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11 Identificacin de levaduras 11-1

Mara Jos Linares Sicilia


Francisco Sols Cuesta

En el medio SDA las colonias de levaduras


11.1. Fundamento suelen ser completas, ligeramente abombadas o pla-
nas, de consistencia mantecosa, lisas (Figura 11.1) o
rugosas (Figura 11.2), con olor dulzn agradable,
volvindose ms pastosas a medida que envejecen.
La identificacin de la especie de toda leva-
dura aislada en sangre o en cualquier otro lquido Por lo general las colonias de levaduras no
corporal estril est plenamente justificada. Sin desarrollan micelio areo, aunque en ocasiones pue-
embargo, debido a que los organismos levadurifor- den aparecer prolongaciones aracneiformes en la
mes forman parte de la flora normal de piel y muco- periferia de las colonias. Si se observa un micelio
sas, el aislamiento de levaduras a partir de hisopos areo definido, debe considerarse la posibilidad de
nasofarngeos, esputo, lavados bronquiales, orina, que se trate de un hongo dimrfico o de ciertas
raspados de uas, muestras vaginales o heces puede especies de levaduras que pueden formar micelio
cuestionar su significado clnico. No obstante, el
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verdadero como Geotrichum (Figura 11.3),


aislamiento reiterado de levaduras en diferentes Galactomyces, Trichosporon (Figura 11.4) o
muestras clnicas del mismo paciente es sugestivo Blastoschizomyces (su teleomorfo Dipodascus).
de infeccin por el microorganismo aislado y
requiere la identificacin de la especie causal. Una colonia de aspecto y consistencia
mucoide sugiere la formacin de cpsulas y puede
La identificacin de las levaduras se puede ser el paso inicial para la identificacin de
llevar a cabo atendiendo a cuatro criterios diferen- Cryptococcus neoformans (Figura 11.5).
tes: morfolgicos, bioqumicos, inmunolgicos o
genticos. Las colonias de color rojo-anaranjado o
naranja, de aspecto cremoso o rugoso, son caracte-
rsticas de las especies del gnero Rhodotorula (del
gr. rhodo, rojo) (Figura 11.6) y Sporobolomyces
(anaranjado), color que manifiestan estas levaduras
por su riqueza en carotenoides.
11.2. Identificacin mediante Pero no todas las colonias blancas y cremo-
sas son levaduras; las especies de algas acloroflicas
criterios morfolgicos del gnero Prototheca, tras incubacin a 28 C
durante 3-4 das, desarrollan unas colonias blancas
cremosas muy parecidas a las producidas por el
gnero Candida (Figura 11.7).
Los criterios morfolgicos pueden ser, a su
vez, macro o microscpicos.

11.2.2. Criterios microscpicos


11.2.1. Criterios macroscpicos
Ciertas caractersticas microscpicas son
muy tiles para la identificacin de algunas especies
Estos criterios tienen en cuenta el aspecto de de levaduras. Las ms utilizadas en la prctica son
las colonias de levaduras al crecer en los diferentes las siguientes:
medios de cultivo.

La mayora de los organismos levadurifor- Prueba del tubo germinal o


mes crecen fcilmente en un gran nmero de medios filamentacin precoz
de cultivo usados rutinariamente en el laboratorio de
Microbiologa (agar sangre, agar chocolate, agar El tubo germinal es una extensin filamento-
Cled, etc.). Sin embargo, el agar glucosado de sa de la levadura, sin estrechamiento en su origen,
Sabouraud (SDA), con o sin antibiticos aadidos, cuyo ancho suele ser la mitad de la clula progenito-
es el medio de aislamiento por excelencia para la ra y su longitud tres o cuatro veces mayor que la
identificacin de levaduras (Captulo 3). clula madre (Figura 11.8).

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11-2 Identificacin de levaduras

Figura 11.1. Aspecto macroscpico de las colonias de Candida Figura 11.4. Aspecto macroscpico de las colonias de
albicans en SDA. Trichosporon beigelii en SDA.

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Figura 11.2. Aspecto macroscpico de las colonias de Candida Figura 11.5. Aspecto macroscpico de las colonias de
parapsilosis en SDA. Cryptococcus neoformans en SDA.

Figura 11.3. Aspecto macroscpico de las colonias de Geotrichum Figura 11.6. Aspecto macroscpico de las colonias de Rhodotorula
candidum en SDA. rubra en SDA.
Identificacin de levaduras 11-3

Slo C. albicans es capaz de producir verda-


deros tubos germinales; sin embargo, otras especies
como C. tropicalis pueden producir pseudohifas
precoces de aspecto similar a los tubos germinales
pero con una zona de constriccin caracterstica
adyacente a la clula madre, por lo que esta prueba
es til para diferenciar C. albicans del resto de las
especies de Candida, aunque no est exenta de fal-
sos negativos.

Falsos negativos

Aproximadamente un 5% de cepas de C. albicans


son negativas para tubos germinales. Figura 11.7. Aspecto macroscpico de las colonias de Prototheca
wickerhamii en SDA.
Si se utiliza un inculo demasiado abundante de
levaduras, tambin pueden obtenerse falsos resul-
tados negativos.
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Metodologa

1. Emulsionar una porcin de la colonia aislada en


0,5 ml de suero humano o de conejo.
2. Incubar a 35 C durante 2 h.
3. Depositar una gota de la emulsin sobre un por-
taobjetos limpio y desengrasado, colocar un
cubre-objetos y visualizar a x100, x400 x1.000.

Interpretacin
La prueba es positiva si se visualizan tubos Figura 11.8. Produccin de tubo germinal o filamentacin precoz
germinales (Figura 11.8). por Candida albicans.

Variantes
la superficie del agar). Se incuba a 35 C, en
Adems de la tcnica con suero, el test de 10% de CO2, durante 2 h, manteniendo la tapa
filamentacin puede realizarse utilizando otros de la placa ligeramente abierta para que todo el
medios de cultivo: cultivo sea alcanzado por el CO2. La prueba es
positiva si se visualizan los tubos germinales en
a) Plasma de conejo: Berardinelli y Opheim [1] la zona de inoculacin a bajo aumento (x100-
describieron un medio de induccin de tubos x400).
germinales constituido por tres partes de coagu-
lasa plasmtica de conejo con EDTA (BBL
Microbiology Systems) y dos partes de caldo Formacin de hifas, blastoconidias,
Try-Soy (Scott Laboratories, Inc). La inocula-
clamidosporas y artrosporas
cin, incubacin e interpretacin son similares a
la tcnica con suero. La formacin de hifas, blastoconidias, clami-
dosporas o artrosporas por parte de las levaduras
b) Medio de cultivo slido Oxgall-Tween-cido constituye una caracterstica morfolgica de gran
cafeico (TOC): [Oxgall 10 g, agar 20 g, Tween importancia para la identificacin de algunas espe-
80 (solucin al 10%) 10 ml, cido cafeico 0,3 g, cies de levaduras.
agua destilada 1.000 ml]. La utilizacin de este
medio permite la visualizacin del tubo germi- Ante la presencia de estructuras con aspecto
nal y tambin de clamidosporas [2]. Para su rea- de hifas, lo primero que hay que determinar es si se
lizacin se estra una pequea porcin de la trata de pseudohifas (resultantes del proceso de for-
colonia sobre al agar TOC y a continuacin se macin de blastoconidias y, por tanto, con puntos
coloca con suavidad un cubre-objetos estril regulares de estrechamiento) o, por el contrario, son
(flamendolo suavemente) sobre la superficie verdaderas hifas que se fragmentan en artroconidias.
inoculada (para evitar la acumulacin de hume- Si el desarrollo en medios especiales (ver ms ade-
dad es preciso no presionar el cubre-objeto sobre lante) revela la presencia de pseudohifas y blastoco-

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11-4 Identificacin de levaduras

nidias, la levadura a identificar pertenece a alguna


especie del gnero Candida. Si por el contrario,
revela verdaderas hifas y artroconidias, lo ms pro-
bable es que se trate de especies de Trichosporon,
Geotrichum, Galactomyces o Blastoschizomyces.

Trichosporon y Blastoschizomyces producen


tanto artroconidias como blastoconidias; estas
ltimas nacen en brotes de los ngulos de las artro-
conidias adquiriendo la forma caracterstica de
oreja de conejo (Figura 11.9). Las especies
Galactomyces geotrichum (Geotrichum candidum)
y Blastoschizomyces capitatus (Geotrichum capita-
tus) tambin producen blastoconidias a partir del
ngulo de la artroconidia, pero, en este caso, forman
una estructura denominada palo de hockey Figura 11.9. Aspecto microscpico de Trichosporon beigelii
(Figura 11.10). C. tropicalis produce pequeas can- (x1.000) que muestra artrosporas y blastosporas.
tidades de blastoconidias, muy esparcidas o en
pequeos grupos a lo largo de las hifas. Sin embar-
go, C. parapsilosis, C. kefyr y C. krusei se ordenan
a lo largo de una corriente de blastoconidias, siendo

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esta la caracterstica que permite su identificacin;
adems, algunas cepas pueden producir hifas gi-
gantes.

Las clamidosporas son formas de resisten-


cia, redondas u ovales, de 6-12 m de dimetro y
pared gruesa, con aspecto de esporas laterales o ter-
minales. Su produccin es caracterstica y diagnsti-
ca de C. albicans [3] (Figura 11.11). Tambin puede
hacerse una identificacin presuntiva de esta especie
si se observa la formacin de grupos compactos de
blastoconidias, a intervalos regulares, a lo largo de
la pseudohifa.

Figura 11.10. Aspecto microscpico de Geotrichum candidum


Metodologa (x1.000).

Agar harina de maz


A este medio comercializado (Oxoid) debe
agregarse Tween 80 (polisorbato) a una concentra-
cin final de 0,02% para reducir la tensin superfi-
cial y aumentar la formacin de hifas y blastoconidias
(Captulo 3) [3].

Agar harina de maz

Procedimiento

1. La inoculacin se debe realizar, segn la tcnica


de Dalmau [4], haciendo tres cortes paralelos en el
agar (separados 1 cm) manteniendo el asa en un
ngulo aproximado de 45.
2. Colocar un cubre-objeto sobre la superficie de
agar cubriendo una parte de las estras de siem-
Figura 11.11. Formacin de pseudomicelio y clamidosporas por
bra. Candida albicans (x400).
3. Incubar las placas sembradas a 30 C durante 24-
48 h y luego examinar al microscopio a travs del
cubre-objetos a x100, x400 x1.000 (Figura 11.11).
Identificacin de levaduras 11-5

TOC
11.3. Identificacin mediante
Este medio confirma la determinacin de
tubo germinal y clamidosporas en agar. Si no se criterios bioqumicos
observan tubos germinales una vez realizada la pri-
mera lectura a las 2 h de incubacin, a 35 C y en
atmsfera de O2, la placa puede incubarse durante
24-48 h ms para visualizar el desarrollo de clami-
dosporas [2].
11.3.1. Criterios bioqumicos enzimticos
Leche diluida
En 1976 Feo y Pacheco [5], estudiando por
separado el perfil de los componentes del medio Medios cromognicos
lactrimel (leche + harina de trigo + miel) en la for-
macin de clamidosporas, comprobaron que la Estos medios estn diseados para el aisla-
leche entera (pasteurizada y homogeneizada) favo- miento e identificacin de algunas especies del
reca la produccin de las mismas, por lo que propu- gnero Candida tras su incubacin a 30-37 C
sieron un nuevo medio para su deteccin: el medio durante 24 a 48 h.
de leche diluida (leche natural 170 ml, agua destila-
da 1.000 ml, cloranfenicol 0,25 g). El fundamento de los mismos se basa en la
deteccin de determinadas actividades enzimticas
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por parte de las levaduras mediante la hidrlisis


Leche diluida especfica de un sustrato cromognico en presencia
de un indicador de la enzima. Una de las principales
Procedimiento ventajas de estos medios es permitir diferenciar
fcilmente los cultivos mixtos.
1. Emulsionar una colonia joven en 3-4 ml del medio.
2. Incubar a 28-30 C durante 24-48 h. Estos medios pueden ser utilizados como
3. Observar una gota de la emulsin al microscopio medios de aislamientos primarios o con fines de
(x100 x400). identificacin, despus del aislamiento de los orga-
nismos levaduriformes en los medios convenciona-
Interpretacin les. Aunque, segn nuestra experiencia, slo debera
C. albicans desarrolla abundantes pseudomicelios
utilizarse como medio de aislamiento primario en
y clamidosporas (Figura 11.11). aquellas muestras con alta sospecha de micosis por
levaduras.
Segn nuestra experiencia, el medio de leche
diluida es excelente para la investigacin de clami- CHROMagar Candida
dosporas, blastoconidias, hifas, pseudohifas y
artrosporas. Estas caractersticas unidas a su fcil El medio CHROMagar Candida
obtencin y bajo coste le convierten en un medio (CHROMagar) fue descrito por Odds y Bernaerts en
muy recomendable en la rutina de un laboratorio de 1994 para identificar las especies clnicamente
Micologa para la deteccin de estas formaciones importantes del gnero Candida [6]. CHROMagar
microscpicas [3]. Candida permite diferenciar C. albicans, C. tropica-
lis, C. krusei, y C. glabrata en funcin de los colo-
res que desarrollan en este medio.
Tinciones
La siembra se realiza segn las tcnicas tra-
El estudio microscpico de los organismos dicionales y las placas se incuban a 30-37 C duran-
levaduriformes o microorganismos relacionados te 48 h para que las levaduras desarrollen
(gnero Prototheca) se puede llevar a cabo median- completamente el color. Al cabo de este tiempo, las
te tinciones, ya sea tincin simple (Figuras 11.12 y colonias de C. albicans son lisas y de color verde
11.13) o tincin de Gram (Figura 11.14); con esta esmeralda, a diferencia de C. dubliniensis que desa-
tincin, las levaduras suelen comportarse como rrolla un color verde oscuro y que, adems, es inca-
Gram positivas (Captulo 14). paz de crecer a 45 C [7]. C. tropicalis produce
colonias azul oscuro con un halo prpura-marrn en
Mediante estas tinciones tambin se puede el agar que la rodea. C. krusei forma colonias rugo-
observar la formacin de blastosporas, artrosporas, sas con el centro rosado y el borde blanco. C. gla-
hifas, pseudohifas o endosporas (autoesporas esfri- brata manifiesta un color violeta morado. Las
cas de 4-11 m de dimetro incluidas en una teca, dems especies desarrollan colores y tonalidades
que puede visualizarse tambin vaca); estas ltimas diversas que no permiten su identificacin por este
son tpicas de las especies del gnero Prototheca medio (Figuras 11.16 y 11.17).
(Figura 11.15).

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11-6 Identificacin de levaduras

Figura 11.12. Aspecto microscpico de Candida parapsilosis. Figura 11.15. Aspecto microscpico de Prototheca wickerhamii
Tincin simple con azul de metileno (x1.000). (x1.000). Se observan las endosporas y las tecas vacas.

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Figura 11.13. Aspecto microscpico de Cryptococcus neoformans. Figura 11.16. Crecimiento en CHROMAgar
Tincin simple con azul de metileno (x1.000). Candida de C. albicans (verde) C. tropicalis (azul),
C. krusei (rosa y rugosa), C. parapsilosis (rosacea-
lisa), Prototheca wickerhamii (crema).

Figura 11.14. Aspecto microscpico de Candida albicans. Tincin Figura 11.17. Crecimiento en CHROMAgar Candida de C. albicans
de Gram (x1.000). (verde) C. tropicalis (azul), C. krusei (rosa y rugosa), C. parapsilosis
(roscea-lisa) y Prototheca wickerhamii (crema, flecha).
Identificacin de levaduras 11-7

COLOREX Candida Albicans ID2


Colorex Candida (Biomedics) es un nuevo El medio Albicans ID2 (bioMrieux) es muy
medio cromgenico y diferencial que facilita la parecido al anterior. Se ha enriquecido la frmula
identificacin presuntiva de algunas de la levaduras para facilitar el aislamiento y la identificacin de las
de mayor importancia en clnica (C. albicans, colonias de C. albicans que desarrollan un color
C. tropicalis y C. krusei). azul ms intenso. Adems, permite, la identificacin
presuntiva de C. tropicalis ya que presenta una
La siembra se realiza segn las tcnicas tonalidad verdosa en este medio. Las colonias de las
habituales y las placas se incuban a 30-37C, segn dems especies son de color blanco.
el origen de la muestra, durante 24-48 h.
La inoculacin e incubacin son similares al
En este medio, C. albicans desarrolla medio anterior.
colonias verdes, C. tropicalis azules-grisceas y
C. krusei colonias rosas rizadas.

Cromogen Albicans
Cromogen Albicans (Biomedics) es un
medio diferencial y selectivo utilizado para el aisla-
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miento e identificacin de C. albicans en muestras


vaginales, rectales, escamas, orina, pus, escobillona-
dos bucales, etc.
La siembra se realiza segn las tcnicas
habituales y las placas se incuban a 30-37 C, segn
el origen de las muestras, durante 24-48 h.
Las colonias de C. albicans adquieren un
color azul verdoso caracterstico, dependiendo del
periodo de incubacin y la temperatura, con formas
redondeadas, lisas y ligeramente elevadas. Las otras
especies de levaduras aparecen de color blanco cre-
Figura 11.18. Crecimiento de Candida albicans (colonias
moso y necesitan una identificacin bioqumica azules) en el medio Candida ID (bioMrieux). El resto de las
posterior. especies se manifiesta de color rosa o blanco.

Candida ID
El medio Candida ID (bioMrieux) es un Candida ID2 (CAN2)
medio cromognico que permite el aislamiento de
organismos levaduriformes, la identificacin pre- El medio Candida ID 2 (bioMrieux) es un
suntiva de C. albicans y cierta orientacin para la medio cromognico destinado al aislamiento
identificacin de otras especies no albicans. selectivo de levaduras, identificacin de la especie
C. albicans y diferenciacin presuntiva de un con-
La inoculacin e incubacin son similares a junto de especies como C. tropicalis, C. lusitaniae y
las descritas para otros medios cromognicos. C. kefyr. Este medio se ha presentado como una
En Candida ID, las colonias de C. albicans son modificacin de la formula anterior (medio
redondeadas, ligeramente convexas, lisas, de bordes CandidaID-CA) . La inoculacin e incubacin se
netos y de color azul (cuya intensidad vara en fun- llevar a cabo igual que en los casos anteriores, tras
cin del tiempo de incubacin). Las colonias de 24-48 h. a 30-37C, se observar el color de las
C. tropicalis, C. lusitaniae, C. guilliermondii y colonias. Azul plido a azul oscuro es propio de
C. kefyr desarrollan un color rosa a las 48 h de incu- C. albicans; rosa es caracterstico de C. tropicalis,
bacin. Otras especies, como C. famata, C. humico- C. lusitaniae y C. kefyr, la identificacin de estas
la, y Cryptococcus neoformans, pueden originar especies debe continuarse por pruebas bioqumica
colonias rosas ms o menos intensas. El resto de las y/o inmunolgicas. Las colonias de color blanco
especies desarrolla un color blanco-crema, requi- crema no pueden identificarse de forma presuntiva
riendo una identificacin bioqumica posterior por lo que deben utilizarse tcnicas bioqumicas y/o
(Figura 11.18). inmunolgicas (Figura 11.19).

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11-8 Identificacin de levaduras

preta de igual forma por la aparicin de fluorescen-


cia difusible de las colonias de C. albicans, emitida
al iluminarse con luz ultravioleta a 365 nm.

Sistemas enzimticos comercializados para la


identificacin rpida de C. albicans

En el mercado existen varios sistemas enzi-


mticos comercializados para la identificacin rpi-
da de C. albicans a partir de una colonia aislada en
cualquiera de los medios convencionales. En todos
ellos se detecta una o dos enzimas (-galactosamini-
dasa y L-prolina aminopeptidasa), slo presentes en
C. albicans [8].
Para la deteccin de estas enzimas, los siste-
Figura 11.19. Crecimiento de C. albicans (colonias azules), mas comerciales pueden utilizar sustratos fluorog-
C. tropicalis y C. lusitaniae (colonias rosas) y C. glabrata (colonias nicos o cromognicos.
blancas) en el medio Candida ID 2 (CAN2) (bioMrieux).

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Sistemas enzimticos que utilizan
CandiSelect sustratos fluorognicos
El medio CandiSelect (Bio-Rad) es un medio Para su utilizacin, todos estos sistemas
selectivo que permite la identificacin de C. albi- requieren el empleo de una lmpara de luz ultravio-
cans mediante la hidrlisis del sustrato cromognico leta de 365 nm (Linus).
presente lo que origina el desarrollo de un color azul
por las colonias de esta especie.
BactiCard Candida
La inoculacin e incubacin son similares a
los otros medios cromognicos. C. albicans se iden- La tarjeta Bacticard Candida (Remel) integra
tifica por la presencia de colonias lisas azules y el dos tests independientes para detectar la presencia
resto de las levaduras manifiesta un color blanco en de las enzimas -galactosidasa (MUGAL) y L-proli-
sus colonias. A las 48 h de incubacin, algunas na aminopeptidasa (PRO). La enzima MUGAL
cepas de C. tropicalis y Trichosporon spp. pueden tiene la capacidad de hidrolizar el sustrato 4-meti-
tambin desarrollar colonias azules, pero morfolgi- lumbeliferil-N-acetil--D-galactosaminida y produ-
camente son diferentes a C. albicans. cir la liberacin de 4-metilumbeliferona que es una
sustancia fluorescente capaz de ser detectada al ilu-
minarse con luz ultravioleta de 365 nm. La enzima
Fluoroplate Candida PRO hidroliza al sustrato L-prolina--naftilamida y
reacciona con el Color Developer originando un
El Agar Fluoroplate Candida (Merck) permi- color rojo (Figura 11.20).
te identificar macroscpicamente C. albicans por su
capacidad de hidrolizar el sustracto 4-metilumbeli-
feril-N-acetil--D-galactosaminida, por la enzima
N-acetil-galactosaminidasa (NAGasa), originando
una fluorescencia blanquecina al iluminar la placa
con luz ultravioleta. El resto de las especies no pre-
senta fluorescencia.
La siembra en este medio se realiza de forma
convencional y las placas se incuban a 30-37 C
durante 18-24 h. La lectura se realiza, en la oscuri-
dad, colocando las placas sobre un transiluminador Figura 11.20. Sistema
de luz ultravioleta de 365 nm (Linus). BactiCard Candida (Remel).

Agar SDCA-MUAG
El agar SDCA-MUAG (Biolife) es un medio
muy parecido al anterior en cuya composicin est
presente, como sustrato, el 4-metilumberiferil-2-
acetamida-2-desoxi--D-galactosaminida. Se inter-
Identificacin de levaduras 11-9

Bacticard

Procedimiento
1. Inocular slo una cepa en cada tarjeta.
2. Rehidratar cada crculo de la tarjeta con 1 gota del fluido rehidratante BactiCard Candida (sin sobrepasar el rea del test).
3. Inocular cada crculo de la tarjeta con un inculo visible del aislamiento a identificar utilizando la varilla aplicadora.
4. Incubar la tarjeta inoculada durante 5 min a temperatura ambiente.
5. Aadir 1 gota de BactiCard Color Developer al crculo del test PRO y observar el color desarrollado a los 30 segundos:
Positivo: Color rojo.
Negativo: No hay cambio de color.
6. Aadir 1 gota del reactivo MUGAL BactiCard al crculo del test MUGAL.
7. Observar este ltimo crculo en oscuridad con una lmpara de luz ultravioleta:
Positivo: Azul fluorescente brillante.
Negativo: No hay fluorescencia.

Adems de Bacticard Candida, existen otros sistemas comercializados [8] que detectan estas enzimas y cuyo proce-
samiento e interpretacin de resultados es muy similar (Tabla 11.1).
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Tabla 11.1. Sistemas enzimticos comercializados para la identificacin rpida de C. albicans utilizando sustratos
cromognicosa.

Tiempo incubacin
Nombre comercial Sustrato (Temperatura)

Albicans-Sure (Clinical Standars Labs) 4MUc N-acetil galactosaminida P-dimetilcinnamaldehido 5 min (ambiente)
Albistrip (Lab M. Ltd) 4MU N-acetil galactosaminida Prolina-p-nitroanilida 5 min (37 C)
BactiCard Candida (Remel) 4MU N-acetil galactosaminida P-dimetilcinnamaldehido 5 min (ambiente)
RapID Albicans (Biolife) 4MU N-acetil galactosaminida P-dimetilcinnamaldehido 2 h (37 C)
MUAG testb (Biolife) 4MU N-acetil galactosaminida 3 min (ambiente)
a: Detectan -galactosaminidasa y L prolina aminopeptidasa. Se necesita lmpara de luz ultravioleta.
b: Slo detecta -galactosaminidasa.
c: Metil Umbeliferil.

Sistemas enzimticos que utilizan un Sistemas enzimticos comercializados para la


sustrato cromognico identificacin rpida de C. glabrata

Estos sistemas utilizan sustratos cromogni-


cos para detectar las enzimas MUGAL y PRO por GLABRATA RTT
lo que no requieren el uso de la lmpara de luz
ultravioleta. Entre ellos destacan: Es un mtodo sencillo que precisa un peque-
o inculo para su realizacin y cuyos resultados se
obtienen en menos de 20 min, por lo que actualmen-
Candida albicans Screen te es la tcnica comercializada ms rpida para la
identificacin de C. glabrata.
Este sistema (Remel) utiliza como sustratos
p-nitrofenil-N--acetil -D galactosaminida y GLABRATA RTT [9,10] (Fumouze
p-dimetilcinnamaldehido. Requiere una incubacin Diagnostics) consiste en un panel plstico de tres
de 90 min a temperatura ambiente. pocillos con medio deshidratado (T, M y B); los
pocillos T y M contienen trehalosa y maltosa, res-
pectivamente, y si stos azcares son asimilados por
Murex C. albicans CA50 la levadura, se origina glucosa que es detectada
mediante una reaccin de oxidacin. El pocillo B se
Murex C. albicans (Murex Diagnostic) utili- utiliza como control y manifiesta la presencia de
za como sustratos p-nitrofenil-N--acetil -D galac- cualquier carbohidrato libre que, procedente del
tosaminida y p-dimetilcinnamaldehido. Requiere medio de cultivo, pudiera dar lugar a un resultado
una incubacin de 30 min a 37 C. falso positivo en los otros pocillos. Solo con las
cepas de la especie C. glabrata se obtiene un resul-
tado positivo en el pocillo de trehalosa y negativo

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11-10 Identificacin de levaduras

en el de maltosa; las dems levaduras son trehalosa


negativa o positiva, pero en los casos positivos, la
maltosa tambin es positiva (Figura 11.21).

GLABRATA RTT

Procedimiento
1. Suspender 4-6 colonias de la levadura a ensayar,
a partir del medio de cultivo, en 100 l de agua
destilada (turbidez 3 en la escala de McFarland).
2. Depositar 25 l en cada uno de los pocillos (T, M y B).
3. Incubar el panel durante 10 min a temperatura
ambiente.
4. Aadir 25 l de reactivo revelador.
5. Incubar el panel durante 10 min a temperatura
ambiente (Figura 11.21).
Figura 11.21. Esquema de realizacin de la prueba GLABRATA
6. Leer visualmente los pocillos. RTT y ejemplo de un resultado positivo (tomado de Pemn et al. [10]).

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Interpretacin

Positivo: coloracin anaranjada-marrn.


Negativo: falta de coloracin. Ureasa
Las pruebas con el pocillo B positivo se conside-
ran no valorables. Procedimiento
1. Pasar la punta de un aplicador de algodn,
impregnado con agar base ureasa de Christensen,
sobre la superficie de dos o tres colonias aisladas
del microorganismo a estudiar, de un cultivo de 48
Identificacin de Cryptococcus neoformans a 72 h en cualquiera de los medios habituales.
por mtodos enzimticos 2. Colocar el aplicador inoculado en un tubo con 3
gotas de cloruro de benzalconio al 1% (ajustar el
pH a 4,8).
Deteccin de ureasa
3. Presionar con fuerza la punta del hisopo contra el
fondo del tubo para que se desprendan los micro-
Una levadura con reaccin positiva a la prue- organismos contenidos en las fibras de algodn.
ba de la ureasa es sugestiva de pertenecer al gnero
4. Tapar el tubo e incubar a 45 C.
Cryptococcus. Concretamente, las cepas de C. neo-
formans que son grandes productores de ureasa, 5. Examinar el tubo a los 10, 15, 20 y 30 min.
comienzan a provocar cambio de color a las 2 h de
Interpretacin
incubacin a 35 C.
El desarrollo de un color rojo-prpura, indica el
resultado positivo de la prueba (Figura 11.22).

Esta prueba tambin puede utilizarse para diferen-


ciar Trichosporon de Geotrichum; la mayora de las
especies de Trichosporon son ureasa (+) mientras
que las de Geotrichum son ureasa (-).

Prueba de la enzima Nitrato-reductasa

La capacidad de C. neoformans de reducir


nitratos a nitritos es una prueba de utilidad cuando
se pretende identificar esta levadura (Figura 11.23).

Figura 11.22. Prueba de la ureasa.


Identificacin de levaduras 11-11

Nitrato-reductasa

Procedimiento
1. Pasar la punta de un aplicador por la superficie de
2-3 colonias aisladas de un cultivo de 48-72 h de
crecimiento en cualquiera de los medios habitua-
les. El hisopo inoculado se presiona con firmeza
contra el fondo de un tubo vaco para que se des-
prendan los microorganismos contenidos en la
fibra de algodn.
2. Incubar el tubo con el hisopo a 45 C durante
10 min.
Figura 11.23. Prueba de la nitrato-reductasa.
3. Sacar el hisopo y agregar al tubo 2 gotas de alfa-
naftlamida y 2 gotas de cido sulfanlico.
4. Reintroducir el hisopo en el tubo para que absorba
los reactivos.
Prueba de la Fenol-Oxidasa Interpretacin

C. neoformans produce fenol-oxidasa, una El desarrollo inmediato de un color rojo indica una
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enzima necesaria para el metabolismo de la 3,4- reaccin positiva (Figura 11.23).


dihidroxifenilanina (DOPA) y otros compuestos
fenlicos en la sntesis de la melanina. Esto se evi-
dencia por la produccin de un pigmento marrn
oscuro o negro alrededor de la colonia de C. neofor- 11.3.2. Identificacin basada en mtodos de
mans en el medio de TOC (Apartado 11.2.2). asimilacin de nutrientes

Auxonograma convencional
Fenol-oxidasa
Se fundamenta en la aplicacin por separado
Procedimiento de diferentes nutrientes, hidrocarbonados o nitroge-
nados, sobre un medio sinttico base para apreciar
1. Sembrar 2-3 colonias de un cultivo joven en el el crecimiento selectivo de una levadura en la cerca-
medio de TOC.
na de los nutrientes necesarios para su desarrollo.
2. Incubar a 37 C durante 3-5 das.
Para su realizacin pueden emplearse solu-
Interpretacin
ciones acuosas esterilizadas por filtracin, cilindros
El desarrollo de una pigmentacin marrn oscura de Oxford en pocillos hechos en el agar o bien dis-
alrededor del crecimiento es caracterstico de cos de papel absorbente empapados con el nutriente.
C. neoformans. (Figura 11.24). Sin embargo, las pruebas de asimilacin en medios
lquidos no ofrecen ninguna ventaja adicional sobre
los medios slidos, resultando mucho ms laborio-
sas y costosas.

Medios de cultivo base. Se prepararan


segn la tcnica habitual y no necesitan ajustar el
pH. Se expenden deshidratados como medios base
de levaduras. Los ms utilizados son los siguientes:
1. Medio sin carbono. Sulfato amnico (5 g/l),
Fosfato monopotsico (1 g/l), Sulfato de magne-
sio (0,5 g/l), Agar (20 g/l).
2. Medio sin nitrgeno. Glucosa (20 g/l), Fosfato
monopotsico (1 g/l), Sulfato de magnesio
(0,5 g/l), Agar (20 g/l).

Como fuente de carbono se puede ensayar


todos los azcares y alcoholes conocidos. Como
Figura 11.24. Prueba de la fenol-oxidasa (Medio de substrato de nitrgeno se suele emplear peptona,
TOC). Produccin de pigmento marrn oscuro por asparagina, urea, sulfato amnico, nitrato de potasio
C. neoformans. y aminocidos diversos.

Asociacin Espaola de Micologa


11-12 Identificacin de levaduras

Auxonograma

Procedimiento
1. La levadura en estudio se siembra previamente en
caldo glucosado de Sabouraud ms cloranfenicol
a 28 C durante 48 h.
2. Agitar para mezclar el cultivo y tomar 1 ml como
inculo del medio sinttico fundido. Enfriar a
50 C, mezclar y verter en placa.
3. Preparar las soluciones estriles de los nutrientes,
los azcares al 10% y las sustancias nitrogenadas
al 1%.
4. Una vez solidificado el agar, y con la ayuda de un
tubo de cristal, agujerear 5-6 pocillos por placa.
Sobre cada pocillo se vierten dos gotas de los dis-
tintos nutrientes en estudio.
4. bis Si se utilizan discos de papel absorbente, deben
confeccionarse de distintos colores o rotularse
previamente. Una vez esterilizados, y antes de su
empleo, se empapan con dos gotas de las solucio-

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nes acuosas de los nutrientes (al 20% para los
azcares y al 2% para los substratos nitrogena- Figura 11.25. Sistema Auxocolor (Bio-Rad).
dos). Se secan en estufa y se aplican sobre el
medio con pinzas estriles.
5. Incubar a 28 C. (2-4 das).
Auxacolor
Interpretacin
En la zona circulante a los pocillos o los discos, Procedimiento
crecen abundantes colonias de levaduras si utili-
zan el nutriente correspondiente; por el contrario, 1. Realizar una suspensin, equivalente a 1
no aparecen en los contornos de los no utilizados. McFarland con un cultivo joven (24-48 h) de la
levadura a identificar, en el vial con medio de sus-
La intensidad del cultivo perifrico se expresa pensin facilitado por el fabricante.
mediante cruces:
5 mm de radio (+), 5-10 mm (++), >10 mm (+++). 2. Inocular la galera y cubrir con papel adhesivo.
3. Incubar a 30 C durante 24-48 h (prolongar hasta
72 h si fuese necesario).

Interpretracin

Auxacolor El cambio de color (amarillo) se interpreta como


crecimiento positivo para el azcar en cuestin.
Los 15 caracteres bioqumicos de la galera se
La galera Auxacolor (Bio-Rad) es un siste- agrupan en tripletes para obtener un cdigo
ma de identificacin basado en la asimilacin de 13 numrico. Para ello, se adjudica un valor de 1
azcares que permite identificar 26 especies diferen- para la posicin 1 del triplete, 2 para la 2 y 4
tes de levaduras. El crecimiento de la levadura se para la 3. La identificacin de la levadura se con-
visualiza por el cambio de un indicador de pH. La sigue comparando el cdigo numrico resultante
galera incorpora, adems, una prueba de resistencia con los suministrados por el fabricante.
a la actidiona y otra para la deteccin de la actividad
fenol-oxidasa de C. neoformans (Figura 11.25).

Sistema Uni-Yeast-Tek

El sistema Uni-Yeast Tek (Remel) est cons- to micelial y la produccin de clamidosporas.


tituido por una placa plstica con mltiples compar- Adems, est provisto de agar urea, agar para la asi-
timentos que contienen un medio con agar para la milacin y reduccin de nitratos y de un caldo con
asimilacin diferencial de siete hidratos de carbono. extracto de carne al 2,6% (con 0,05% de glucosa)
Tambin incorpora una cubeta central con agar hari- para realizar la prueba del tubo germinal
na de maz-Tween 80 para determinar el crecimien- (Figura 11.26).
Identificacin de levaduras 11-13

API 20C AUX

La galera API 20 C AUX (bioMrieux) se


compone de 20 cpulas con sustratos deshidratados
que permiten realizar 19 pruebas de asimilacin.
Las cpulas se inoculan con un medio mnimo semi-
slido y las levaduras slo se reproducen si son
capaces de utilizar el sustrato correspondiente
(Figura 11.27). Permite identificar un total de 34
especies diferentes.

API 20C AUX

Procedimiento
1. A partir de un cultivo joven de la levadura a identifi-
car, realizar una suspensin en 2 ml de agua desti-
lada estril hasta obtener una turbidez igual a 2 de
Figura 11.26. Sistema Uni-Yeast-Tek (Remel). McFarland.
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2. Transferir 100 l (2 gotas) de esta suspensin a


una ampolla de C Medium y homogeneizar evitando
la formacin de burbujas.
Uni-Yeast-Tek 3. Llenar las cpulas con la suspensin anterior evi-
tando la formacin de burbujas y creando un nivel
Procedimiento horizontal para generar resultados correctos.
4. Incubar a 30 C durante 48-72 h.
1. A partir de un cultivo de 24-48 h en medios habi-
tuales, realizar una suspensin en agua destilada Lectura e interpretacin
estril equivalente a 4 McFarland. Inocular cada
uno de los compartimentos con una gota de esta Observar el crecimiento de las levaduras en com-
suspensin. paracin con la cpula del control negativo. Una
cpula ms turbia que el testigo indica una reac-
2. El compartimiento con agar harina de maz se cin positiva que debe anotarse en la hoja de
siembra, con una pequea porcin de la colonia, resultados. En esta ltima, los diferentes nutrientes
haciendo dos o tres surcos paralelos con aguja de estn separados en grupos de tres y se adjudica a
inoculacin. Seguidamente, se coloca un cubreob- cada uno, en caso de ser positivo, un valor diferen-
jeto flameado sobre el rea inoculada. te: 1 para el primero, 2 para el segundo y 4 para el
3. Incubar a 30-35 C durante 2-7 das. que ocupa el tercer lugar. Sumando cada triplete
se obtiene un nmero de siete cifras que constitu-
Interpretacin ye el perfil numrico.
La identificacin debe hacerse mediante el
La observacin de cambio de color del azul al Catlogo Analtico o el Programa Informtico de
amarillo indica asimilacin de los hidratos de car- Identificacin suministrado por el fabricante.
bono.
El medio de nitrato se interpreta como reduccin
cuando el color azul original vira al color verde o
verde azulado.
La deteccin de hifas, blastosporas y clamidospo-
ras en el agar harina de maz se detecta mediante
visualizacin con objetivo de 40X.

11.3.3. Sistemas semiautomticos

En la actualidad se han comercializado


diversos mtodos de asimilacin de nutrientes que
simplifican tanto su uso como su interpretacin [11].
Figura 11.27. Sistema API 20C AUX (bioMrieux).

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11-14 Identificacin de levaduras

La lectura de estas reacciones se hace por


comparacin con un control de crecimiento y la
identificacin se obtiene, a partir de un cdigo
numrico, mediante un catlogo analtico o un pro-
grama informtico.

Galera ID 32C

La galera ID 32 C (bioMrieux) est com-


puesta por diferentes pruebas de asimilacin y por
una base de datos especialmente adaptada (Figura
11.28). Permite identificar 63 especies diferentes de
organismos levaduriformes o relacionados y puede
ser utilizada manualmente o bien de forma automa- Figura 11.28. Galera ID 32C (bioMrieux).
tizada mediante los sistemas ATB Expression o
mini API. Galera ID 32C
La galera se compone de 32 cpulas:
29 contienen cada una un sustrato carbonado deshi- Procedimiento
dratado, una es el control negativo, otra detecta la 1. Realizar una suspensin de un cultivo joven de la

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sensibilidad a la cicloheximida y la ltima es una levadura a identificar en 2 ml de agua destilada
prueba colorimtrica para la esculina. estril, hasta obtener una turbidez igual a 2 de
McFarland.
El procedimiento para la inoculacin de la 2. Transferir 250 l (5 gotas) de esta suspensin a
galera, incubacin e interpretacin es similar al una ampolla de C Medium y homogeneizar.
descrito para el sistema API 20 C AUX. La nica 3. Inoculacin manual: Dispensar 135 l de la sus-
diferencia es la posibilidad de realizar la lectura de pensin anterior en cada cpula.
la galera, de forma automtica, mediante el sistema 3bis. Inoculacin automtica: Colocar sobre el porta-
ATB Expression o mini API. galeras del inoculador ATB la galera y la sus-
pensin en la ampolla de C Medium; el inoculador
realizar automticamente la homogeneizacin
Sistema Vitek de la ampolla y el llenado de las cpulas
(135 l/cpula).
Las tarjetas Yeast Biochemical Card (YBC) 4. Incubar a 30 C. durante 24-48 h.
del sistema Vitek (bioMrieux) permiten la identifi-
Lectura e interpretacin
cacin de organismos levaduriformes y afines de
forma automatizada. Son unas tarjetas plsticas 1. Lectura visual: Observar el crecimiento de las
desechables que incluyen 30 celdillas: 26 pruebas levaduras en comparacin con la cpula 0 (testigo
bioqumicas convencionales y 4 controles. Por otra negativo). Una cpula ms turbia que el testigo
parte, el sistema Vitek consta de un mdulo con indica una reaccin positiva que debe anotarse en
cmara de vaco para inoculacin de las tarjetas, un la hoja de resultados. En esta ltima, los tests
estn separados en grupos de tres y se adjudica a
lector/incubador, un sistema automtico de manipu- cada uno en caso de positividad un valor diferen-
lacin de tarjetas, un fotmetro para medir la densi- te, 1 para el primero, 2 para el segundo y 4 para el
dad ptica, un ordenador central y una impresora. que ocupa el tercer lugar; sumando cada triplete
se obtiene un nmero de siete cifras que constitu-
El sitema Vitek permite identificar 36 espe- ye el perfil numrico. La identificacin se obtiene
cies diferentes de levaduras: 16 especies del gnero con el programa de identificacin (Figura 11.29).
Candida, 6 Cryptococcus, 3 Rhodotorula, 2. Lectura automtica con ATB Expression o
2 Trichosporon, 3 Geotrichum, 2 Prototheca, mini API: El lector busca en cada cpula la pre-
Hansenula anomala, Pichia ohmeri, Saccharomyces sencia de crecimiento y transmite los datos al
cerevisiae y Yarrowia lipolytica. ordenador que, una vez procesados, propone la
identificacin de la especie.

11.3.4. Sistemas automticos

Sistema Vitek 2

El sistema Vitek 2 (bioMrieux) es un siste-


ma totalmente automtico para la deteccin del Figura 11.29. Lectura visual e interpretacin de los resultados de la
metabolismo fngico que puede identificar levadu- galera ID 32C.
Identificacin de levaduras 11-15

Sistema Biolog YT MicroPlate


Sistema Vitek
El sistema Biolog YT MicroPlate (Biolog)
Procedimiento permite la identificacin de organismos levadurifor-
mes mediante 94 pruebas bioqumicas, llegando a
1. Realizar una suspensin de un cultivo joven de la identificar hasta un total de 267 especies diferentes
levadura a identificar en un tubo con 1,8 ml pertenecientes a 53 gneros.
de solucin salina estril, hasta conseguir una
turbidez 2 de McFarland.
2. Introducir la tarjeta y la suspensin de levaduras
en el mdulo de llenado, para que la inoculacin Biolog YT MicroPlate
de la tarjeta se realice de forma automtica.
3. Colocar la tarjeta inoculada en el mdulo incu- Procedimiento
bador (30 C).
1. Subcultivar cada levadura a identificar en agar
4. A las 24 h, la lectura de la turbidez de las celdillas BUY (Biolog) durante 24-48 h a 25 C.
se realiza automticamente y se trasfieren los
2. Realizar una suspensin, ajustndola a 44-51%
datos al ordenador.
de transmitancia.
Interpretacin 3. Inocular cada pocillo de la MicroPlate.
4. Incubar la placa a 30 C durante 24, 48 y 72 h.
Una vez que el patrn de las lecturas de turbidez
se compara con los perfiles de la base de datos, 5. Transcurrido el tiempo indicado, leer mediante lec-
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se imprime la identificacin del microorganismo. tor de placa a 590 nm de longitud de onda.


Una identificacin aceptable es la que alcanza una Interpretacin
confiabilidad 85%. Las levaduras identificadas
con menos del 85% de confiabilidad deben ser La lectura e interpretacin se realiza automtica-
evaluadas posteriormente valorando su morfologa mente mediante un software de anlisis y un siste-
y otras pruebas suplementarias para lograr una ma experto avanzado.
identificacin aceptable.

Rapid Yeast Identification Panel MicroScan


ras y organismos afines en tan slo 15 h. Est basa-
do en tecnologa de fluorescencia y se compone de El Rapid Yeast Identification Panel
las tarjetas de anlisis con 63 pocillos, una consola MicroScan (Dade Behring) es un mtodo automati-
satlite para la recogida de informacin, un mdulo zado para la identificacin rpida de 40 especies de
incubador, un mdulo principal donde se procesa la levaduras y otros microorganismos afines. Se basa
informacin gracias a un software de anlisis y un en la utilizacin de pruebas convencionales y
sistema experto avanzado. cromognicas en una placa de microdilucin de
96 pocillos que utiliza 27 sustratos deshidratados.

Sistema Vitek 2
Rapid Yeast Identification Panel MicroScan
Procedimiento
Procedimiento
1. A partir de un cultivo joven de la levadura a estu-
diar, preparar una suspensin en solucin salina 1. A partir de un cultivo joven (18-24 h) en SDA, rea-
(0,45%), ajustndola a la escala 2 de McFarland. lizar una emulsin en 3 ml de agua destilada hasta
2. La inoculacin de las tarjetas, el sellado y la incu- conseguir la turbidez del Patrn MicroScan (apro-
bacin (30 C) se realiza de forma totalmente ximadamente 7-8 de la escala de McFarland).
automatizada. 2. Aadir, de forma automatizada, 50 l de la sus-
3. A las 15 h se realiza la lectura e interpretacin de pensin anterior a cada uno de los pocillos que
los resultados, tambin de forma automtica. contienen sustratos y a los pocillos controles.
3. Cubrir el panel e incubarlo en atmsfera de CO2
a 35-37 C durante 4 h.

El sistema Vitek 2 permite la identificacin Lectura e Interpretacin


de 51 especies diferentes, incluida C. dubliniensis, Aadir los reactivos correspondientes a cada
y, al igual que los sistemas semiautomticos, pocillo, incluyendo los controles.
requiere pruebas adicionales (fundamentalmente La lectura se puede realizar de forma visual o
morfolgicas) en caso de baja discriminacin. automatizada. Los resultados se convierten en un
nmero de nueve dgitos y la identificacin se rea-
liza utilizando el libro de Cdigos de biotipos para
levadura de MicroScan.

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11-16 Identificacin de levaduras

11.3.5. Identificacin rpida de levaduras


mediante pruebas
bioqumicas y enzimticas

RapID Yeast Plus System

El RapID Yeast Plus System (Remel) es un


sistema compuesto por un panel de 18 pocillos; cada
uno contiene un sustrato convencional o cromogni-
co que detecta la asimilacin de carbohidratos,
cidos orgnicos o aminocidos, as como la hidr-
lisis de la urea y de cidos grasos. Permite identifi-
car hasta 43 especies de levaduras (Figura 11.30).
Figura 11.30. Sistema RapID Yeast Plus System (Remel).

RapID Yeast Plus Sistem

Procedimiento

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1. A partir de un cultivo joven, preparar un inculo
con turbidez 3 de McFarland en 2 ml del Rapid
Inoculation Fluid.
2. Inocular el panel con la suspensin anterior, incli-
nando y agitando el dispositivo para conseguir una Figura 11.31. Lectura del Sistema RapID Yeast Plus System.
distribucin pareja del inculo. Sellar la bandeja.
3. Incubar el panel a 30 C durante 4-5 h.
Fongiscreen 4H
Lectura e interpretacin
Fongiscreen 4H (Bio-Rad) es un sistema
Leer directamente los primeros seis pocillos que basado en el estudio del perfil enzimtico de algu-
contienen hidratos de carbono en busca de un nas levaduras, permitiendo identificar en 4 h
cambio de color. Los pocillos 7-14 se leen des- C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis y C. neofor-
pus de agregar el reactivo A y los restantes tras
agregar el reactivo B (Figura 11.31).
mans (Figura 11.32). La utilizacin de sustratos des-
hidratados por las enzimas fngicas se manifiesta
Las reacciones se anotan en un formulario espe- por un cambio de color, ya sea espontneamente o
cial, obtenindose un cdigo de 8 dgitos. Este
cdigo se compara con la serie de perfiles numri-
despus de aadir un reactivo revelador.
cos incluida en el libro de compendio suministrado
por el fabricante.

Fongiscreen 4H

Procedimiento
1. Obtener una suspensin de la levadura a identifi-
car a partir de un cultivo joven (24-48 h) en cual-
quiera de los medios habituales. La turbidez de la
suspensin debe ser equivalente a la del testigo
suministrado por el fabricante, aproximadamente 4
McFarland.
2. Inocular 3 gotas de la suspensin anterior en cada
uno de los 6 pocillos de la microplaca y cubrir con
el adhesivo suministrado por el fabricante.
3. Incubar a 37 C durante 4 h.

Lectura e Interpretacin
La lectura se lleva a cabo mediante la adicin de
reactivos o por lectura directa.
Los resultados se interpretan comparando el perfil
obtenido con los perfiles especficos suministrados
por el fabricante. Figura 11.32. Sistema Fongiscreen (Bio-Rad).
Identificacin de levaduras 11-17

11.4. Identificacin mediante


criterios inmunolgicos 11.4.2. Krusei-color

Krusei-color (Fumouze) es un mtodo para la


11.4.1. Bichro-latex albicans identificacin de aislamientos de C. krusei por aglu-
tinacin de partculas de ltex, mediante un
anticuerpo monoclonal que reacciona especfica-
Bichro-latex albicans (Fumouze) es un mto- mente con el antgeno localizado en su pared
do para la identificacin rpida de aislamientos (Figura 11.34).
C. albicans por aglutinacin de partculas ltex uti-
lizando un anticuerpo monoclonal especfico de El kit contiene un reactivo Krusei-color y
C. albicans [10] (Figura 11.33). 5 portaobjetos.
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Figura 11.33. Sistema Bichro-latex albicans (Fumouze). El resulta- Figura 11.34. Sistema Krusei-color (Fumouze). El resultado positi-
do positivo (aglutinacin) se muestra en el panel de la izquierda. vo (aglutinacin) se muestra en el panel de la izquierda.

Bichro-latex albicans Krusei color

Procedimiento Procedimiento
1. Reconstituir un vial del agente disociante, con el 1. Resuspender el ltex antes de su uso.
volumen de agua destilada indicada. 2. Por cada cepa a identificar dispensar una gota del
2. Depositar 20 l del agente disociante sobre un reactivo de ltex en el crculo del portaobjetos.
crculo del portaobjetos. 3. Mediante una pipeta Pasteur o un asa de platino,
3. A partir de un cultivo de 24-48 h en SDA, u otro aadir 2 3 colonias a la gota de ltex y homoge-
medio habitual, recoger 3-4 colonias de la levadura neizar la emulsin.
a identificar y emulsionarlas en el agente disociante.
4. Agitar en un agitador (5 min).
4. Homogeneizar la suspensin del ltex antes de su
uso. Interpretacin
5. Aadir una gota del reactivo ltex en el crculo.
Reaccin positiva: Apariencia de aglutinacin clara
6. Mezclar y extender con el agitador suministrado
y evidente de color rojo indicativa de C. krusei.
por el fabricante hasta que la suspensin sea
homognea. Reaccin negativa: Ausencia de aglutinacin.
7. Agitar en un agitador durante 5 min. La suspensin mantiene su aspecto original.
Ciertas cepas de otras especies (Ej. C. parapsilo-
Interpretacin sis), pueden producir agregados de color blanco
que no deben ser confundidos con los agregados
Reaccin positiva: Aparicin de aglutinados rojos rojos.
sobre un fondo verde: C. albicans .
Reaccin negativa: No se observa aglutinacin,
mantiene su color marrn.

La prueba se realiza con dos reactivos distin-


tos: a) bolas de ltex recubiertas con anticuerpos
monoclonales que reaccionan especficamente con
el antgeno de C. albicans localizado en su pared
celular, y b) un agente disociante que permite la
exposicin al antgeno.

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11-18 Identificacin de levaduras

11.4.3. Bichro-Dubli
Bichro-Dubli

Bichro-Dubli (Fumouze) es un mtodo Procedimiento


para la identificacin rpida de C. dubliniensis,
1. Dejar que el reactivo alcance la temperatura
basado en la coaglutinacin de blastosporas de esta ambiente.
especie con partculas de ltex recubiertas con anti-
2. Por cada cepa a ensayar, distribuir 20 l de reacti-
cuerpos monoclonales, el cual permite la deteccin vo previamente homogeneizado en el crculo de
especifica de un antgeno de C. dubliniensis locali- una tarjeta.
zado en la superficie de la clula. 3. Coger, con una pipeta pasteur o asa de platino,
2-3 colonias de la levadura.
La emulsin de colonias de C. dubliniensis 4. Emulsionar las colonias dentro de la gota de reacti-
en el reactivo Bichro-Dubli revela una coaglutina- vo y extenderla en el rea completa del crculo,
cin, visible a simple vista, entre las blastosporas hasta que la suspensin sea homognea.
que portan el antgeno y las particulas de ltex sen- 5. Balancear suavemente con un movimiento de rota-
sibilizadas con anticuerpos monoclonales, aglutina- cin y observar la presencia o ausencia de agluti-
dos azules que progresivamente se extienden hacia nacin entre 3 a 5 min.
la periferia, formando un borde azul alrededor de un
rea central roja/rosa (Figura 11.35). Interpretacin
Reaccin positiva: presencia de aglutinados colo-

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reados de azul que progresivamente se extienden
hacia la periferia, formando un borde azul alrede-
dor de un rea central roja/rosa/purpura/violeta.
Reaccin negativa: No aglutinacin (la suspensin
conserva su aspecto homogneo original)
Para detectar una posible asociacin C. albicans /
C. dubliniensis, se recomienda realizar varios test
de un cultivo.
Ciertas cepas de levaduras no- C. dubliniensis
(Ej..C. parapsilosis) pueden producir agregados
de color blanco que no deben ser confundidos con
los agregados azules.
Figura 11.35. Sistema Bichro-Dubli (Fumouze).

Como resumen, en la Figura 11.36 se expone


un esquema y un diagrama diagnstico para la
identificacin de las levaduras ms frecuentemente
aisladas en la clnica.
Identificacin de levaduras 11-19

Cultivo en SDA

Cultivo en CHROMAgar Candidaa

Colonias verdes Colonias azules Colonias violetas Colonias rosas Otros colores
rugosas

Cultivo a 45 C
Identificacin de especie
C. tropicalis C. glabrata C. krusei mediante estudios
de asimilacin

C. albicans C. dubliniensis
2007 Revista Iberoamericana de Micologa - ISBN: 978-84-611-8776-8

Confirmar identificacin
Confirmar con produccin mediante pruebas
de tubo germinal y morfolgicas y/o
clamidosporas bioqumicas

Agar harina de maz

Presencia de hifas Ausencia de hifas

Prueba de la ureasa
Artroconidias Blastoconidias

Prueba de la ureasa Especies de Candida

Prueba de los nitratos Sembrar en agar para


ascosporas

Sospecha de Sospecha de
especies de especies de
Trichosporon Geotrichum
Sospecha de Prueba de pigmento
Sospecha de
especies de melnico
especies de
Cryptococcus
Saccharomyces

Especies de Cryptococcus
Cryptococcus neoformans

Figura 11.36. Esquema de identificacin y diagrama diagnstico para las levaduras ms frecuentemente aisladas en muestras clnicas.
a: En muestras con alta sospecha de micosis por hongos levaduriformes se puede utilizar como medio de aislamiento primario.
b: Si son colonias rojas o anaranjadas en el medio de SDA se tratara de especies de Rhodotorula o Sporobolomyces. respectivamente.

Asociacin Espaola de Micologa


11-20 Identificacin de levaduras

11.5. Identificacin de levaduras Es factible recuperar estos microorganismos


lipfilas en cultivos en SDA o en agar sangre de carnero al
5% si los cubrimos con cidos grasos de cadena
larga, como los contenidos en el aceite de oliva.
Tras incubacin a 35 C durante 2 a 4 das se desa-
Debido a su requerimiento de cidos grasos, rrollan unas colonias de consistencia cremosa muy
las levaduras lipfilas no pueden ser identificadas parecidas a las producidas por las otras levaduras.
con los sistemas y medios habituales para otras
levaduras, por lo que su identificacin merece un Adems de los medios suplementados, tam-
comentario diferenciado. bin se puede utilizar medios especficos para el ais-
lamiento de las especies de este gnero, como son el
Durante mucho aos se ha venido utilizando medio Agar de Dixon modificado y el de Leeming
el binomio Malassezia furfur para designar la fase (Captulo 3). A partir de su crecimiento en estos
micelial de las levaduras lipfilas encontradas en la medios, la identificacin de las especies de
piel humana, en tanto se reservaban los trminos Malassezia se lleva a cabo mediante criterios
Pityrosporum ovale y Pityrosporum orbiculare para microscpicos y bioqumicos [13]. Entre estos lti-
los dos tipos morfolgicos de la fase levaduriforme. mos: produccin de catalasa; crecimiento en SDA
La taxonoma del gnero Malassezia ha sido no suplementado con lpidos a 32 C; crecimiento
recientemente revisada y comprende en la actuali- en Agar Dixon modificado a 32 C, 37 C y 40 C;
dad siete especies: M. furfur, M. pachydermatis, utilizacin de Tween 80, Tween 40 y Tween 20

2007 Revista Iberoamericana de Micologa - ISBN: 978-84-611-8776-8


M. sympodialis, M. globosa, M. obtusa, M. restricta (Tabla 11.2).
y M. slooffiae [13,14].

Tabla 11.2. Caractersticas fisiolgicas de las especies de Malassezia.

Especie Catalasa SDAa mDixonb


__________________________ Tween
__________________________
32 C 32 C 37 C 40 C 80 (0,1%) 40 (0,5%) 20 (10%)

Malassezia furfur + - + + + + + +
Malassezia pachydermatis + + + + + + + -
Malassezia sympodialis + - + + + + + -
Malassezia globosa + - + - - - - -
Malassezia obtusa + - + + - - - -
Malassezia restricta - - + + - - - -
Malassezia slooffiae + - + + + - + +

a: crecimiento en agar Sabouraud sin ningn suplemento lipdico


b: crecimiento en agar Dixon modificado a 32, 37 y 40 C

Nuestro ms sincero agradecimiento a D Josefa


Gonzalez Lpez, Tcnico Especialista de Laboratorio,
por la ayuda prestada en la identificacin de tantas,
tantas y tantas levaduras, y al Dr. Esteban Tarrada
Merino por la ayuda informtica y la realizacin
iconogrfica de este Captulo.
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