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UNIVERSIDAD PRIVADA
SAN JUAN BAUTISTA
ASIGNATURA : BIOQUIMICA
CICLO : III
ICA - PER
2016
ESPECTOFOTOMETRIA
Es un mtodo cuantitativo de anlisis qumico que utiliza la luz para medir las concentraciones
de las sustancias qumicas. Es la medicin de la cantidad de energa radiante que absorbe o
transmite un sistema qumico en funcin de la longitud de onda.
Espectrofotmetro:
El espectrofotmetro: Realiza anlisis cuantitativos empleando mtodos instrumentales.
Es un instrumento que permite comparar la radiacin absorbida o transmitida por una solucin
que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de
sustancia.
Son tiles debido a la relacin de la intensidad de color en una muestra y su relacin a las
cantidades de soluto dentro de la muestra.
Historia de la espectrofotometra
El espectrofotmetro se invent en 1940, por Arnold J. Beckman y sus colegas en los
Laboratorios National Tecnologies, la empresa de Beckman haba empezado en 1935. Fueron
conducidos por el lder del proyecto Howard H. Cary. El espectrofotmetro fue el mayor
descubrimiento de la compaa.
a) Longitud de onda (l): es la distancia entre dos mximos de un ciclo completo del
movimiento ondulatorio. Se expresa, segn el S.I. en nanmetros (nm) y sus equivalencias son:
1nm = 1mm =10 A0 = 10-9 m.
c) Fotones: la luz est formada por fotones, y estos son paquetes discontinuos de E. La E de
un fotn depende de la frecuencia y de la longitud de onda, segn la siguiente expresin: E = h
x n = h x c/n (h = Cte. de Planck = 6,62.10-27erg/seg.). La Energa Electromagntica se mide el
Ergios. La relacin entre la longitud de onda y la Energa es inversa, por lo tanto a menor
longitud de onda mayor Energa y viceversa.
En la Regin Visible, la luz se descompone en colores. La luz blanca contiene todo el espectro
de longitudes de onda. Si interacciona con una molcula puede ser dispersada o absorbida.
2. FENMENOS DE INTERACCIN ENTRE LUZ Y MATERIA
A. FENMENO DE ABSORCIN
Espectro de Absorcin. Cada especie absorbente, que recibe el nombre de cromgeno, tiene
un determinado espectro de absorcin. El espectro de absorcin es un grfico donde se
representa en ordenadas la Absorbancia y en abcisas la longitud de onda. La medida de la
cantidad de luz absorbida por una solucin es el fundamento de la espectrofotometra de
absorcin.
Por eso es importante trabajar a la longitud de onda a la que la sustancia estudiada absorbe la
mayor cantidad de luz (a mayor cantidad de luz, mayor cantidad de sustancia).
B. FENMENO DE EMISIN
Algunos compuestos, tras ser excitados por la luz, vuelven al estado fundamental produciendo
la emisin de energa radiante. En este caso, lo que se mide es la energa emitida y, en este
fenmeno se basa la fotometra de llama o la fluorescencia.
3. LEYES DE ABSORCIN
Cuando un haz de luz pasa a travs de un medio, se registra una cierta prdida de intensidad,
debido a la absorcin por parte de la sustancia.
T = Is / I0 ; %T = (Is / I0 ) x 100.
Se puede perder intensidad por la interaccin con la cubeta o el solvente. Para evitar este
error se hace una primera medida con una solucin de referencia o BLANCO, que contiene
todos los posibles compuestos que intervienen en la lectura menos el que vamos a medir.
Todas las medidas que se hagan con posterioridad sern referidas a esta medida inicial y se
harn en la misma cubeta que se utiliz en la medida del blanco.
- Si el %T = 0 A = 2-log 0 =
En los aparatos que se usan actualmente se presentan absorbancias, pero el aparato lo que mide
realmente es %T que luego transforma a absorbancia.
A = e . b. c
Siendo:
A: absorbancia. No tiene unidades.
Hay que tener en cuenta la LINEALIDAD, que es el intervalo de concentraciones del cromgeno
entre las cuales existe una relacin lineal entre Absorbancia y Concentracin.
Cuando la concentracin del cromgeno sobrepasa los lmites de linealidad se deja de cumplir la
Ley de Beer, convirtindose la recta en una curva. La lectura de la Absorbancia fuera de los
lmites de linealidad se traduce en una concentracin falsamente baja de cromgeno. En esta
situacin, hay que diluir la muestra para que su concentracin entre en los lmites de la linealidad.
4. ESPECTROFOTMETRO
Se distinguen dos tipos de aparatos:
Fotmetro o Colormetro: se caracterizan porque utilizan filtros que solo permiten el paso
de una determinada longitud de onda.
Tipos de lmparas:
- Lmparas de filamento de tungsteno: se utilizan para longitudes de onda del espectro
visible y el ultravioleta prximo. Son fuentes de un espectro continuo de energa radiante
entre 360-950 nm.
Precauciones:
- Las subidas y bajadas bruscas de tensin producen sufrimiento de la lmpara y cambios en
las lecturas de la Absorbancia.
- La lmpara tiene una vitalidad limitada y se debe vigilar para que funcione bien el aparato.
2. Rendija de entrada: tiene como funcin reducir al mximo la luz difusa y evitar que la luz
dispersa entre en el sistema de seleccin de longitud de onda.
3. Monocromadores. Pueden ser:
- Prismas: son fragmentos con forma de cua de un material que permite el paso de la luz. Ej. De
vidrio para trabajar en el espectro visible o cuarzo para trabajar en el ultravioleta lejano.
- Redes de difraccin: son un gran nmero de lneas paralelas situadas a distancias iguales entre s
y son hendiduras sobre un vidrio o una superficie metlica. Cada una de estas hendiduras se
comporta como un pequeo prisma.
4. Rendija de salida: tiene como funcin impedir que la luz difusa atraviese la cubeta de la
muestra, que provocara desviaciones a la Ley de Beer. (04/10/01)
Es una lmina de Cobre sobre la que se extiende una capa de Selenio o de xido de Cobre. A
sto se le conoce como semiconductor. Sobre el semiconductor hay una capa de metal
transparente que sirve de electrodo. La luz incide sobre el Selenio y ste desprende electrones,
que pasan a la placa de Cobre originando una diferencia de potencial por existir carga negativa
sobre el Cobre y positiva sobre el Selenio. El conjunto se conecta a un ampermetro que seala
el paso de corriente.
Caractersticas:
son resistentes; econmicas; sensibles desde el ultravioleta hasta los 1.000 nm. de longitud de
onda; no se requiere batera externa, ni vaco,...; la corriente producida es directamente
proporcional a la Energa que llega y tienen efecto fatiga, es decir, que presentan una subida
inicial de corriente, que luego decrece progresivamente hasta el equilibrio. Por eso hay que
esperar entre 30-60 segundos entre una lectura y otra.
B. Fototubos multiplicadores:
Un fototubo multiplicador es un tubo que contiene un ctodo que emite electrones de forma
proporcional a la Energa que incide sobre l. Tiene un nodo que recoge los electrones y la
corriente se multiplica varias veces al chocar los electrones sobre sucesivos nodos que van
teniendo un voltaje superior al precedente. La seal se amplifica en cientos o miles de veces.
Caractersticas:
el tiempo de respuesta es muy rpido, no tienen efecto fatiga tan altos como la anterior y
son muy sensibles.
7. Medidor: son sistemas de lectura de la Energa elctrica que recoge el detector y que puede
ser lectura directa (se utiliza una clula fotovoltaica) o puede ser amplificadores de seal como
en el caso del fototubo multiplicador. Los actuales aparatos incorporan lectura digital y clculos
automticos de concentraciones con relacin a las curvas de calibracin.
PRINCIPIO DE LA ESPECTROFOTOMETRA
En la espectrofotometra se aprovecha la absorcin de radiacin electromagntica en la zona
del ultravioleta y visible del espectro. La muestra absorbe parte de la radiacin incidente en este
espectro y promueve la transicin del analito hacia un estado excitado, transmitiendo un haz de
menor energa radiante. En esta tcnica se mide la cantidad de luz absorbida como funcin de
la longitud de onda utilizada. La absorcin de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas
depende de la estructura de las molculas, y es caracterstica de cada sustancia qumica.
Por ejemplo, en un vaso de vidrio tenemos agua con azcar disuelta y en otro vaso tenemos la
misma cantidad de agua pero con mayor cantidad de azcar en solucin. El detector es una celda
fotoelctrica, y lo que se mide es la concentracin de la solucin de azcar.
Segn la ley de Beer, si hiciramos que un rayo de luz atravesara el primer vaso, la cantidad de
luz que saldra del otro lado sera mayor que si repitiramos esto en el segundo, ya que en este
ltimo las ondas electromagnticas chocan contra un mayor nmero de tomos o/y molculas y
son absorbidos por estos.
Ley de Lambert
La Ley de Lambert dice que la cantidad de luz absorbida por un objeto depende de la distancia
recorrida por la luz.
Por ejemplo, retomando el ejemplo de los vasos, pensemos que ambos tienen la misma cantidad
de agua y la misma concentracin de azcar; pero el segundo tiene un dimetro mayor que el
otro.
Segn la ley de Lambert, si hiciramos que un rayo de luz atravesara el primer vaso, la cantidad
de luz que saldra del otro lado seria mayor que si repitiramos esto en el segundo, ya que en
este ltimo las ondas electromagnticas chocan contra un mayor nmero
de tomos o/y molculas y son absorbidos por estos, tal como se explic en la ley de Beer.
Ley de Bouguer-Beer-Lambert
Una ley muy importante es la de Bouguer-Beer-Lambert (tambin conocida como ley de
Lambert Bouguer y Beer), la cual es solo una combinacin de las citadas anteriormente.
Transmitancia y absorcin de las radiaciones
Por las leyes mencionadas anteriormente, al hacer pasar una cantidad de fotones o de
radiaciones hay una prdida que se expresa con la ecuacin:
It/Io=T-kdc''
donde It es la intensidad de luz que sale de la cubeta y que va a llegar a la celda fotoelctrica
(llamada radiacin o intensidad transmitida); Io es la intensidad con la que sale al atravesar la
celda (radiacin intensidad incidente), y la relacin entre ambas (T) es la transmitancia.
En el exponente, el signo negativo se debe a que la energa radiante decrece a medida que el
recorrido aumenta. El superndice k es la capacidad de la muestra para la captacin del haz del
campo electromagntico, d es la longitud de la cubeta de espectrofotometra que recorre la
radiacin, y c es la concentracin del soluto en la muestra ya ubicada en la cubeta.
La ecuacin simplificada de la ley de Lambert-Beer
A = .d.c
A= log 1/T
lo que es igual a:
A= -log T
Las ecuaciones mencionadas de las leyes son vlidas solo y solo si:
Aplicaciones
Las aplicaciones principales son:
Tipos de espectrofotometra