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Introduccin a la Microbiologa Ambiental

La microbiologa Ambiental es la ciencia encargada del estudio de los seres ms


diminutos denominados microorganismos y su comportamiento en el desarrollo de
bioprocesos que nos puedan ayudar en la descontaminacin ambiental del suelo,
agua o aire, etimolgicamente estos seres vivos y pequeos que en su gran
mayora slo son visibles al poder resolutivo del microscopio, vienen de las
palabras mikros (pequeo), bios (vida) y logos (estudio), es decir, es el estudio de
la vida en su mnima expresin.

La Microbiologa Ambiental, es el estudio de la funcin y diversidad de los


microorganismos en sus entornos naturales. Incluye la Ecologa Microbiana, la
Geomicrobiologa, la diversidad microbiana y la Biorremediacin.
Requiere fundamentalmente de un amplio conocimiento y comprensin de los
procesos bsicos de tipo fsico, qumico y biolgico que se dan en la naturaleza
para la solucin de problemas ambientales, debido a esto es necesario un
personal idneo que afronte esta problemtica que integra casi todas las ramas
del saber y que deben confluir en un esfuerzo por lograr una adecuada relacin
del hombre con su entorno.

Se analiza la problemtica ambiental desde una amplia ptica biolgica, con una
visin integral de los componentes del medio ambiente, de tal forma que se
pueden formular polticas ambientales basadas en procesos investigativos.
Igualmente se realizan estudios de impacto ambiental que son definitivos para la
toma de decisiones en relacin con la construccin de obras y otras actividades
que afecten el medio ambiente.

Recomendaciones generales
1. La hora de entrada al laboratorio tendr 10 minutos de tolerancia,
despus de este tiempo, no se te permitir el acceso a dicho ambiente.
2. Al entrar al laboratorio, debers ponerte la bata y abotonarla
completamente, slo podrs quitrtela al salir de ste.
3. Las mesas debern estar siempre limpias y desocupadas, tu mochila
debe ser colocada en el lugar indicado por el profesor.
4. Terminantemente prohibido comer ni fumar en el laboratorio, no debes
introducirte ningn objeto a la boca.
5. Para las seoritas, recgete el pelo para efectuar el trabajo de
laboratorio.
6. Limpia y desinfecta el rea de trabajo antes y despus de usarlo.
7. No pasees entre las mesas del laboratorio, el trabajo debes efectuarlo
sentado y en tu equipo de trabajo.
8. Das antes de iniciar la prctica lee cuidadosamente que es lo que se va
a realizar, si no entiendes pregunta al profesor.
9. Si hay necesidad de llevar material biolgico para la realizacin de la
prctica, es necesario que lo consigas, de lo contrario la prctica se
suspender para todo el equipo.
10. Informa al profesor de cualquier accidente que ocurra.
11. En caso de derramar material que contenga microorganismos,
cbrelo con fenol y deja actuar diez minutos. Avisa al profesor.
12. Todo el material que vas a incubar o desechar, debes colocarlo en
el sitio indicado por el profesor.
13. Etiqueta todo el material que vas a incubar con los siguientes
datos: equipo, grupo, fecha y nombre del material
14. Despus de la incubacin es necesario la esterilizacin del
material para eliminar microorganismos que pudieran hacernos dao a
nuestra salud.
15. Lvate las manos con agua y jabn antes de salir del laboratorio.
16. Es obligacin de cada equipo entregar todo el material limpio.

PRACTICA N 01:
Manejo del microscopio y el mundo
microbiano
Introduccin

Los microorganismos o microbios son un extenso y variado grupo de seres


vivos que debido a sus reducidas dimensiones, slo pueden ser observados
con el microscopio ptico, e incluso en algunas ocasiones es necesario
recurrir al microscopio electrnico. Pueden existir como formas celulares
aisladas, libres e independientes, capaces de llevar a cabo sus procesos
vitales de reproduccin, generacin de energa y crecimiento, o como
agrupaciones celulares. Tambin son microorganismos los virus, que son
microscpicos pero no celulares. Existen cinco grupos, que excepto por el
tamao, no estn relacionados entre s: bacterias, algas, hongos, protozoos y
virus.
La diferencia entre ellos radica en su estructura: las bacterias son clulas
procariotas, las algas, hongos y protozoos son eucariotas, (como animales y
plantas).
La ciencia que estudia los microorganismos se denomina Microbiologa.

Objetivos

Identificar las partes del microscopio ptico y saber emplear su correcto


uso.
Reconocer los diferentes microorganismos que existen en las muestras
tomadas y observadas en el microscopio ptico.
El alumno deber obtener una visin general de la materia en estudio.
Identificar los materiales y equipos ms usados en el laboratorio y sus
funciones.
Manipular materiales y equipos de uso y cuidados especficos.

Fundamento Terico

Microscopio ptico es un microscopio basado en lentes pticos. Tambin se le


conoce como microscopio de luz, (que utiliza luz o "fotones") o microscopio de
campo claro. El desarrollo de este aparato suele asociarse con los trabajos de
Anton van Leeuwenhoek. Aumenta el tamao de los objetos que son realmente
muy pequeos y que no se pueden ver a simple vista, a su vez puede ser
monocular, binocular entre otros.
Estructura y Manejo del Microscopio ptico

Las partes esenciales que componen un microscopio ptico son:


Parte Mecnica:
Pie o soporte: sirve como base al microscopio y en l se encuentra la
fuente de iluminacin.
Platina: superficie sobre la que se colocan las preparaciones. En el
centro se encuentra un orificio que permite el paso de la luz. Sobre la
platina hay un sistema de pinza o similar, para sujetar el portaobjetos
con la preparacin, y unas escalas que ayudan a conocer qu parte de
la muestra se est observando. La platina presenta 2 tornillos,
generalmente situados en la parte inferior de la misma, que permiten
desplazar la preparacin sobre la platina, en sentido longitudinal y
transversal respectivamente.
Tubo: cilindro hueco que forma el cuerpo del microscopio. Constituye el
soporte de oculares y objetivos.
Revlver porta-objetivos: estructura giratoria que contiene los objetivos.
Brazo o asa: une el tubo a la platina. Lugar por el que se debe tomar el
microscopio para trasladarlo de lugar.
Tornillo macromtrico o de enfoque grosero: sirve para obtener un primer
enfoque de la muestra al utilizarse el objetivo de menor aumento.
Desplaza la platina verticalmente de forma perceptible.
Tornillo micromtrico o de enfoque fino: sirve para un enfoque preciso de
la muestra, una vez que se ha realizado el enfoque con el macromtrico.
Tambin desplaza verticalmente la platina, pero de forma prcticamente
imperceptible. Es el nico tornillo de enfoque que se utiliza, una vez
realizado el primer enfoque, al ir cambiando a objetivos de mayor
aumento.

Parte ptica:

Oculares: son los sistemas de lentes ms cercanos al ojo del


observador, situados en la parte superior del microscopio. Son cilindros
huecos provistos de lentes convergentes cuyo aumento se resea en la
parte superior de los mismos (normalmente 10X en los microscopios que
se utilizarn en esta prctica). Dependiendo de que exista uno o dos
oculares, los microscopios pueden se mono o binoculares.
Objetivos: son sistemas de lentes convergentes que se acoplan en la
parte inferior del tubo, mediante el revlver. En esta estructura se
pueden acoplar varios objetivos (ordenados de forma creciente segn
sus aumentos, en el sentido de las agujas el reloj). Un anillo coloreado
es distintivo de los aumentos de cada objetivo, que tambin van
reseados en el lateral del mismo. Algunos objetivos no enfocan bien la
preparacin al aire, y se deben de utilizar con un aceite de inmersin
(normalmente van marcados con un anillo rojo). Estos objetivos de
inmersin no se utilizarn normalmente en estas prcticas.
Condensador: sistema de lentes convergentes que capta los rayos de
luz y los concentra sobre la preparacin, de manera que proporciona
mayor o menos contraste. Se regula en altura mediante un tornillo (letra
J de la figura).
Fuente de iluminacin: en los microscopios a utilizar, el aparato de
iluminacin est constituido por una lmpara halgena de bajo voltaje
(12V) situada en el pie del microscopio. La luz procedente de la bombilla
pasa por un reflector que enva los rayos luminosos hacia la platina.
Diafragma o iris: sobre el reflector de la fuente de iluminacin. Abrindolo
o cerrndolo permite graduar la intensidad de la luz.
Transformador: ya que el voltaje de la bombilla es menor que el de la
red, es necesario para enchufar el microscopio. Algunos modelos ya lo
llevan incorporado en el pie del microscopio. Adems, el transformador
dispone de un potencimetro para regular la intensidad de la luz.
Montaje y Enfoque de una Preparacin
Microscpica

Antes de observar la preparacin al microscopio, esta debe de ser montada


sobre vidrio.

Para ello existen dos piezas de vidrio denominadas portaobjetos (porta), que,
como su nombre indica, es el soporte sobre el que va la muestra,
y cubreobjetos (cubre) que siempre ha de colocarse sobre la muestra. Una vez
colocada la muestra en el porta, se debe aadir una gota de agua, o de la
solucin acuosa pertinente, antes de colocar el cubre, para evitar interfases
agua-aire, que provocan zonas ciegas.

Para enfocar la preparacin se ha de seguir de forma minuciosa el protocolo


descrito debajo de la figura.

Consejos prcticos:

En los microscopios que requieren transformador, el enchufe a la red y


desenchufe debe hacerse sobre el transformador, y nunca debe desenchufarse
el microscopio del transformador.

Se debe mantener apagada la luz del microscopio siempre que no se est


utilizando, ya que la vida media de la bombilla es corta.

Siempre se debe comenzar el enfoque con el objetivo de menor aumento.


Anotar siempre el nmero de aumentos con el que se observa la preparacin.
Para calcularlo basta multiplicar el nmero de aumentos del objetivo por el de
los oculares. Hacer esquemas y dibujos de lo observado con cada aumento.

Salvo que se indique lo contrario no utilizar nunca el objetivo de inmersin, ya


que se requiere un aceite especial sin el que, adems de no enfocar bien,
existe una gran probabilidad de daar la lente al rozar con el cubreobjetos.

Los pasos a seguir para la perfecta utilizacin del microscopio son las
siguientes:

1. Proyectar la luz a travs del espejo con tal de que el espacio observable
en la lente se encuentre con la debida iluminacin para observar las
muestras.
2. Colocar la preparacin sobre la platina de forma que la estructura a
observar quede en el orificio central de la platina.
3. Poner el objetivo de menor aumento cuyo amplio campo visual facilita el
hallazgo de estructuras importantes.
4. Subir la pletina accionando el tornillo macromtrico y mirando la
preparacin desde fuera hasta alcanzar el tope superior. En ningn caso
tocar la preparacin con los objetivos.
5. Mirando por los oculares, bajar lentamente la platina con el
tornillo macromtrico hasta conseguir ver el objeto lo ms ntido posible.
6. Ajustar el enfoque con el tornillo micromtrico hasta verlo claramente.

Para observar otros campos, desplazar la preparacin moviendo los tornillos de


la platina.

Para cambiar la preparacin:

1. Bajar la platina.
2. Colocar el objetivo de menor aumento
3. Quitar la preparacin y colocar la siguiente

Procedimiento Experimental

a) Materiales:
Microscopio compuesto
Porta y cubre objetos
Gotero
Agua estancada

b) Experimentacin:

Colocar en el porta objeto una gota de agua estancada con ayuda del gotero,
luego colocar sobre ella el cubre objeto, luego enfocar y observar en el
microscopio.

1) Antes de preparar la muestra agitamos el frasco que contiene el


agua estancada, con el fin de suspender a los microorganismos
presente.
2) En el centro de un portaobjetos se coloca una gota de agua
estancada, con ayuda del gotero.

3) Con una laminilla se cubre cuidadosamente dicha gota, sin formar


burbujas de aire

4) Con un objetivo de 10 se observa pequeos microorganismos


desplazndose de manera catica

5) Observacin: microorganismos desplazndose caticamente:


Conclusiones

La prctica nos da a conocer los usos que tiene un microscopio, su manejo;


adems los microorganismos que existen en el agua estancada junto con sus
caractersticas, formas y tamaos.

Cuestionario

1. Qu es poder de resolucin?

El poder resolutivo es la capacidad que tiene un microscopio de percibir por


separado dos puntos pequeos, adyacentes y cercanos. Asimismo, es la
capacidad para percibir detalles, aumenta a medida que disminuye la distancia
que separa dichos puntos. Es decir, si dos puntos distan 1cm uno del otro y yo
los veo como un solo punto borroso tendr menor poder resolutivo que alguien
que los distingue por separado o que distingue perfectamente puntos que
distan de 0,5cm entre s.

2. Con qu finalidad se utiliza el microscopio compuesto?

Microscopio Compuesto o tambin microscopio ptico que tiene ms de una


lente de objetivo, tambin se le conoce como microscopio de luz, (que utiliza
luz o "fotones").Aumenta el tamao de los objetos que son realmente muy
pequeos y que no se pueden ver a simple vista, su finalidad es poder hacer
observaciones con diferentes aumentos en un solo microscopio.

3. Cul es la importancia que tiene el diafragma en el microscopio?

Tambin conocido como el iris, que es un disco giratorio que tiene como
funcin graduar la cantidad de luz que llega a la muestra.
4. Qu diferencias hay entre el microscopio ptico y electrnico?

Microscopio ptico Microscopio


Electrnico
Imagen dada por Interferencia de rayos Dispersin de electrones
luminosos
Fuente Luz(fotones) Filamento de tungsteno
Elementos Lentes: ocular, Bobinas
objetivo, electromagnticas
condensador
Estudian clulas Vivas o muertas Muertas
Observacin de la Coloreada o no Sin coloracin o con
muestra aumento de contraste
con tcnicas especiales
Lmite de resolucin 2500 A a 0.25 10 A a 2A
micrmetros
Longitud de onda 5500 A (trmino 0.056 A
medio)
Aumento 500X a 1500X 20000X a 160.000X con
lente
intermedia.1.000.000X o
ms con aumento
fotogrfico
Nivel de observacin Estructuras Ultraestructura

5. Qu importancia tiene el estudiar y observar los microorganismos


en muestras biolgicas frescas?

En trmino general si, por que la materia se puede descomponer, sufrir


cambios y dar resultados errneos. Tanto el material biolgico como las
preparaciones deben estar en buenas condiciones.

Cuando se hace una preparacin y se deja enfrascada por mucho tiempo,


tiende a cambiar el pH y esto puede afectar los experimentos. Por ello tambin
depende del estudio, por ejemplo se puede estudiar una muestra de un
microorganismo en una placa guardada hace aos, obviamente que ha sido
guardada usando ciertas tcnicas para ser conservada.
Sin embargo si se trabaja con material viejo puede ser que las clulas, tejidos,
etc. hayan sufrido un cambio pese a las condiciones naturales, o simplemente
mueran

6. Escribe el nombre de cada una de las partes del microscopio


compuesto

Sistema Mecnico: Conjunto de piezas que sirven de soporte a las lentes y


dems elementos (pie o base, columna, mecanismo de enfoque, platina,
revolver, tubo).

Sistema ptico: Conjunto de lentes responsables del poder de aumento y


resolucin (objetivos y ocular).

Sistema de Iluminacin: Elementos que producen las radiaciones (luz visible o


no) y transmiten, reflejan y regulan tanto la intensidad como la cantidad de
rayos que van a incidir sobre el espcimen (lmpara o fuente de iluminacin,
espejo, condensador y diafragma).

Accesorios: Son aditivos que permiten extender las capacidades del


instrumento (cmaras fotogrficas, de video, computadoras, accesorios para
dibujar, entre otros).

1. Base. Sostn del instrumento.


2. Columna o brazo. Sostiene los lentes oculares y los lentes objetivos.
3. Platina. Superficie para colocar la laminilla.
4. Ajuste mecnico de la platina. Ajuste para mover la laminilla.
5. Revlver. Contiene los lentes objetivos.
6. Lentes objetivos. Lentes principales del microscopio. Estos lentes son
parafocales porque permiten que la imagen quede casi enfocada al cambiar de
objetivo. Usualmente hay cuatro lentes objetivos: a. Rastreo magnifica cuatro
veces (4x) b. Baja potencia 10x c. Alta potencia 40x d. Inmersin de aceite
100x
7. Cabezal. Contiene los lentes oculares.
8. Lentes oculares. El microscopio es monocular si tiene un ocular y binocular
si tiene dos oculares. Los oculares magnifican diez veces (10x) y uno de ellos
puede tener un puntero.
9. Anillo de enfoque del lente ocular izquierdo. Se usa para enfocar bien la
imagen con el ojo izquierdo luego de haber enfocado con el ojo derecho; este
ajuste compensa por la diferencia entre la agudeza visual de ambos ojos.
10. Ajuste de distancia interpupilar. Aumenta o disminuye la distancia entre
los lentes oculares para compensar por diferencias en la distancia entre los dos
ojos.
11. Tornillo macromtrico o ajuste grueso. Sube y baja la platina
rpidamente; slo se usa con los lentes objetivos de 4x y 10x.
12. Tornillo micromtrico o ajuste fino. Sube y baja la platina muy
lentamente; se usa con todos los lentes objetivos para perfeccionar el enfoque
de la imagen.
13. Iluminador o lmpara. Provee una intensidad variable de iluminacin.
14. Interruptor. Prende y apaga el iluminador.
15. Indicador de encendido.
16. Ajuste de iluminacin. Controla la intensidad de la iluminacin.
17. Condensador. Enfoca la luz en el plano de la laminilla.
18. Ajuste del condensador. Sube y baja el condensador, aunque ste
siempre debe quedar un poco por debajo de su posicin ms alta.
19. Diafragma. Controla el dimetro del rayo de luz que llega a la laminilla; no
debe usarse para aumentar o dismunuir la intensidad de la iluminacin. Al
disminuir la apertura del diafragma, se aumenta el contraste de la imagen y la
profundidad del foco, pero se disminuye la resolucin. Para obtener la mejor
imagen posible hay que cambiar la apertura del diafragma cada vez que
cambia el lente objetivo.
20. Filtro azul. Absorbe el exceso de luz roja y amarilla que produce el
iluminador de tungsteno para que la iluminacin sea ms similar a la luz
natural.
PRCTICA N 02:

Coloraciones bacterianas: coloracin de


Gram
Introduccin
Existen numerosos colorantes, y en su mayora son compuestos orgnicos
naturales que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares.
Los colorantes que se utilizan usualmente son molculas cargadas
positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los componentes
celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los
polisacridos (azul de metileno, el cristal violeta y la safranina); otros
colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) los que se
combinan con los elementos celulares cargados positivamente, como son las
protenas (Eosina, la fucsina cida y el rojo Congo). Existe otro grupo de
colorantes conformado por sustancias liposolubles; los colorantes de este
grupo se combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose
generalmente para revelar la localizacin de los depsitos de grasa (negro
de Sudn).

Objetivo

Mostrar la importancia de una tincin para la diferenciacin de bacterias


basndose en las propiedades estructurales de la pared celular, aplicando
el mecanismo de la coloracin de Gram, con microorganismos conocidos
y desconocidos.
Mostrar la importancia de una tincin para la diferenciacin de bacterias
basndose en las propiedades estructurales de la pared celular, aplicando
el mecanismo de la coloracin de Gram, con microorganismos conocidos
y desconocidos.
Realizar lecturas microscpicas para identificar a las bacterias Gram-
positivas y a las Gram-negativas

Fundamento Terico

La tincin Gram es empleada en microbiologa para la visualizacin de


bacterias en muestras clnicas. Tambin se emplea como primer paso en la
diferenciacin bacteriana. El examen con microscopio ptico de preparacin
con tincin de Gram se emplea de rutina para determinar la forma de las
bacterias. Las formas comunes son cocos, bacilos y formas espiraladas.

Las bacterias pueden diferenciarse con esta tincin en dos grupos. Los
microorganismos Gram positivos se tien de azul, mientras que
aproximadamente un tercio de los cocos, la mitad de los bacilos y todos los
organismos espiralados se tien de rojo y se dice que son Gram negativos.

Las aplicaciones ms comunes de la coloracin de Gram son las siguientes:

La presencia de cocos Gram positivos agrupados sugiere estafilococos;


en cadenas sugiere estreptococos; en forma de lanceta a los diplococos
La presencia de diplococos Gram negativos son caractersticas de
especies de Neisseria
Los bacilos Gram positivos grandes sugieren especies de Bacillus o
Clostridium, los bacilos Gram positivos pequeos sugieren especies de
Listeria o una de las corineiformes (difteroides)
Los bacilos Gram negativos son las bacterias ms comunes halladas en
los laboratorios clnicos e incluyen a Enterobacteriaceae, bacilos no
fermentados y especies de Haemophilus.
El valor diagnstico de esta tincin es variable; normalmente permite
una buena orientacin al microbilogo para seleccionar las tcnicas de
cultivo ms adecuadas y tambin tiene valor en orientar hacia un
diagnstico etiolgico, en especial para instaurar un tratamiento inicial.
TINCIN DIFERENCIAL DE GRAM
Esta tincin se denomina as por el bacterilogo dans Christian Gram,
quien la desarrollo en 1844. Este mtodo divide las bacterias en dos
grandes grupos, las Gram positivas y las Gram negativas. Esto es esencial
para la clasificacin y diferenciacin de microorganismos. La reaccin a la
tincin de Gram est basada en la diferencia en la composicin qumica de
la pared celular bacteriana. Las bacterias Gram positivas tienen una gruesa
capa de peptidoglucano o murena, mientras que esta capa es ms fina en
las Gram negativas y est rodeada por una bicapa lipdica externa. El
peptidoglucano es un polisacrido por dos sub unidades qumicas el N-
acetilglucosamina y el N-acetilmuramico.

Procedimiento Experimental

A) Materiales:
Microscopio
Asa de kolle
Mechero
Porta objetos
Gotero
Reactivos
Cristal violeta
Alcohol acetona
Safranina
Lugol
Aceite de inmersin

B) Experimentacin:
1. Para el presente experimento
tomamos dos muestras de la concentracin microbiana bucal de dos
alumnos.

2. Colocamos una pequea gota de agua en el centro de dos portaobjetos


limpios. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede
usar el asa de siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento
queda retenida una mnima gota de agua, que resulta suficiente.

3. Flamea el asa de siembra y toma en condiciones aspticas una pequea


cantidad del cultivo bacteriano bucal y transfirelo a la gota de agua.

4. Acerca la lmina a la llama del mechero para que la muestra se seque


en forma paulatina para ambas lminas. En este caso hay que tener

mucha precaucin de no calentar demasiado la lmina, pues las clulas


pueden deformarse o romperse.

5. Teir con cristal violeta por 1 minuto.


6. Lavar con abundante agua el exceso de colorante, cubrir con Lugol por 1
minuto.

7. Agregamos el alcohol acetona hasta que se desprenda el colorante


hasta que la preparacin deje de perder color (30seg), lavamos con
agua destilada.

8. Tie con safranina 1 minuto.

9. Lava con agua para eliminar el colorante de contraste.


10. Seca la preparacin.

11. Examina al microscopio con aceite de inmersin (aceite de cedro) y


fijndote sobre todo en el color de cada preparacin.

Observacin: cultivo de bacterias

Esta muestra es de un cultivo de bacterias, observamos cocos y bacilos

Conclusiones

La tincin de Gram es una herramienta muy til en el laboratorio de


microbiologa as como en los anlisis clnicos y diagnostico medico siendo
ineludible conocer su fundamento y procedimiento, para poder tener una
correcta interpretacin de los datos que nos otorga la diferenciacin de Gram
positiva y negativa concluyendo que debido a la estructura de sus paredes
celulares tendrn o no propiedades patolgicas diferentes.

Cuestionario
1. Qu es un colorante? Tipos

Un colorante es una sustancia que es capaz de teir las fibras vegetales y


animales.

En qumica, se llama colorante a la sustancia capaz de absorber determinadas


longitudes de onda de espectro visible. Los colorantes son sustancias que se
fijan en otras sustancias y las dotan de color de manera estable ante factores
fsicos/qumicos como por ejemplo: luz, lavados, agentes oxidantes, etc.

Tipos:

Segn su origen:

Colorantes naturales: como la hematoxilina, el carmn y la orcena.

Colorantes sintticos o artificiales: como el azul de metileno, la safranina, azul


de anilina, el naranja G, etc.

Segn sus propiedades qumicas:

La mayora de los colorantes empleados en histologa actan como cidos o


bases y tienden a formar uniones salinas con radicales ionizables presentes en
los tejidos.

Colorantes cidos: como por ejemplo la eosina, colorante cargado en forma


negativa, se une a componentes celulares cargados positivamente. Estos
componentes cargados positivamente se denominan acidfilos, porque tienen
afinidad por los colorantes cidos.

Colorantes bsicos: como por ejemplo el azul de metileno, colorante cargado


positivamente, se une a componentes celulares cargados negativamente. Estos
componentes cargados negativamente se denominan basfilos, porque tienen
afinidad por los colorantes bsicos.

Colorantes neutros: son colorantes en los que la porcin cida y la bsica


colorean. Tien las partes bsicas de una clula de un color y las partes cidas
de otro. Tien el ncleo de un color y el citoplasma de otro. Ej.: el eosinato de
azul de metileno.
Colorantes indiferentes: tien aquellas estructuras o sustancias que los
disuelven ms fcilmente que el lquido en que estn preparados. Un ejemplo
es el colorante sudan, un colorante de lpidos.

2. Con qu finalidad se fija la muestra de microorganismos en el


portaobjetos?

Para preservar su estructura morfolgica externa en caso la fijacin se haya


realizado a travs del calor y en caso se haya realizado fijacin qumica con
agentes como el etanol o el cido actico es para preservar su estructura
interna. La fijacin dejar al microorganismo en un lugar determinado, lo que
facilitar su observacin al microscopio.

3. Qu tipos de coloraciones conoces, descrbelos.

Tincin de Gram: utiliza varios colorantes (cristal violeta 1m, Yodo 1m, lavado
con alcohol, Safranina 30 seg.).

Tincin cido Resistente: Una vez teidos, conservan su color resistiendo al


lavado con cido mineral reducido. En esta tincin las bacterias cido
resistentes conservan el colorante primario color rosa o rojo, los dems
microorganismos son decolorados por el cido y toman el color azul.

Tincin de Esporas: Se usa verde de malaquita en contraste con safranina.

4. Por qu es necesario emplear aceite de inmersin para la observacin


de los microorganismos?

Es un aceite hecho principalmente a base de aceite mineral que se utiliza


cuando quieres ver en el microscopio algn material fijado a un portaobjetos sin
utilizar cubreobjetos, es necesario para ver frotis bacterianos, se coloca una
gota sobre el frotis fijado al portaobjetos y sumergir la lente del microscopio
para ser observado.

5. De los reactivos que utilizaste para la tincin de Gram, El cristal


violeta a qu estructuras de la bacteria colorea?
En las Gram Positivas tie la pared bacteriana, penetra por sus poros tiendo
toda la clula en cambio en las Gram Negativas slo tie la pared bacteriana,
sucede slo por encima.

6. Por qu se dice que la coloracin Gram es de orientacin?

La coloracin de Gram como herramienta diagnstica ya que en primera


instancia permite caracterizar tamao, forma y/o agrupacin bacteriana, la
reaccin tintorial y el germen predominante en una infeccin o en muestras
contaminadas con biota normal.

7. Menciona cinco bacterias Gram positivas y escribe la enfermedad que


causa cada una de ellas.

Staphylococcus aureus. Responsable de abscesos, dermatitis, infecciones


localizadas y posibles gastroenteritis.

Streptococcus pyrogenes. Causante de infecciones supurativas en el


trayecto respiratorio, as como de fiebre reumtica.

Streptococcus aglactiae. Frecuente en casos de meningitis neonatal,


endometritis y neumona.

Streptococcus faecalis. Usual en infecciones en vas biliares y urinarias,


habita en el colon humano.

Streptococcus pneumoniae. Responsable de neumonas e infecciones en


las vas respiratorias, as como otitis, meningitis y peritonitis.

8. Menciona cinco bacterias Gram negativas y escribe la enfermedad que


causa cada una de ellas.

Neisseria meningitidis. Peligrosa bacteria causante de meningitis y


meningocococemias, coloniza las vas respiratorias humanas y asciende a las
meninges por va sangunea.

Neisseria gonorrhoeae. Conocidsima por ser la causante de la gonorrea,


comn enfermedad de transmisin sexual.
Escherichia coli. Habitante usual del colon humano, est involucrada en las
llamadas diarreas del viajero, as como en meningitis neonatal, sepsis e
infecciones urinarias.

Salmonella typhi. Bacteria responsable de la enfermedad conocida como


fiebre tifoidea, suele transmitirse por va fecal-oral: contaminacin de aguas,
mala disposicin de excretas o higiene defectuosa.

Salmonella enteritidis. Suele ocasionar enterocoitis y septicemia con


abscesos si llega a pasar del intestino a la sangre.

PRCTICA N 03:
Coloracin cido-alcohol resistente

Introduccin

Los bacilos tuberculosos son difciles de teir con la tincin de Gram, y se


observan como bacilos Gram positivos con tincin irregular. Estos
microorganismos una vez coloreados son resistentes a la decoloracin cido-
alcohlica y por eso se denominan Bacilos cido Alcohol Resistentes (BAAR)

El gnero Mycobacterium incluye ms de 100 especies que pueden clasificarse


en seis grupos desde el punto de vista bacteriolgico, pero con fines didcticos
se dividen en tres apartados: Complejo tuberculosis. Incluye las especies M.
tuberculosis, Mycobacterium bovis y Mycobacterium africanum, productoras
todas ellas de tuberculosis. Se incluye tambin Mycobacterium microti,
productor de tuberculosis en rata.

Objetivos
El alumno aplicar las tcnicas de coloracin de microorganismos cido-
resistentes para diferenciarlos e identificarlos, en base a sus
propiedades morfolgicas
El alumno sabr las caractersticas morfolgicas del bacilo de la
tuberculosis y su resistencia a la desecacin.

Fundamento Terico

Es la propiedad fsica de algunas bacterias a la resistencia a la decoloracin de


la fucsina bsica (rojo) la cual penetra en la clula por accin del fenol y el
calor.

Las bacterias cido-alcohol resistentes no pueden ser clasificados segn la


tincin de Gram, la cual es la tcnica ms comn en la microbiologa
contempornea, sin embargo puede ser teido con algunas tinciones
concentradas combinadas con calor. Una vez teida tiene la capacidad de
resistir la decoloracin de una combinacin de alcohol- cido, el cual es el
decolorante ms comn en los protocolos de tincin de bacterias, de donde
viene el nombre Alcohol-cido resistente.

La alta concentracin de cido miclico en la pared celular es la causante,


como las bacterias del gnero Mycobacterium, de la baja absorcin y alta
retencin de la tincin (fucsina). La forma ms comn para poder identificar
este tipo de bacterias es a travs de la tcnica de tincin de Ziehl-Neelsen,
donde la bacteria queda teida en rojo y se agrega una tincin de contraste de
nombre azul de metileno la cual permite apreciar de mejor forma la bacteria.

TINCION DE ZIEHL NEELSEN

La tincin de Ziehl-Neelsen(BAAR) es una tcnica de tincin diferencial rpida


y econmica, para la identificacin de microorganismos patgenos, por ejemplo
M. tuberculosis. Fue descrita por primera vez por dos mdicos alemanes, Franz
Ziehl (1859 a1926), un bacterilogo y Friedrich Neelsen (1854 to 1894), un
patlogo.

Este mtodo se basa en que las paredes celulares de ciertos parsitos y


bacterias contienen cido graso (por ejemplo, el cido miclico) de cadena
larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la
decoloracin con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos.
Por esto se denominan cido-alcohol resistencia o BAAR. La coloracin
clsica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese
la pared bacteriana que contiene ceras.

Datos del experimento


Materiales

Microscopio
Mechero
Porta objetos
Gotero

Reactivos

Esputo de tuberculoso procesado en autoclave.


Fucsina fenicada de Ziehl- Neelsen
Alcohol acido
Azul de metileno
Procedimiento
1) Colocamos la muestra en el porta objetos seguidamente hacemos el
frotis, haciendo un delgado extendido del material. Y dejamos que seque
al aire.

2) Le damos una lavada ligera. Cubre la preparacin con fucsina fenicada,


Calienta la preparacin en un mechero Bunsen durante 5 minutos no
fijndolo directamente al mechero solo pasndolo, no debe hervir. y
esperamos que enfri unos momentos.

3) Decoloramos la preparacin con cido-alcohol, hasta que adquiera un


tenue color rosa. Nuevamente le damos una lavada.
4) Seguidamente teimos con azul de metileno por 1 minuto. Lavamos con
agua el resto del colorante.

5) Secamos la preparacin al ambiente. Luego colocamos la muestra al


microscopio y procedemos a su observacin.

Conclusiones
Se concluye que el alumno adquiri los conocimientos sobre bacterias acido
alcohol resistentes, su definicin, caractersticas tanto estructurales como
funcionales, mtodos para su identificacin y los pasos de este mtodo que dio
como resultado la observacin mediante el microscopio de este bacilo,
demostrando as que el mtodo es efectivo y que utilizando el mismo se
pueden reconocer mediante este mtodo de tincin.

Cuestionario
1. Describe las caractersticas morfolgicas del bacilo de la tuberculosis.

Es un bacilo aerobio, gram positivo dbil y fuertemente cido-alcohol resistente.


Es un patgeno intracelular, aerobio, inmvil, no esporulado de 0.4 x 3um.
Posee una pared celular compleja rica en lpidos con la estructura tpica de una
bacteria Gram positiva (membrana Citoplasmtica interna, capa de pptido-
glucanos y carente de membrana externa. En su membrana se anclan
protenas LAM (relacionadas a los lipo-polisacridos O antignicos). Contienen
gran cantidad de lpidos que incluyen cidos miclicos, ceras y fosftidos. El di-
pptido muramilo en complejo con cidos miclicos puede hacer que se formen
granulomas, los Fosfolpidos inducen la necrosis caseosa. Tambin posee un
factor de cordones que inhibe la migracin de leucocitos, causa granulomas
crnicos y a veces acta como coadyuvante inmunolgico.

2. Por qu el bacilo de Koch tiene mucha resistencia a la desecacin?

Por su pared celular que consta de una gruesa pared, separada de la


membrana celular por el espacio peri-plsmico, con cuatro capas. La ms
interna es el glico-pptido o pptido-glucanos con molculas de N-acetil-
glucosamina y cido-N-glucolilmurmico (en lugar del habitual N-acetil-
murmico) con cortas cadenas de alanina. Esta capa es el esqueleto de la
bacteria que le da forma y rigidez. Externamente, hay otras 3 capas
compuestas, una por polmeros de arabinosa y galactosa, otra formada por
cidos miclicos (que son cidos grasos derivados) y otra superficial formada
por lpidos como los sulfo-lpidos y los micsidos.

3. Describa los medios de cultivo para aislar al bacilo de Koch.

Medios Enriquecidos:

Lowenstein-Jensen: est constituido por: huevo, verde de malaquita, glicerol


(fuente de carbono) y asparaginas. Crece muy lentamente (30 a 90 das) a 37
C en atmsfera con dixido de carbono (en cultivo crecen mejor a pesar de ser
aerobio estricto), dando colonias con aspecto de migas de pan (o huevos de
araa), secas amarillentas y rugosas.

Agar Middlebrook 7H10: es un medio de crecimiento slido especialmente


utilizado para el cultivo de Mycobacterium, en particular Mycobacterium
tuberculosis. Permite detectar rpidamente y contiene varias sales inorgnicas
que proporcionan sustancias esenciales para el crecimiento de mico-bacterias.

Caldo Middlebrook 7H9: medio de cultivo liquido no selectivo con glicerol para
el cultivo de mico-bacterias.

Medios Selectivos:

Agar Middlebrook 7H11: es idntica al Agar Middlebrook 7H10, con una adicin
de digerido pancretico de casena para facilitar el crecimiento de cultivos
exigentes de M. tuberculosis.

4. En qu casos se solicita el cultivo de esputo para el diagnstico de


una posible TBC?

Cuando los estudios clnicos y la radiografa de este tipo de pacientes arrojan


sospecha de tuberculosis.

5. Cmo se hace el reporte de la coloracin Ziehl - Neelsen?

La siguiente es la escala adoptada internacionalmente para el informe de los


resultados de extendidos examinados por la tcnica de Ziehl Neelsen:
PRACTICA N 04:

Medios de cultivo

Introduccin

En los laboratorios de microbiologa se utilizan diferentes tipos de medios de


cultivo que pueden ser preparados en forma lquida o en forma slida.
Usualmente para preparar un medio slido se parte de un medio lquido al que
se le aade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la slicagel.

Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus


constituyentes en: Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias
complejas de origen animal o vegetal, las que son usualmente
complementadas por la adicin de minerales y otras sustancias.

Objetivos

Realizar el cultivo de microorganismos con diferentes muestras para


su multiplicacin e identificacin.
Tener dominio en la correcta preparacin de un medio de cultivo.
Conocer las finalidades de utilizar medios de cultivos

Fundamento Terico

Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos


es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en
el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es
el medio de cultivo.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial


debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de
humedad y presin de oxgeno adecuado, as como un grado correcto de
acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y
factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo
microorganismo contaminante.

La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares


en composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base
de muchos medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y Peptona a
la que se aadirn otros ingredientes.

El Agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de


medios de cultivo. En los diferentes medios de cultivo se encuentran
numerosos materiales de enriquecimiento como carbohidratos, suero, sangre
completa, bilis, etc.

Los carbohidratos se adicionan por dos motivos fundamentales: para


incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de
fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la
sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los
microorganismos menos resistentes.

Clasificacin

Por su Aspecto Fsico:

a) Medios lquidos:

Se emplean fundamentalmente para:

Cultivar los microorganismos y obtener grandes cantidades de los


mismos. La multiplicacin bacteriana en los medios de cultivos lquidos
se manifiesta generalmente por el enturbiamiento de ste;
Estimular y promover la seleccin de algn o algunos microorganismos e
impedir que otros se multipliquen.
Identificar al microorganismo estudiado mediante pruebas bioqumicas.

b) Medios semislidos:
Se utilizan para identificaciones bioqumicas y averiguar si el germen estudiado
es mvil. Los medios semislidos tienen una consistencia blanda. (0.5 gramos
de agar por 100 ml)

c) Medios slidos:

Se utilizan para obtener colonias aisladas de microorganismos. En los medios


de cultivos slidos la multiplicacin bacteriana se manifiesta por una formacin
macroscpica denominada colonia bacteriana, que es el resultado de la
multiplicacin de una sola clula bacteriana. (2 gramos por 100 ml)

Por su Funcin:

d) Medios de Cultivos Comunes o Bsicos:

Se caracterizan por que el material nutritivo, permite el crecimiento de


diferentes especies de bacterias, constituyen la base para la preparacin de
otros medios. Como ejemplo pueden citarse el caldo nutritivo y el agar nutritivo.

e) Medios de Cultivos Especiales:

Entre estos se encuentran:

Medios Enriquecidos: En general son los mismos medios bsicos a los


que se les agrega una sustancia enriquecedora como sangre, suero, etc.
El uso est orientado especialmente a obtener buen desarrollo de
bacterias exigentes, se utilizan en primera instancia en el aislamiento
bacteriano de productos patolgicos. Los medios de este tipo de uso
ms frecuente son: Agar sangre, Agar chocolate.
Medios Selectivos: Son medios que contienen sustancias que impiden el
crecimiento de algunas especies microbianas y permiten el desarrollo de
otras. Se incluyen en este grupo el agar cristal violeta para el aislamiento
de bacterias Gram (-) y el agar telurito de potasio para el aislamiento de
bacterias Gram (+).
Medios de Cultivos Diferenciales: Se emplean para demostrar alguna
propiedad bioqumica de la bacteria como degradacin de carbohidratos,
protenas, etc., contienen indicadores de cido base, redox o sustancias
que detectan cambios en el medio o en las caractersticas tpicas de las
colonias. Entre los de uso ms corriente se encuentran: Agar fierro-triple-
azcar (TSI agar) Medio de SIM.
Medios de Transporte: Estos medios impiden que se altere la proporcin
original de la flora microbiana en los especmenes, es decir, que no
permiten la multiplicacin de las bacterias mantenindolos viables.

Tcnicas de siembra

La poblacin microbiana existente en nuestro entorno es grande y compleja.


Cientos de especies microbianas habitan normalmente en distintas partes de
nuestro cuerpo, incluidas la boca, el tracto intestinal y la piel. Al nacer, los
microbios inmediatamente empiezan a colonizar nuestros cuerpos, as como a
casi todos los objetos del mundo. Ellos flotan alrededor hasta que entran en
contacto con una superficie que ofrezca comida y resguardo. Se encuentran
ms frecuentemente en la oscuridad, en objetos hmedos que a menudo
entran en contacto con la comida, la suciedad o la vegetacin. Las superficies
del bao, los cepillos para el cabello, los refrigeradores, los lavaplatos y las
tablas de cocina tienen a menudo muchos microbios. Las manijas y las
paredes tienen menos porque son pobres en nutrientes y secos.
Un estudio adecuado de microorganismos que hay en este hbitat requiere
tcnicas que permitan conocer y ordenar la compleja poblacin mixta o cultivo
mixto, separndole en sus distintas especies como cultivos puros. Un cultivo
puro consta de una poblacin de clulas derivadas todas ellas de una clula
parental. El material que se inocula sobre el medio se denomina inculo
mediante alguna tcnica. Durante la incubacin a 37C, las clulas microbianas
individuales se reproducen tan rpidamente que en un lapso de 18 a 24 horas
producen colonias. Si dos clulas microbianas procedentes del inculo original
quedan muy cerca una de otra sobre el medio de Agar, la masa de clulas
observables no ser un cultivo puro. La mayora de los microbios en nuestro
cuerpo y otras superficies son inofensivas, pero algunos son patgenos o
causan enfermedad.
La siembra de microorganismos puede realizarse en medios lquidos o en
medios slidos. En el primer caso, para la inoculacin se utilizar asa estril si
el medio de partida es slido, o pipeta estril (Pasteur o graduada) si es lquido.
En el segundo caso, cuando se parte de otro medio slido, se utiliza el asa de
platino normal para siembra en placa o tubo inclinado y el asa recta para
siembra en picadura en tubos rectos o, en general, cuando se quiere introducir
el microorganismo en el seno del medio de cultivo slido; cuando el medio de
partida es lquido, se puede pasar al medio slido con un asa de platino
calibrada, con la que se extiende la muestra directamente, o con pipeta,
depositando la muestra que luego se extender sobre la placa con un asa de
Digralsky o con una varilla doblada.

Proceso experimental

Materiales

Placas con Agar nutritivo.


Placas con Agar Mac Conkey.
Placas con Agar Manitol Salado .
2 Mecheros.
Caja de hisopos estriles sin abrir.
Toallas de papel.
Cinta adhesiva.
Marcador permanente o lpiz de
cera.
Un desinfectante con 70% de
solucin de alcohol, 10% de una

solucin blanqueadora, jabn lquido Extran o alkox.

Procedimiento
En esta actividad escogers un fomite (cualquier objeto inanimado que pueda
causar enfermedad en los organismos por contener microorganismos como: la
manija, el marco, el control remoto de la televisin, una moneda). Este fomite
ayudar a confirmar la presencia de microbios y los efectos de un desinfectante
por medio del crecimiento de colonias de bacterias en un medio de cultivo en
placas de Petri.

1) Toma una placa de Petri sin abrir y con t lpiz de cera o marcador,
divide la base de la caja en cuatro secciones iguales. Escribe el nombre
del objeto al otro lado y designa las secciones de 1 hasta 4. Abre la caja
de hisopos de algodn y escoge uno con cuidado para no tocar la punta.
Limpia tu objeto escogido con todos los lados de la punta del hisopo
voltendolo y retorciendo el hisopo a medida que lo mueves por la
superficie del objeto.
2) Ahora abre la tapa de la placa y suavemente haz cuatro siembras sobre
la superficie del medio de cultivo como se muestra en la ilustracin,
empezando en la seccin designada "1" y continuando en el orden de
las secciones, de manera que la ltima siembra est en la seccin 4.
Presiona firme pero suavemente y no repitas las siembras anteriores.
Tus siembras slo deben dejar una impresin muy ligera en el Agar.
Cierra la placa. No cubras la caja con cinta o no podrs verla bien.
a) La muestra la obtuvimos de
un lapicero elegido al azar de
uno de nuestros compaeros.
b) Muestra sacada de la
mesa del laboratorio de
parasitologa.
c) Muestra obtenida de unos
lentes.

3) Divide una segunda caja de


Petri en 4 secciones numeradas de 1 hasta 4 y desgnala Control.
Limpia la mitad del objeto que escogiste anteriormente con una toalla de
papel humedecida con agua, solo frtala un par de veces; no la
restriegues. Con un nuevo hisopo estril, toma muestra del rea
limpiada. Abre la tapa de la segunda placa y haz suavemente 4 siembras
en la superficie, siguiendo el orden de las secciones numeradas como lo
hiciste previamente. Cierra la placa.
4) Divide la tercera placa de Petri en 4 secciones numeradas y desgnalas
con el nombre del desinfectante que escogiste (por ejemplo
"blanqueador"). Usa el desinfectante escogido para limpiar la otra mitad
del objeto que trabajaste antes. Con un nuevo hisopo estril, toma
muestra del rea. Repite el proceso de sembrar la placa y cirrala.
5) Esteriliza los hisopos usados con desinfectante y descrtalos. Pon las
placas en un lugar apartado e incbalas a 37C por 24 horas. Limpia tu
rea de trabajo con la solucin desinfectante y lava tus manos.
El agar manitol salado: (se tom del celular de uno de nuestros compaero) se
ve otro tipo de crecimiento se nota colonias blancas y amarillas ese manitol
salado sera un medio diferencial o mejor dicho selectivo aparte de selectivo es
diferencial se puede diferenciar por el color de las colonias los que crecieron
color blanco no utilizan el azcar que se encuentra en el manitol el azcar se
llama manosa y los que utilizan la monosa son amarillos.

Medio comn crece lo que sea y se puede observar las colonias y tambin se
puede observar que le entro hongos.

EMB: en el agar de la mesa puede observar que entro hongo ah deben crecer
gran negativos.
Conclusiones

De acuerdo con lo realizado en la presente prctica se concluye que es de gran


importancia preparar adecuadamente los medios de cultivo, aadir la cantidad
de solucin exacta y disolverla correctamente para obtener los resultados
esperados; adems dejar incubar el tiempo pertinente para que de esta manera
se puedan observar los microorganismos deseados y de esa manera pueda
servir de mucho lo experimentado en el laboratorio.

Cuestionario

1. Qu es metabolismo bacteriano?

Es el conjunto de reacciones bioqumicas catablicas y anablicas que


transformarlas sustancias nutritivas para obtener energa y los nutrientes
(carbono, por ejemplo) que necesita para vivir y reproducirse.

2. Qu finalidad tiene utilizar medios de cultivo slidos?

Para la identificacin de microorganismos, observar su crecimiento en


sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. Cuando una
clula aislada e inmvil comienza a crecer sobre un substrato slido, el
resultado del crecimiento al cabo del tiempo es una colonia. Por consiguiente,
se denomina unidad formadora de colonia (UFC) a una clula bacteriana viva y
aislada que si se encuentra en condiciones de substrato y ambientales
adecuadas da lugar a la produccin de una colonia en un breve lapso de
tiempo. Se han preparado ms de 10.000 medios de cultivo diferentes.

3. Escribe el nombre de 5 medios de cultivo que se emplean en el


laboratorio de microbiologa.

Mac Conkey
Agar Sangre
Agar Polivitex
Agar Nutritivo
Agar Manitol Salado

4. Por qu la base de muchos medios de cultivo es una infusin de


extractos de carne y peptona?
Porque un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha
de contener, como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales
inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras
sustancias inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las
sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones
para las reacciones qumicas que tengan lugar. Todas estas sustancias se
suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de
carne o extractos de levadura. La infusin de extractos de carne y peptona
proporcionan los nutrientes necesarios para el crecimiento de los
microorganismos. Adems de que los costos al utilizar este tipo de infusiones
se reducen considerablemente y su eficiencia es alta comparada con otros
componentes que suplementen aminocidos.

5. Qu medios de cultivo se emplean para aislar bacterias causantes de


tuberculosis, meningitis, tifoidea y neumona?

Las bacterias que causan la meningitis pueden ser aisladas en los siguientes
medios de cultivo: Agar sangre, El Agar Levine o Agar EMB Levine, Mc Conkey,
y Agar Thayer Martin

Las bacterias que causan la neumona pueden ser aisladas en los siguientes
medios de cultivo: Agar chocolate, Agar sangre, Mc Conkey, (Neumonia)

La bacteria causante de la tuberculosis puede ser aislada en medios slidos


como: Medio Middlebrook 7H11, 7H10, Medio Lwenstein Jensen y el Medio
Ogawa. Y medios Lquidos como: Middlebrook 7H9.

La bacteria causante de la tifoidea puede ser aislada en los siguientes medios


de Cultivo: EMB o en sulfito de bismuto.

6. Cmo podemos controlar la contaminacin microbiana?

Para iniciar un cultivo celular se debe mantener las condiciones de asepsia


(limpieza total), puesto que no se puede eliminar los contaminantes, o es muy
difcil sin modificar la vida de las clulas de cultivo. Quizs un fungicida pueda
servir, pero no es inocuo para el cultivo. El motivo por el cual es tan difcil
eliminarlo luego de la contaminacin es porque la tasa de crecimiento de las
clulas animales es mucho menor al de la mayora de los contaminantes
comunes.
Ahora, para evitar que esto ocurra, es, para empezar a realizar los
experimentos en una zona aislada, usada nicamente con el fin de cultivar
tejidos. Si se tiene la posibilidad de conseguirte los laboratorios con sus
respectivas tecnologas para el cultivo, mucho mejor. stas son cabinas de flujo
laminar, incubadoras, sistemas de crio-gnesis, etc. Pero lo importante para
evitar la contaminacin es la cabina de flujo laminar, que cambia la presin al
interior del laboratorio, aumentndola, para evitar la entrada de aire
contaminado. Si no es posible conseguir estos instrumentos, al menos se
podra hacer lo primero, trabajar en un sector aislado, ocupado solamente para
el cultivo de ese tipo celular, para evitar contaminacin cruzada y el medio de
cultivo debera tener ciertas sustancias que lo protejan de posibles agentes
patgenos.

7. Describa las caractersticas del agar-agar

Gel termorreversible.
Gelifica entre 35 y 43C.
Poderoso agente gelificante.
Se derrite entre los 85 y 95C.
Excelente estabilizador de alimentos.
Forma geles en bajas concentraciones.
Se puede disolver a bajas temperaturas.
No aporta caloras, es ligeramente saciante y laxante.
Es un hidro-coloide completamente soluble en agua a 100C.
Al contacto con agua fra se hincha y puede aumentar su volumen 30
veces.
Es el nico hidro-coloide que ofrece gelatinas, que puede transportar
temperaturas de esterilizacin.
PRCTICA N 05:

Aislamiento de patgenos en infeccin


urinaria

OBJETIVOS

Que los alumnos conozcan los patgenos causantes de infeccin


urinaria.
Presenciar la tcnica que se utiliza para el urocultivo.
Interpretar dicha tcnica
MATERIAL

Muestra de orina
Tubos con solucin salina fisiolgica estril (9 ml)
Agar Tripticase Soya
Agar Eosina Azul de Metileno (EMB)
Agar Mac Conkey
Pipetas de 1 ml estriles
Placas Petri estriles
Asa de Kolle
Mechero
INTRODUCCIN

La ITU es una de las enfermedades ms frecuentes, que consiste en la


infeccin por algn agente patgeno (bacterias con mayor frecuencia), de
cualquiera de los segmentos del aparato urinario: riones, urteres, vejiga o
uretra.

PIELONEFRITIS: es la infeccin del rin.

URETERITIS: es la infeccin de uno o de los dos urteres.

CISTITIS: es la infeccin de la vejiga.

URETRITIS: es la infeccin de la uretra.

A las Pielonefritis se les conoce tambin como Infecciones del Tracto Urinario
Alto. A las Cistitis y Uretritis tambin se les conoce como infecciones del Tracto
Urinario Bajo

Las Ureteritis son generalmente una extensin de la infeccin en el rin o en


vejiga (Cistitis).

FACTORES PREDISPONENTES A UNA ITU

El sexo femenino, porque la longitud de la uretra femenina es pequea,


y se favorece que las infecciones asciendan desde la regin perineal.
Los varones que tienen la prstata aumentada de tamao, porque se
tiende a retener la orina debido a que la prstata aumentada de tamao
genera obstruccin parcial o total en el segmento que corresponde a la
uretra.
Uso de ropas ajustadas, predispone a desarrollar infecciones urinarias
por la presin que ejercen estos que hacen que la orina refluya hacia el
interior de las vas urinarias favoreciendo la contaminacin de estas.
La retencin voluntaria de la orina, es importante que una persona
use el uirinario, tan pronto siente ganas de hacerlo
Las personas que ingieren poca ingesta de lquidos.
Las personas diabticas, por la facilidad que tienen para todo tipo de
infeccin.
Aquellos que tienen alguna malformacin congnita de las vas
urinarias.

SNTOMAS DE LAS ITU

Lo fundamental es el ardor al orinar conocido como disuria, otros


sntomas agregados pueden polaquiuria (orinar varias veces en cantidad menor
a lo habitual), dolor al final de la emisin, fiebre, nuseas, vmitos, malestar
general, dolor lumbar dependiendo de la localizacin de la infeccin. Cuando
es una infeccin urinaria alta se suele acompaar de fiebre, malestar general,
dolor lumbar, nuseas o vmitos; mientras que cuando es baja no.

Si se trata de una uretritis gonoccica (se hace nicamente evidente en


el varn), que es una enfermedad de transmisin sexual, se presenta ardor al
orinar y al inicio de la miccin se evidencia una secrecin blanquecina
maloliente con el color parecido al de la "leche condensada".

UROCULTIVO

EL urocultivo se utiliza para diagnosticar bacteriuria, la orina constituye


un mtodo excelente para cultivar la mayor parte de microorganismos que
infectan el aparato urinario.

La combinacin de piuria con bacteriuria considerable sugiere la presencia de


una infeccin urinaria.

Utilidad Clnica

Cuando los sntomas indican una posible infeccin urinaria como: dolor y
sensacin de calor al orinar, as como urgencia frecuente de orinar.
Cuando un paciente esta canalizado por largo tiempo, aunque no
muestre sntomas de infeccin.
En mujeres embarazadas para monitorear cualquier bacteria en la orina
que pueda causar algn problema al beb.
PROCEDIMIENTO

Toma de muestra en mujeres

La muestra debe ser tomada preferentemente en el Laboratorio. Si ello


no es posible, seguir las mismas instrucciones en su casa.

Debe hacerse una antisepsia previa de la zona genital, por lo tanto debe tener
a la mano lo siguiente:

jabn desinfectante
agua hervida o agua estril
gasa estril o un pao acabado de lavar
el recipiente para tomar la muestra.
Proceda primero a lavarse las manos y luego sintese en el inodoro, lo
ms hacia atrs que pueda. Separe los labios genitales con una mano y
mantenga los pliegues separados y proceda a asearse toda la zona genital con
el jabn desinfectante. Enjuague con abundante agua estril y luego seque
bien con gasa estril o con un pao limpio.

Proceda a recoger la orina, destapando previamente el frasco SLO EN


EL MOMENTO DE LA MICCIN y sin tocar con los dedos su interior, coloque
la tapa con el lado plano hacia abajo. No toque el interior del recipiente o de la
tapa. Empiece a orinar y recoja en el frasco, slo la muestra del chorro del
medio es decir, no debe recoger ni la primera, ni la ltima parte del chorro de
orina.

Tape muy bien el frasco y rotlelo con su nombre.

Trigalo al Laboratorio lo ms pronto posible, en un recipiente con hielo,


cuidando de que no se bote el contenido.

Examen cuantitativo

Mtodo de conteo en placa o recuento de colonias. Introducido por Kass


para evitar los riesgos del cateterismo vesical y diferenciar bacteriuria
verdadera de contaminacin, se realiza de la siguiente manera:
Homogeneiza la muestra mediante agitacin.
Diluye al 1:10, colocando 1 ml. de orina en 9 ml. de suero fisiolgico
estril.
Prepara diluciones al 1:100; 1: 1000 y 1:10 000, a partir de la dilucin al
1:10.
Deposita 1 ml. de cada dilucin en placas Petri esterilizadas, sobre las
cuales vaca un tubo de agar tripticase soya, fundido y enfriado a 45.
Mediante rotacin suave, distribuye homogneamente la siembra.
Lleva a incubar todas las siembras a 37C durante 24 a 48 horas.
Para calcular el nmero de colonias elige placas que contengan entre 30
y 300 colonias. Contadas stas, basta multiplicar su nmero por la dilucin
respectiva para obtener la cuenta total.

Los resultados del estudio cuantitativo se informan de la siguiente


manera:

No hubo desarrollo microbiano.


Menos de 10 000 colonias por ml.
Entre 10 000 y 100 000 colonias por ml.
Ms de 100 000 colonias por ml.
Por lo general, las muestras contaminadas tienden a mostrar cuentas
inferiores a 10 000 colonias/ml. Cuando el recuento revela valores intermedios,
entre 10 0000 y 100 000 colonias/ml, el examen debe repetirse. Conviene
advertir que pueden pasar inadvertidas infecciones urinarias verdaderas, si no
se toman en cuenta cuentas inferiores a 100 000 colonias por ml, ya que
existen diversos factores que pueden explicar recuentos bajos en infecciones
urinarias verdaderas, diuresis acentuada, obstruccin uretral, infecciones
crnicas e infecciones por cocos grampositivos.

Examen cualitativo

El estudio cualitativo, que conduce a la identificacin del agente, se


realiza mediante la siembra de la muestra homogeneizada, en placas con agar
eosina azul de metileno (EMB) o MacConkey.
La identificacin final de los agentes se hace mediante el estudio de sus
propiedades bioqumicas y caractersticas serolgicas. Esto permite establecer
relaciones de identidad entre microorganismos aislados en cultivos sucesivos o
de control, y definir el estado de revivida o de reinfeccin. De esto deriva el
valor que tiene el conocimiento del biotipo, del serotipo (particularmente en E.
coli), del piocinotipo (en especial cuando es de Ps. aeruginosa) y del
antibitico. ste ltimo se obtiene al comparar el antibiograma de cepas
aisladas de muestras obtenidas de diferentes oportunidades en un mismo
paciente Si existe correspondencia, se concluye que se trata de una misma
cepa.

Cuestionario

1. Qu tipos de bacterias pueden causar infeccin urinaria? Descrbelos.

Entre las bacterias Gram negativas encontramos:

Escherichia coli: vive en los intestinos de la mayor parte de


los mamferos sanos. Es el principal organismo anaerobio
facultativo del sistema digestivo. En individuos sanos, es decir, si la bacteria no
adquiere elementos genticos que codifican factores virulentos, la bacteria
acta como un comensal formando parte de la flora intestinal y ayudando as a
la absorcin de nutrientes. En humanos, la Escherichia coli coloniza el tracto
gastrointestinal de un neonato adhirindose a las mucosidades del intestino
grueso en el plazo de 48 horas despus de la primera comida. Aunque la
mayora de las cepas son inocuas y viven en los intestinos de los seres
humanos y animales saludables, esta cepa produce una potente toxina y puede
ocasionar enfermedades graves como el sndrome urmico hemoltico. Provoca
el 80% de las infecciones urinarias agudas en general.

Klebsiella pneumoniae: Son bacterias Gram negativas , la asimilacin y la


fermentacin de la lactosa se puede observar en el agar Mac Conkey donde las
colonias son de color rosado y en el medio Kliger o TSI donde son cido/cido,
es decir fermentador de la lactosa ms produccin de gas; y en la fermentacin
acetnica o prueba de Voges Proskauer son positivos. Por ltimo, sus
condiciones ptimas de cultivo son en agar nutritivo a 37 C, pH de 7.0, presin
osmtica de 1 atm.

Enterobacter: es un gnero de bacterias Gram negativas facultativamente


anaerbicas de la familia de las Enterobacteriaceae. Muchas de estas bacterias
son patgenas y causa de infeccin oportunista, otras son
descomponedores que viven en la materia orgnica muerta o viven en el ser
humano como parte de una poblacin microbiana normal. Algunas
enterobacterias patgenas causan principalmente infeccin del tracto urinario y
del tracto respiratorio.

Entre las bacterias Gram positivas encontramos:

Staphylococcus saprophyticus: es un coco Gram positivo, coagulasa, anaerobio


facultativo, no formador de cpsula, no formador de espora e inmvil. Es
catalasa y oxidasa positivo. Posee la enzima ureasa y es capaz de adherirse a
las clulas epiteliales del tracto urogenital.

Streptococcus agalactiae: es una bacteria estreptococo del grupo B


(EGB), Gram positivo, beta-hemoltico, catalasa negativo, oxidasa negativo y
anaerobio facultativo, caracterizado por presentar el grupo B de antgenos
Lancefield. Se puede encontrar en el aparato digestivo, urinario y genital de los
adultos. Aunque una infeccin por EGB normalmente no ocasiona problemas a
las mujeres sanas antes del embarazo, puede provocar una enfermedad grave
a la madre y al beb durante la gestacin y despus del parto.

Enterococcus: son cocos Gram-positivos que se presentan en parejas o en


cadenas, siendo difcil distinguirlos de Streptococcus slo en base a sus
caractersticas fsicas. Dos de las especies son comensales en el intestino
humano: E. faecalis y E. faecium. El enterococo es un organismo anaerobio
facultativo o capnoflicos, esto es, prefiere usar oxgeno, aunque sobrevive bien
en su ausencia. Tpicamente exhiben gamma-hemolisis en agar sangre de
cordero. Indica infeccin mixta o patologa urinaria orgnica.

Staphylococcusaureus: es una bacteria anaerobia facultativa, Gram positiva,


productora de coagulasa, catalasa, inmvil y no esporulada que se encuentra
ampliamente distribuida por todo el mundo, estimndose que una de cada tres
personas se hallan colonizadas, aunque no infectadas, por ella. Las cepas
habituales de Staphylococcus aureus son resistentes a la penicilina, dejando
como los antibiticos ms eficaces para combatirlos a los amino-glucsidos,
las cefalosporinas, la oxacilina o la nafcilina. Cuando est presente debe
descartarse la contaminacin urinaria por va hematgena si el paciente no es
portador de sonda urinaria.

2. Qu puede suceder cuando una mujer tiene bacteriuria asintomtica?

La bacteriuria asintomtica se presenta en un pequeo nmero de personas


sanas y afecta ms a menudo a las mujeres que a los hombres.

La mayora de los pacientes con bacteriuria asintomtica no necesitan


tratamiento, dado que las bacterias no estn causando ningn dao pero en las
mujeres embarazadas la bacteriuria asintomtica puede producir enfermedades
como pielonefritis ,corioamnionitis entre otras y al beb durante la gestacin y
despus del parto, parto prematuro, bajo peso en l beb al nacer e incluso el
aborto.

3. Por qu la mujer es ms propensa a la ITU?

Un factor clave en estas diferencias podra ser que la uretra de la mujer es


corta, permitiendo as a las bacterias un acceso rpido hasta la vejiga urinaria.
Otro sera que la apertura de la uretra en la mujer est cerca de focos
bacterianos, como el ano y la vagina.

Adems, las mujeres cuyas parejas usan preservativos con espermicidas


tienen tendencia a un crecimiento de la bacteria Escherichia Coli en la vagina.

4. Qu medidas se debe seguir para evitar las ITU?

Beber abundante agua y otros lquidos (ocho o ms vasos de de litro


por da).
No prolongar la miccin cuando el organismo lo requiera
Luego de orinar, la mujer debe limpiar la uretra con papel higinico,
hasta asegurarse de que est limpia y seca.
Luego de ir de vientre, debe limpiar la zona anal de adelante hacia atrs
con papel higinico, hasta que est limpia.
Utilizar ropa interior de algodn.
Bibliografa
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http://www.ecured.cu/index.php/Microscopio_%C3%B3ptico
http://es.scribd.com/doc/50980595/Preparacion-de-medios-de-Cultivo
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http://es.slideshare.net/HimFreak/coloracin-cido-resistente
https://es.wikipedia.org/wiki/Tuberculosis
http://www.webconsultas.com/categoria/salud-al-dia/infecciones-urinarias