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1 dia: Preparar caldo MRS pra ativar as culturas.

2 dia: Inocular 100l da cultura em 5ml de caldo MRS e incubar a 37C por 24h.

3 dia: Inocular 2ml da cultura em um erlemeyer contendo 200ml de MRS a 37C por 24h.

4 dia: Centrifugar o caldo de crescimento a 700xg por 30 min.

- Eliminar o precipitado.

- Adicionar ao sobrenadante cristais de sulfato de amnio at 20% de saturao (fazer as contas).

- Deixar em repouso a 4C por 1h para precipitao de protenas.

- Centrifugar a suspenso a 700xg por 30 min.

- Eliminar o sobrenadante.

- Ressuspender o precipitado em 32,5 ml de gua destilada.

- Dialisar o material ressuspenso em membrana de dilise de 3,5kDa contra 5L de gua destilada


substituindo esta aps 2 e 18h de dilise.

5 dia: E na quarta dilise (aps 20h do incio desse processo) utilizar 5L de tampo fosfato 0,2M pH 7,2
por 4h.

-24h em refrigerao

-Esterilizar o material dialisado atravs de membrana (0,22m)

- Obtm-se o extrato bruto.