmisin de
enfermedades a la poblacin por su consumo, como las de tipo gastrointestinal y las
producidas por contaminantes txicos; esta vigilancia se ejerce a travs del cumplimiento de
los lmites permisibles de calidad del agua y complementariamente, inspeccionando que las
caractersticas de las construcciones, instalaciones y equipos de las obras hidrulicas de
captacin, plantas cloradoras, plantas de potabilizacin, tanques de almacenamiento o
regulacin, lneas de conduccin, redes de distribucin, cisternas de vehculos para el
transporte y distribucin y tomas domiciliarias protejan el agua de contaminacin y para el
caso de agua envasada, resulta eficaz para la evaluacin del control de callidad tanto en el
proceso de purificacin, transporte y manejo dentro de la empresa, as como su envasado. El
resultado de la verificacin e inspeccin de las caractersticas mencionadas, se evala
comparando las condiciones que presentan los sistemas de abastecimiento, con los
requisitos sanitarios que permiten preservar la calidad del agua.
Los microorganismos principales que se contemplan para determinar la cantidad de
contaminacin microbiolgica del agua son los miembros de la familia Enterobacteriaceae
son bacilo gram negativos, inmviles o mviles con flagelos. Peritricos se desarrollan en
medios artificiales y todas las especies forman cido o cido y gas a partir de glucosa,
muchas de estas bacterias son parsitos de animales y otros patgenos. Para enjuiciar la
calidad de las aguas se recorre a parmetro fsico qumico y biolgico. Los parmetros
bacteriolgicos tienen mayor importancia para dictmenes higinicos; es preciso hallar el
nmero de grmenes saprfilos o de coliformes y de bacterias procedentes del intestino
humano como indicadores de la contaminacin. El mtodo permite determinar el nmero de
microorganismos coliformes presentes en una muestra, utilizando un medio selectivo (agar
rojo violeta bilis) en el que se desarrollan bacterias a 35C en aproximadamente 24 h, dando
como resultado la produccin de gas y cidos orgnicos, los cuales viran el indicador de pH y
precipitan las sales biliares. El cual es descrito en la Norma Oficial Mexicana NOM-201-
SSA1-2002 y NOM-113-SSA1-1994.
Anlisis microbiolgico de frmacos
Dentro de la industria farmacutica existe una gran variedad de sustancias medicinales cuya
finalidad es mantener o restablecer la salud del hombre y de los animales domsticos.
Se sabe que los productos farmacuticos pueden llegar a ser contaminados por varios
elementos en diferentes puntos a lo largo de la lnea de manufactura; la carga microbiana de
los productos finales puede representar la contaminacin de las materias primas, de los
equipos con los cuales fueron elaborados, de la atmsfera, de las personas que operaron
durante el proceso o de los envases dentro de los cuales fueron empacados. Algunos de
estos contaminantes pueden ser patgenos, mientras que otros pueden desarrollarse en
presencia de preservativos y malograr el producto. Por lo que se plantea de igual manera el
anlisis microbiolgico de la presentacin farmacutica suspensin para determinar su
calidad en cuanto a su elaboracin se refiere.
Pre-

Por razones tanto sanitarias como econmicas, se hace indispensable para la industria
farmacutica implementar el control de la calidad ambiental que asegure que los productos
se fabriquen de manera uniforme y controlada, de acuerdo con las normas de calidad
adecuadas al uso que se pretende dar a los productos, conforme a las condiciones exigidas
para su comercializacin, y que cumplan satisfactoriamente los requerimientos
microbiolgicos, farmacolgicos y teraputicos. Todos los procedimientos para la evaluacin
de un frmaco se encuentran descritos en la farmacopea, cada procedimiento es diferente
segn el tratamiento previo que se le tenga que dar a la muestra, sin embargo, coinciden en
un punto en especfico para la determinacin de la cantidad de contaminantes
microbiolgicos presentes en alguna presentacin farmacutica; la determinacin de
mesfilos aerobios.
OBJETIVO GENERAL
Realizar un anlisis microbiolgico de diversas muestras de agua, un Frmaco y un

alimento; aplicando los conocimientos adquiridos durante el curso de microbiologa; as
como para determinar la actividad antimicrobiana de productos utilizados para el control
de microorganismos.
Analizar el contenido de mesfilas aerobios de una muestra de atn Tuny.

Analizar el contenido microbiolgico de mesfilas aerobios de una muestra de jugo
Ades.
Determinar la presencia de coliformes totales, por el mtodo en placa, tanto de agua
embotellada como de agua potable.
Verificar la accin bactericida y/o bacteriosttica del frmaco antisptico intestinal
Nifuroxazida en contra de la bacteria Escherichia coli.
Realizar un antibiograma para determinar el poder antisptico del frmaco Nifuroxazida
determinando la concentracin mnima inhibitoria de dicho compuesto.
Agar bilis verde brillante

Agar mtodos estndar
300mL de agua destilada
Escherichia coli (microorganismo aislado)
Staphylococcus aureus (microorganismo ya aislado)
2mL Suspensin Eskapar (principio activo slo nifuroxazida)
1mL Gotas Eyemo (solucin oftlmica estril)
1mL Suspensin de Neomicina
1mL Jugo Ades
Pre-

1 Lata de atn
1mL Agua potable
1mL Agua embotellada
1 Tubo de ensaye de 18X150
3 Tubos de ensaye de 15X150 con rosca (uno con 0.5mL se solucin salina , otro con 1mL
de solucin salina y uno ms con 1mL de agua destilada, previamente esterilizados)
1 Gradilla
26 Cajas petri
3 Matraz erlenmeyer de 125mL
2 Esptula
2 Probeta de 100mL
2 Asa de nicromo
1 bolsa de algodn
16 Pipetas serolgicas de 1mL (previamente esterilizadas)
Autoclave
Diagrama de Flujo
Parte 1. Recuento en placa de mesfilas aerobios (Anlisis microbiolgico de alimentos y

frmaco) NOM-092-SSA1-1994.
En tres tubos de ensaye Al primero Los siguientes

cada uno con 9.9ml de agregue 1mL de la tubos llevarn 0.1mL
agua destilada, se dilucin primaria de de la dilucin
deposita la muestra la muestra inmediata anterior
Incubar por 24 horas y Agregar la solucin En tres cajas petri

contar las UFC de agar mtodos estriles depositar
presentes (en caso de estndar, y mezclar 1mL de cada una
que se encuentren) hasta homogeneidad de las diluciones
Parte 2. Recuento de coliformes totales en placa (Anlisis microbiolgico de Aguas) NOM-

113-SSA1-1994.
Pre-

En tres tubos de ensaye Al primero Los siguientes

cada uno con 9.9ml de s. agregue 1mL de la tubos llevarn 0.1mL
s.i destilada, se deposita dilucin primaria de la dilucin
la muestra (1:10) de la muestra inmediata anterior
Incubar por 24 horas a Agregar la solucin En tres cajas petri

35C y contar las UFC de agar Bilis rojo estriles depositar
presentes (en caso de violeta, y mezclar 1mL de cada una
que se encuentren) hasta homogeneidad de las diluciones
Parte 3. Antibiograma (Determinacin del poder bactericida)
Realice el agar selectivo Depostelo sobre Con un tubo de

correspondiente para el una caja petri ensaye, esterilizado
crecimiento de la bacteria estril, y permita la a la flama realice
a utilizar solidificacin orificios sobre el agar
Incubar por 24 horas a Sobre cada pocillo Siembre a manera

35C y y determinar el vierta 200L de c/u de estra al MO al
dimetro del halo de de las dil. realizadas que el frmaco
inhibicin del frmaco elimina
RESULTADOS
Parte 1. Recuento en placa de mesfilas aerobios (Anlisis microbiolgico de

alimentos y frmaco)
Tabla 1. Recuento de mesfilos aerobios en placa para alimentos.
Alimento analizado Recuento de mesfilos aerobios

Pre-

Tabla 2. Recuento de mesfilos aerobios en placa para frmacos.
Frmaco analizado Recuento de mesfilos aerobios
Parte 2. Recuento de coliformes totales en placa (Anlisis microbiolgico de Aguas)
Tabla 2. Recuento de coliformes totales en placa para aguas.
Tipo de agua analizada Recuento de mesfilos aerobios
Parte 3. Antibiograma (Determinacin del poder bactericida)
Tabla 3. Determinacin del halo de inhibicin correspondiente a la actividad antimicrobiana

de frmacos antispticos.
Frmaco Microorganismo Dimetro del halo de Concentraciones

evaluado inhibido inhibicin respectivas
Escherichia coli
Staphylococcus
aureus
Pre-

BIBLIOGRAFA


del Zulia.
Pre-

Pre-

Bibliografa
Picazo, P. 2000. Procedimientos en Microbiologa Clnica. Recomendaciones de la Sociedad

Espaola de Enfermedades Infecciosas y Microbiologa Clnica.





del Zulia.
NOM-087-ECOL-SSA1-2000, Proteccin ambiental Salud ambiental - Residuos peligrosos

biolgico-infecciosos - Clasificacin y especificaciones de manejo.
http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Gram
http://microral.wikispaces.com/18.+Bacterias+acido-alcohol+resistentes.
http://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/general.php?Mostrar=baar

Manual de Microbiología

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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE QUERTARO

Laboratorio de microbiologa 591 724

Este laboratorio pretende capacitar al estudiante para la ejecucin, implementacin e

Las practicas se han programado en forma creciente de complejidad y tanto la

Es importante recalcar que es indispensable la integracin de los conocimientos y

Laboratorio de microbiologa 591 724

Reglamento del Laboratorio de Microbiologa

Unidad I. Higiene y Seguridad en el laboratorio de Microbiologa

Unidad II. Microscopa y Morfologa Microbiana

II. Tinciones simples y hmedas

III. Tinciones Diferenciales

IV. Utilizacin de colorantes vitales. Identificacin y descripcin de la

Unidad III. Manejo de cultivos puros

I. Preparacin y esterilizacin de material de vidrio y medios de cultivo

II. Seleccin de medios de cultivo

III. Verificacin de la eficacia de esterilizacin: Recuento de mos

IV. Cultivo Puro de microorganismos

V. Conservacin de cultivos Puros

Unidad IV. Obtencin e identificacin de cultivos puros

Laboratorio de microbiologa 591 724

II. Recuento de microorganismos por Mtodos Directos

III. Anlisis microbiolgico de la leche, anlisis microbiolgico del agua

Unidad VI. Control de microorganismos

I. Determinacin del efecto de agentes qumicos

Laboratorio de microbiologa 591 724

Unidad I. Higiene y Seguridad en el laboratorio de Microbiologa

1. Elaborar un reglamento sobre seguridad e higiene en el laboratorio de microbiologa.

Unidad II. Microscopa y Morfologa Microbiana

Harn el estudio microscpico de los microorganismos procariotes y eucariotes, adems

1. Realizaran tinciones simples. Identificacin y descripcin de morfologa y agrupaciones

Laboratorio de microbiologa 591 724

Cultivaran y conservaran adecuadamente cepas puras de bacterias y hongos.

1. Preparacin y esterilizacin de material de vidrio y medios de cultivo; seleccionaran de

Unidad IV. Obtencin e identificacin de cultivos puros

Aislaran e identificaran cultivos puros de bacterias y hongos.

1. Aislamiento de microorganismos por diferentes tcnicas.

Laboratorio de microbiologa 591 724

Unidad V. Evaluacin del crecimiento bacteriano

Seleccionaran y aplicaran diversas tcnicas para determinar el crecimiento microbiano.

1. Recuento de microorganismos mediante mtodos directos: Microscopio, masa celular,

Unidad VI. Control de microorganismos

Seleccionaran y aplicaran agentes qumicos y fsicos para propiciar e inhibir el desarrollo

1. Determinacin del efecto de algunos agentes fsicos sobre los microorganismos

Laboratorio de microbiologa 591 724

Laboratorio de microbiologa 591 724

Fecha: marzo 2008 Fecha: Fecha:

Laboratorio de microbiologa 591 724

Laboratorio de microbiologa 591 724

El manejo sin riesgos de un laboratorio es responsabilidad del encargado. Esta

ANTECEDENTES Y CONOCIMIENTOS PREVIOS

Clasificacin de los agentes biolgicos por grupos de riesgo

Laboratorio de microbiologa 591 724

La seguridad biolgica se fundamenta en tres elementos:

Laboratorio de microbiologa 591 724

Manejo de residuos peligrosos biolgico-infecciosos

Laboratorio de microbiologa 591 724

Figura 1. Tabla 2 en la cual se indica la separacin de residuos biolgico-infecciosos.

Elaborar un reglamento sobre la seguridad e higiene en el laboratorio de microbiologa.

Parte A. Reglamento Interno del Laboratorio

Laboratorio de microbiologa 591 724

Parte B. Disposiciones Federales

Parte A. Reglamento Interno del Laboratorio

Propuesta del reglamento de Laboratorio