Prctica de laboratorio IV.

1. Tema: Tipos de siembra y tincin.

2. Objetivos:
Esterilizar de forma correcta los instrumentos de laboratorio utilizando la
llama del mechero.
Realizar subcultivos de microorganismos de forma asptica.
Obtener cultivos puros.
Realizar los siguientes tipos de siembra: siembra por extensin, siembra en
estras y siembra en profundidad.
Entender la importancia de la tincin de Gram para realizar una
identificacin preliminar de los microorganismos.
Observar los microorganismos con ayuda del microscopio ptico.

3. Introduccin:
En sus hbitats naturales, los microorganismos usualmente crecen en complejas
poblaciones mixtas formadas por una gran cantidad de especies. Esto dificulta el
estudio de los mismos para los microbilogos porque es imposible estudiar
adecuadamente un nico tipo de microorganismo en un cultivo mixto. Para
caracterizar y estudiar especies individuales es necesario obtener cultivos puros, es
decir, una poblacin de clulas que derivan de una nica clula inicial.
Si una mezcla de clulas, a una densidad relativamente baja, es extendida a lo largo
de una superficie de un medio con agar, cada clula origina a una colonia
completamente separada del resto. Una colonia es un conjunto de microorganismos,
macroscpicamente visible, sobre un medio slido. Cada colonia representa un
cultivo puro debido a que cada colonia procede de una sola clula. Existen varias
tnicas utilizadas para obtener este resultado. Entre estas tcnicas es posible
mencionar la siembra por extensin, la siembra en estras y la siembra en
profundidad.

4. Materiales y reactivos.
Reactivos:
Alcohol al 96%
Agar Tripticasa Soya (TSA).
Solucin de cloruro de sodio al 0.9% .
Agua destilada
Cristal violeta.
 Solucin de lugol.
Etanol o acetona.
Fucsina o safranina.
Materiales:
Asas bacteriolgicas.
Mechero Bunsen o lmpara de alcohol.
Tubos de ensayo y/o tubos falcon de 50 ml.
7 Pipetas de vidrio de 1mL estriles y con un tapn de algodn en el extremo
superior
Peras de goma o pipeteadores automticos.
Placas de Petri estriles.
Vasos de vidrio.
Bandeja para tincin.
Placas portaobjetos.
Soporte de placas portaobjetos.
Mtodos.
Siembra en profundidad:
1. Preparar varios tubos de ensayo con un volumen de 9 ml de solucin
fisiolgica en cada uno de ellos.
2. Con ayuda de la pipeta de vidrio o automtica, tomar 1 ml de la mezcla
microbiana y transferirla al primer tubo de ensayo. Agitar el tubo de ensayo
hasta que su contenido se homogeneice.
3. Con ayuda de una nueva pipeta de vidrio o una nueva punta (en caso de utilizar
una pipeta automtica) repetir el procedimiento anterior 9 veces cambiando
cada vez la pipeta o la punta. No olvidar agitar el tubo de ensayo antes de cada
repeticin.
4. Con ayuda de la pipeta que se utiliza en la ltima repeticin, tomar 1 ml de la
ltima y la penltima solucin y mezclar en tubos separados cada una de stas
con agar caliente (enfriado hasta unos 45 C).
5. Mezclar minuciosa y rpidamente cada una de las mezclas anteriores y
verterlas en placas de Petri estriles.
6. Agitar suavemente las placas hasta que cada una de las mezclas ocupe toda la
superficie de las mismas.
7. Dejar enfriar las mezclar y una vez solidificadas, colocarlas en posicin
invertida en un termostato por 24 horas.
8. Pasadas las 24 horas, registre los resultados.
 Figura --: Siembra en profundidad.
Siembra en estras (figura --):
1. Estirilizar el asa bacteriolgico por flameado en la parte de azul de la llama
del mechero hasta que adquiere un color rojo intenso y luego esperar unos
segundos hasta que el asa se enfre.
2. Introducir el asa en la solucin fisiolgica con microorganismos.
3. Inocular la mezcla microbiana en la periferia de la placa dibujando estras
paralelas de tal forma que ocupe aproximadamente la octaba parte de la
superficie de la placa como se indica en la figura -.
4. Estirilizar nueva el asa como se hizo en el primer paso.
5. Tocar con asa el ltimo segmento de la ltima lnea trazada durante la primera
inoculacin y dibujar las estras en direccin hacia el centro de la placa de tal
forma que las estras en total ocupen la cuarta parte de la placa.
6. Repetir el paso 4.
7. Girar la placa 90 y dibujar estras partiendo de la periferia tocando tres o
cuatro veces la parte sembrada anteriormente. Realizar este procedimiento
hasta que las nuevas estras ocupen aproximadamente la octava parte de la
superficie total de la placa.
 8. Repetir el paso 6.
9. Girar la placa unos 45 y dibujar estras tocando dos o tres veces el rea
sembrada en el paso 7 de tal forma que las nuevas estras ocupen un tercio de
la superficie total de la placa.
10.Repetir el paso 8.
11.Finalmente, volver a girar la placa unos 45 y dibujar estras a lo largo del
resto de la superficie partiendo del rea ya inoculada en los pasos 7 y 9.
12.Colocar la placa en posicin invertida en un termostato por 24 horas.
13.Pasadas las 24 horas, registre los resultados.

Siembra en estras.
Siembra por extensin (figura --):
1. Con ayuda de la pipeta de vidrio o automtica, colocar 1 ml de la mezcla
microbiana en el centro de la superficie del agar de una placa de Petri.
2. Tomar la varilla acodada de vidrio y sumergirla en etanol al 96%, luego retirar
la varilla y cerca de la parte superior del recipiento que contiene el etanol
sacudirla ligeramente para eliminar el exceso de etanol.
3. Flamear la varilla en la llama de mechero o lmpara de alcohol y esperar
algunos segundos hasta que se extinga completamente la llama de la varilla.
Nota: no soplar para extinguir la llama, puesto que esto contaminara la varilla
y sera necesario repetir los dos pasos anteriores.
4. Utilizar la varilla para extender la mezcla uniformemente por toda la
superficie del agar.
5. Colocar la placa en posicin invertida en una incubadora por 24 horas.
6. Pasadas las 24 horas, registre los resultados.
 Siembra por extensin.
Siembra por picadura o puncin.
1. Estirilizar el asa por flameado como se indica anteriormente.
2. Con ayuda del asa, tomar el material que se desea sembrar.
3. Introducir el asa con dicho material en el tubo de ensayo con medio semislido
hasta el fondo, formando un canal y retirar el asa por el mismo trayecto.
4. Colocar el tubo de ensayo en el termostato.
Tincin de Gram:
1. Colocar una placa portaobjetos limpia sobre el soporte.
2. Colocar una gota de agua estril en el centro de la placa portaobjetos.
3. Con ayuda del asa, tomar parte de una colonia que se desea analizar, colocarla
en la gota de agua de restregarla hasta que la gota adquiera una apariencia
homognea.
4. Colocar la placa portaobjetos cerca de la llama del mechero Bunsen o la
lmpara de alcohol hasta que la gota se seque.
5. Sujetar la placa portaobjetos con una pinza metlica y pasarla rpidamente
dos o tres veces por la llama de un mechero Bunsen con el objetivo de fijar la
muestra.
6. Posicionar la placa portaobjetos en un soporte y llevar el soporte al lavabo.
7. Empapar la muestra con cristal violeta por 30 segundos.
8. Enjuagar suavemente el cristal violeta y empapar la muestra con solucin de
lugol por al menos 30 segundos.
9. Enjuagar la solucin de lugol y agregar una mezcla de etanol y acetona por
15-30 segundos.
10.Enjuagar la muestra y empapar finalmente la muestra con fucsina o safranina
por 30 segundos.
11.Enjuagar la muestra y secar la placa portaobjetos con papel higinico.
12.Agregar sobre la muestra una gota de aceite de inmersin.
13.Colocar la placa en la platina mecnica del microscopio y seleccionar el lente
objetivo de mayor aumento (100).
 14.Con ayuda del mando macromtrico, descender el lente objetivo hasta el lugar
donde se encuentra el aceite de inmersin en la placa portaobjetos y hasta
observar la reflexin de la luz del microscopio.
15.Girar ligeramente el mando macromtrico y el micromtrico a cualquier lado
hasta distinguir el campo de observacin.

Igor Astudillo.MsC