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Ao de la Consolidacin del Mar de Grau

UNIVERSIDAD PRIVADA
SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD : CIENCIAS DE LA SALUD


DOCENTE : MORALES CARCELEN ROXANA
INTEGRANTES : DIAZ PALOMINO, MARIA CLAUDIA
GASTELU VENTURA, YANIRA K.
RAMIREZ ORTEGA, SHIRLEY LUCERO
PACHECO ,ELIZABETH

ASIGNATURA : BIOQUIMICA
CICLO : III

ICA - PER
2016
ESPECTOFOTOMETRIA

Es un mtodo cuantitativo de anlisis qumico que utiliza la luz para medir las concentraciones
de las sustancias qumicas. Es la medicin de la cantidad de energa radiante que absorbe o
transmite un sistema qumico en funcin de la longitud de onda.

Espectrofotmetro:
El espectrofotmetro: Realiza anlisis cuantitativos empleando mtodos instrumentales.

Es un instrumento que permite comparar la radiacin absorbida o transmitida por una solucin
que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de
sustancia.

Son tiles debido a la relacin de la intensidad de color en una muestra y su relacin a las
cantidades de soluto dentro de la muestra.

Historia de la espectrofotometra
El espectrofotmetro se invent en 1940, por Arnold J. Beckman y sus colegas en los
Laboratorios National Tecnologies, la empresa de Beckman haba empezado en 1935. Fueron
conducidos por el lder del proyecto Howard H. Cary. El espectrofotmetro fue el mayor
descubrimiento de la compaa.

En la dcada de 1950 se comienza a utilizar el espectrofotmetro en E. U. este elimino el


comparador de color logrando as que los anlisis fuesen ms cuantitativos, confiables,
reproducibles e incrementando la precisin y la exactitud.
DISEOS:
Al principio, hubo problemas de rendimiento con el espectrofotmetro. Estos problemas
llevaron a cambios en el diseo.

Modelo B: utilizo prisma de cuarzo en lugar de un prisma de cristal.


Modelo c: Elevaron la resolucin de la longitud de onda en el ultravioleta
Modelo D: producido con una lmpara de hidrogeno y otras mejoras.

NATURALEZA DE LA RADIACIN ELECTROMAGNTICA


La Radiacin Electromagntica es una forma de Energa radiante que se propaga en forma de
ondas. En este fenmeno ondulatorio se define:

a) Longitud de onda (l): es la distancia entre dos mximos de un ciclo completo del
movimiento ondulatorio. Se expresa, segn el S.I. en nanmetros (nm) y sus equivalencias son:
1nm = 1mm =10 A0 = 10-9 m.

b) Frecuencia (n): es el nmero de ciclos por segundo. Es inversa a la longitud de onda. Su


frmula es: n = c/l, y se mide en ciclos por segundo o hertzios.

c) Fotones: la luz est formada por fotones, y estos son paquetes discontinuos de E. La E de
un fotn depende de la frecuencia y de la longitud de onda, segn la siguiente expresin: E = h
x n = h x c/n (h = Cte. de Planck = 6,62.10-27erg/seg.). La Energa Electromagntica se mide el
Ergios. La relacin entre la longitud de onda y la Energa es inversa, por lo tanto a menor
longitud de onda mayor Energa y viceversa.

d) Espectro Electromagntico: cubre un amplio intervalo de E radiante, desde los rayos g de


longitud de onda corta hasta las ondas de radio, de longitud de onda larga. Se divide en varias
regiones, las ms interesantes para nosotros son:

Regin Ultravioleta: l = 10-380 nm

Regin Visible: l = 380-780 nm

Regin Infrarroja: l = 780-30.000 nm

En la Regin Visible, la luz se descompone en colores. La luz blanca contiene todo el espectro
de longitudes de onda. Si interacciona con una molcula puede ser dispersada o absorbida.
2. FENMENOS DE INTERACCIN ENTRE LUZ Y MATERIA

A. FENMENO DE ABSORCIN

Cuando una partcula que se encuentra en estado de reposo o estado fundamental


interacciona con un haz de luz, absorbe E y se transforma en una partcula en estado excitado.
La molcula absorbe la E de la onda y aumenta su energa, y ese aumento de energa es igual
a la E de la Radiacin Electromagntica absorbida (E = h.n). La partcula en estado excitado
tiende a volver de forma espontnea a su estado de reposo desprendiendo la E absorbida en
forma de calor.

Espectro de Absorcin. Cada especie absorbente, que recibe el nombre de cromgeno, tiene
un determinado espectro de absorcin. El espectro de absorcin es un grfico donde se
representa en ordenadas la Absorbancia y en abcisas la longitud de onda. La medida de la
cantidad de luz absorbida por una solucin es el fundamento de la espectrofotometra de
absorcin.

Por eso es importante trabajar a la longitud de onda a la que la sustancia estudiada absorbe la
mayor cantidad de luz (a mayor cantidad de luz, mayor cantidad de sustancia).

B. FENMENO DE EMISIN

Algunos compuestos, tras ser excitados por la luz, vuelven al estado fundamental produciendo
la emisin de energa radiante. En este caso, lo que se mide es la energa emitida y, en este
fenmeno se basa la fotometra de llama o la fluorescencia.

3. LEYES DE ABSORCIN

Cuando un haz de luz pasa a travs de un medio, se registra una cierta prdida de intensidad,
debido a la absorcin por parte de la sustancia.

Se llama TRANSMITANCIA (T) a la relacin entre la luz incidente y la luz transmitida:

T = Is / I0 ; %T = (Is / I0 ) x 100.

Se puede perder intensidad por la interaccin con la cubeta o el solvente. Para evitar este
error se hace una primera medida con una solucin de referencia o BLANCO, que contiene
todos los posibles compuestos que intervienen en la lectura menos el que vamos a medir.
Todas las medidas que se hagan con posterioridad sern referidas a esta medida inicial y se
harn en la misma cubeta que se utiliz en la medida del blanco.

La Transmitancia se usa poco, se emplea ms la Absorbancia (A) porque la relacin entre A y la


concentracin de una solucin es directamente proporcional y la de la T es inversamente
proporcional.
La relacin entre la absorbancia y la transmitancia es la siguiente:

- Si el %T = 100 A = 2-log T = 2-log 100 = 0

- Si el %T = 0 A = 2-log 0 =

En los aparatos que se usan actualmente se presentan absorbancias, pero el aparato lo que mide
realmente es %T que luego transforma a absorbancia.

3.1. LEY DE BEER


La absorbancia de una solucin es directamente proporcional a la concentracin y a la longitud del
paso de la luz.

A = e . b. c

Siendo:
A: absorbancia. No tiene unidades.

e: el coeficiente de extincin molar, tambin llamado coeficiente de absorcin. Es constante


para un compuesto dado siempre que se fijen condiciones de longitud de onda, de pH, de
temperatura, de solventes, etc. Sus unidades son 1/ (mol/cm).

b: es la longitud de paso de la luz, en cm.

c: es la concentracin del absorbente. Se mide en mol/L.

La aplicacin prctica de la Ley de Beer es, que conociendo la absorbancia de una


sustancia podemos averiguar su concentracin y esto lo podemos hacer de dos
formas:
1. Por comparacin con una solucin conocida: si tenemos 2 soluciones, una problema (P) y
una estndar (S), podemos establecer la siguiente relacin matemtica entre ellas:

2. A travs de una curva de calibracin: la curva de calibracin es la representacin grfica en


un eje de coordenadas de la Absorbancia (eje de ordenadas) frente a la Concentracin (eje de
abcisas). Se ensayan varias soluciones de concentracin conocida y se determinan sus A,
construyndose la curva de calibrado, que es una recta. Una vez ensayadas las soluciones
problemas, su concentracin se averigua por interpolacin de las A de las soluciones problema
en la curva de calibracin.

Hay que tener en cuenta la LINEALIDAD, que es el intervalo de concentraciones del cromgeno
entre las cuales existe una relacin lineal entre Absorbancia y Concentracin.

Cuando la concentracin del cromgeno sobrepasa los lmites de linealidad se deja de cumplir la
Ley de Beer, convirtindose la recta en una curva. La lectura de la Absorbancia fuera de los
lmites de linealidad se traduce en una concentracin falsamente baja de cromgeno. En esta
situacin, hay que diluir la muestra para que su concentracin entre en los lmites de la linealidad.

Empleo de los Factores de Calibracin: Para reactivos estables y sistemas fotomtricos


estables, este factor se puede mantener constante, siendo slo necesario ensayar las muestras
problema multiplicando la A resultante por el factor F.

4. ESPECTROFOTMETRO
Se distinguen dos tipos de aparatos:
Fotmetro o Colormetro: se caracterizan porque utilizan filtros que solo permiten el paso
de una determinada longitud de onda.

Espectrofotmetros: utilizan cromadores. Con ellos se obtiene un haz de luz


monocromtico cuya longitud de onda se vara a voluntad. Los monocromadores pueden ser
de dos tipos: prismas y redes de difraccin,Monocromador de Prisma.

2.2. COMPONENTES DEL ESPECTROFOTMETRO


1. Fuente de luz: proporciona energa radiante en forma de luz visible o no visible.

Tipos de lmparas:
- Lmparas de filamento de tungsteno: se utilizan para longitudes de onda del espectro
visible y el ultravioleta prximo. Son fuentes de un espectro continuo de energa radiante
entre 360-950 nm.

- Lmparas de filamentos de haluros de tungsteno: son de mayor duracin y emiten energa


radiante de mayor intensidad.

- Lmparas de Hidrgeno y Deuterio: producen un espectro continuo en la regin ultravioleta


entre 220-360 nm.

- Lmparas de vapores de Mercurio: Emiten un espectro discontinuo o espectro de lneas que


se utilizan para calibracin de longitudes de onda, se emplean solo para espectrofotmetros y
cromatografa HPLC.

Precauciones:
- Las subidas y bajadas bruscas de tensin producen sufrimiento de la lmpara y cambios en
las lecturas de la Absorbancia.

- La lmpara tiene una vitalidad limitada y se debe vigilar para que funcione bien el aparato.

2. Rendija de entrada: tiene como funcin reducir al mximo la luz difusa y evitar que la luz
dispersa entre en el sistema de seleccin de longitud de onda.
3. Monocromadores. Pueden ser:
- Prismas: son fragmentos con forma de cua de un material que permite el paso de la luz. Ej. De
vidrio para trabajar en el espectro visible o cuarzo para trabajar en el ultravioleta lejano.

- Redes de difraccin: son un gran nmero de lneas paralelas situadas a distancias iguales entre s
y son hendiduras sobre un vidrio o una superficie metlica. Cada una de estas hendiduras se
comporta como un pequeo prisma.

4. Rendija de salida: tiene como funcin impedir que la luz difusa atraviese la cubeta de la
muestra, que provocara desviaciones a la Ley de Beer. (04/10/01)

5. Cubeta: es el recipiente donde se coloca la muestra para la medicin. Pueden ser de


distintos tipos y tamaos (cuadradas, rectangulares, redondas). Se obtienen mejores
resultados usando cubetas de bordes paralelos. Si se utilizan cubetas redondas se deben
marcar e introducir en el aparato siempre en la misma posicin. Suelen estar fabricadas en
vidrio o en plstico.

6. Detector: Puede ser de dos tipos:


A. Fotoclulas o clulas fotovoltaicas:

Es una lmina de Cobre sobre la que se extiende una capa de Selenio o de xido de Cobre. A
sto se le conoce como semiconductor. Sobre el semiconductor hay una capa de metal
transparente que sirve de electrodo. La luz incide sobre el Selenio y ste desprende electrones,
que pasan a la placa de Cobre originando una diferencia de potencial por existir carga negativa
sobre el Cobre y positiva sobre el Selenio. El conjunto se conecta a un ampermetro que seala
el paso de corriente.

Caractersticas:
son resistentes; econmicas; sensibles desde el ultravioleta hasta los 1.000 nm. de longitud de
onda; no se requiere batera externa, ni vaco,...; la corriente producida es directamente
proporcional a la Energa que llega y tienen efecto fatiga, es decir, que presentan una subida
inicial de corriente, que luego decrece progresivamente hasta el equilibrio. Por eso hay que
esperar entre 30-60 segundos entre una lectura y otra.

B. Fototubos multiplicadores:
Un fototubo multiplicador es un tubo que contiene un ctodo que emite electrones de forma
proporcional a la Energa que incide sobre l. Tiene un nodo que recoge los electrones y la
corriente se multiplica varias veces al chocar los electrones sobre sucesivos nodos que van
teniendo un voltaje superior al precedente. La seal se amplifica en cientos o miles de veces.

Caractersticas:
el tiempo de respuesta es muy rpido, no tienen efecto fatiga tan altos como la anterior y
son muy sensibles.
7. Medidor: son sistemas de lectura de la Energa elctrica que recoge el detector y que puede
ser lectura directa (se utiliza una clula fotovoltaica) o puede ser amplificadores de seal como
en el caso del fototubo multiplicador. Los actuales aparatos incorporan lectura digital y clculos
automticos de concentraciones con relacin a las curvas de calibracin.

4.2 TIPOS DE APARATOS


ESPECTROFOTMETRO DE HAZ SIMPLE: es igual que la descripcin dada para el
espectrofotmetro en general. Consta de los mismos elementos (Ej. Bilirrubinmetro: para
determinar bilirrubina directa en capilar).

ESPECTROFOTMETRO DE DOBLE HAZ EN EL ESPACIO: todos los componentes estn


duplicados, menos la lmpara y el medidor. Dos haces de luz pasan al mismo tiempo por los
distintos componentes separados en el espacio. Esto compensa las variaciones de intensidad de
luz y de absorbancia.

ESPECTROFOTMETRO DE HAZ DOBLE EN EL TIEMPO: utilizan los mismos componentes que


el espectrofotmetro de haz simple. Dos haces de luz pasan por los mismos componentes pero
no al mismo tiempo. Emplean un Chopper consistente en un interruptor rotativo del haz
luminoso colocado a continuacin de la rendija de salida. Un sistema de espejos dirige la porcin
de luz reflejada por el chopper a travs de una cubeta de referencia y de ah al detector comn.
El detector lee alternativamente el haz procedente de la muestra y el de la cubeta de referencia.
Esto compensa la variacin de energa radiante.

PRINCIPIO DE LA ESPECTROFOTOMETRA
En la espectrofotometra se aprovecha la absorcin de radiacin electromagntica en la zona
del ultravioleta y visible del espectro. La muestra absorbe parte de la radiacin incidente en este
espectro y promueve la transicin del analito hacia un estado excitado, transmitiendo un haz de
menor energa radiante. En esta tcnica se mide la cantidad de luz absorbida como funcin de
la longitud de onda utilizada. La absorcin de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas
depende de la estructura de las molculas, y es caracterstica de cada sustancia qumica.

La espectrofotometra ultravioleta-visible utiliza haces de radiacin del espectro


electromagntico, en el rango UV de 180 a 380 nm, y en el de la luz visible de 380 a 780 nm, por
lo que es de gran utilidad para caracterizar los materiales en la regin ultravioleta y visible del
espectro.
Ley de Beer;
La Ley de Beer afirma que la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la
concentracin en la solucin.

Por ejemplo, en un vaso de vidrio tenemos agua con azcar disuelta y en otro vaso tenemos la
misma cantidad de agua pero con mayor cantidad de azcar en solucin. El detector es una celda
fotoelctrica, y lo que se mide es la concentracin de la solucin de azcar.

Segn la ley de Beer, si hiciramos que un rayo de luz atravesara el primer vaso, la cantidad de
luz que saldra del otro lado sera mayor que si repitiramos esto en el segundo, ya que en este
ltimo las ondas electromagnticas chocan contra un mayor nmero de tomos o/y molculas y
son absorbidos por estos.

Ley de Lambert
La Ley de Lambert dice que la cantidad de luz absorbida por un objeto depende de la distancia
recorrida por la luz.

Por ejemplo, retomando el ejemplo de los vasos, pensemos que ambos tienen la misma cantidad
de agua y la misma concentracin de azcar; pero el segundo tiene un dimetro mayor que el
otro.

Segn la ley de Lambert, si hiciramos que un rayo de luz atravesara el primer vaso, la cantidad
de luz que saldra del otro lado seria mayor que si repitiramos esto en el segundo, ya que en
este ltimo las ondas electromagnticas chocan contra un mayor nmero
de tomos o/y molculas y son absorbidos por estos, tal como se explic en la ley de Beer.

Ley de Bouguer-Beer-Lambert
Una ley muy importante es la de Bouguer-Beer-Lambert (tambin conocida como ley de
Lambert Bouguer y Beer), la cual es solo una combinacin de las citadas anteriormente.
Transmitancia y absorcin de las radiaciones

Por las leyes mencionadas anteriormente, al hacer pasar una cantidad de fotones o de
radiaciones hay una prdida que se expresa con la ecuacin:

It/Io=T-kdc''

donde It es la intensidad de luz que sale de la cubeta y que va a llegar a la celda fotoelctrica
(llamada radiacin o intensidad transmitida); Io es la intensidad con la que sale al atravesar la
celda (radiacin intensidad incidente), y la relacin entre ambas (T) es la transmitancia.

En el exponente, el signo negativo se debe a que la energa radiante decrece a medida que el
recorrido aumenta. El superndice k es la capacidad de la muestra para la captacin del haz del
campo electromagntico, d es la longitud de la cubeta de espectrofotometra que recorre la
radiacin, y c es la concentracin del soluto en la muestra ya ubicada en la cubeta.
La ecuacin simplificada de la ley de Lambert-Beer

A = .d.c

comprende la mnima ecuacin que relaciona la concentracin (c), la absorbancia de la


muestra (A), el espesor recorrido por la radiacin (d) y el factor de calibracin (). El factor de
calibracin relaciona la concentracin y la absorbancia de los estndares.

La absorcin (o absorbancia) es igual a A, que es el logaritmo recproco de la transmitancia:2

A= log 1/T

lo que es igual a:

A= -log T

Las ecuaciones mencionadas de las leyes son vlidas solo y solo si:

la radiacin incidente es monocromtica;


las especies actan independientemente unas de otras durante la absorcin;
la absorcin ocurre en un volumen de seccin trasversal uniforme.

Aplicaciones
Las aplicaciones principales son:

determinar la cantidad de concentracin en una solucin de algn compuesto utilizando las


frmulas ya mencionadas;
ayudar en la determinacin de estructuras moleculares;
la identificacin de unidades estructurales especficas, ya que estas tienen distintos tipos de
absorbancia (grupos funcionales o isomeras);
determinar constantes de disociacin de indicadores cido-base.

Tipos de espectrofotometra

Espectrofotometra de absorcin molecular VIS-UV. 13,


Espectrofotometra de absorcin molecular IR.15.
Espectrofotometra de absorcin y emisin atmica.
Espectrofotometra con atomizadores electrotrmicos.
Espectrofotometra de emisin con plasma.
Espectrofotometra de fluorescencia molecular.
CUESTIONARIO

1.- Explique el mecanismo de funcionamiento de un espectrofotmetro.

El funcionamiento de un espectrofotmetro consiste bsicamente en iluminar la muestra con


luz blanca y calcular la cantidad de luz que refleja dicha muestra en una serie de intervalos de
longitudes de onda. Lo ms usual es que los datos se recojan en 31 intrvalos de longitudes de
onda (los cortes van de 400 nm, 410 nm, 420 nm 700 nm). Esto se consigue haciendo pasar la
luz a travs de un dispositivo monocromtico que fracciona la luz en distintos intrvalos de
longitudes de onda. El instrumento se calibra con una muestra o loseta blanca cuya reflectancia
en cada segmento de longitudes de onda se conoce en comparacin con una superficie de
reflexin difusa perfecta.

2.- Qu diferencias existen entre un fotocolormetro y un


espectrofotmetro?.

a) UN ESPECTROFOTMETRO. - lee en longitudes de onda que van desde el ultravioleta


hasta en infrarrojo, se utiliza generalmente para dosar concentraciones en soluciones o
caracterizar sustancias por su curva de absorcin.

b) UN FOTOCOLORIMETRO. - es un equipo similar, pero este lee en longitudes de onda


del rango "Visible", se utiliza generalmente para determinar con exactitud el color de
una substancia, ya sean soluciones o sustratos slidos como tintas o pinturas.
3.- Grafique el espectro de luz, tanto en el rango visible como no visible
con sus respectivas longitudes de ondas.

4.- Qu relacin matemtica existe entre Absorbancia y Transmitancia?


Abs = -log T = -log (It/Io)

donde Abs es absorbancia, T es transmitancia, I es intensidad transmitida (la intensidad de la


luz luego de atravesar la muestra) y Io es intensidad incidente (la intensidad de luz antes de
atravesar la muestra).
BIBLIOGRAFA

Qumica Analtica Cuantitativa, Day and Underwood.


Qumica Analtica, Skoog and West. Anlisis Instrumental,
Douglas R. Skoog and Donald M. West.

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