Вы находитесь на странице: 1из 3

ВЗГЛЯД В БУДУЩЕЕ

№ 1, 2015

Medica mente

37. Tachibana M. et al. Towards germline gene therapy of inherited mitochondrial diseases. Nature. 2013; 493: 627–31.

38. Minami N. et al. Zygotic gene activation and maternal factors in mammals. J. Reprod. Dev. 2007; 53: 707–15.

39. Eichenlaub-Ritter U. et al. Age related changes in mitochondrial function and new approaches to study redox regulation in mammalian oocytes in response to age or maturation conditions. Mitochondrion 2011; 5: 783–96.

40. Braveman F.R. Pregnancy in patients of advanced maternal age. Anesthesiol. Clin. 2006; 24: 637–46.

41. Habbema J.D. et al. The effect of in vitro fertilization on birth rates in western countries. Hum. Reprod. 2009; 24: 1414–19.

42. Robertson J.A. Reconstituting eggs: the ethics of cytoplasm donation. Fertil. Steril. 1999; 71: 219–21.

43. Rienzi L. et al. Consistent and predictable delivery rates after oocyte vitrification: an observational longitudinal cohort multicentric study. Hum. Reprod. 2012; 27: 1606–12.

44. Yusa K. et al. Targeted gene correction of alpha1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells. Nature. 2011; 478: 391–4.

45. Genovese P. et al. Targeted genome editing in human repopulating haematopoietic stem cells. Nature. 2014; 510: 235–40.

46. Suzuki K. et al. Targeted gene correction minimally impacts whole-genome mutational load in human-disease-specific induced pluripotent stem cell clones. Cell Stem Cell. 2014; 15: 31–6.

47. Schwank G. et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell13: 653–8.

48. Chinnery P.F. et al. The challenges of mitochondrial replacement. PLoS Genet. 10, 2014; e1004315.

49. Reinhardt K. et al. Medicine. Mitochondrial replacement, evolution, and the clinic. Science. 2013; 341: 1345–6.

50. Roubertoux P.L. et al. Mitochondrial DNA modifies cognition in interaction with the nuclear genome and age in mice. Nat. Genet. 2003; 35: 65–9.

51. Tang F. et al. Maternal microRNAs are essential for mouse zygotic development. Genes Dev. 2007; 21: 644–8.

for mouse zygotic development. Genes Dev. 2007; 21: 644–8. Р ЕПРОГРАММИРОВАННЫЕ СТВОЛОВЫЕ

РЕПРОГРАММИРОВАННЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ:

ДОСТИЖЕНИЯ И ОГРАНИЧЕНИЯ

А.М. Красный, к.б.н., Н.Е. Волгина, к.б.н. ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова, Москва

Резюме. Появление репрограммированных стволовых клеток (рСК) открыло широкие перспективы для развития регенеративной медицины и создания лекарственных средств благодаря их способности диффе- ренцироваться в любой тип клеток в организме. Проведенные в течение более трех десятилетий исследо- вания рСК позволили на данных момент приступить к клиническим испытаниям. Несмотря на значитель- ный прогресс в области использования рСК, еще существуют нерешенные проблемы, связанные с этичес- кими ограничениями, потенциальной онкогенностью, сложностями клеточной дифференцировки.

Ключевые слова: репрограммированные стволовые клетки, потентность, прямое перепрограммирование

Р епрограммированные столовые клетки (рСК) – это клетки, получившие свои стволовые свойства путем

эпигенетического программирования. В зависимости от потентности (способности к дифференцировке в разные виды тканей) различают репрограммированные тотипо- тентные стволовые клетки – способные давать начало всем тканям организма и внезародышевым оболочкам, индуци- рованные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) – спо- собные дифференцироваться в любой тип клеток в орга- низме и репрограммированные мультипотентные прогени- торные стволовые клетки – стволовые клетки обладающие узкой тканеспецифичностью. Репрограммированные тотипотентные стволовые клет- ки (рТСК) можно получить путем переноса ядра соматиче- ской клетки в оплодотворенную яйцеклетку (somatic cell nuclear transfer – SCNT), из которой предварительно удале- но ядро [1]. SCNT успешно применяется для клонирования различных животных, так, в частности, появилась знамени- тая овечка Долли [2–5]. SCNT имеет терапевтический потен- циал для некоторых заболеваний, например наследствен- ных митохондриальных болезней. Митохондриальный геном человека наследуется цитоплазматически, только через яйцеклетку и несет свою собственную ДНК, которая

кодирует 13 белков дыхательной цепи [6]. Мутации в генах митохондрий приводят к заболеваниям, передаваемым митохондриями, таким как наследственная оптическая нейропатия Лебера [7]. Пересадка ядра из яйцеклетки с дефектным митохондриальным геномом в здоровую яйце- клетку позволит полностью избавиться от наследственных митохондриальных заболеваний. На данный момент клини- ческих испытаний пересадки ядра между яйцеклетками не проводится из-за этических ограничений.

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки

В 2006 г. Такахаши и Яманака показали, что стволовые клетки со свойствами, близкими к эмбриональным стволо- вым клеткам (ЭСК), можно получить из мышиных фибробла- стов, используя одновременное введение четырех генов OCT4, KLF4, SOX2, c-Myc [8]. Авторы назвали эти клетки иПСК. В 2007 г. появилось сообщение, что подобный подход при- меним для фибробластов человека [9]. Для репрограммиро- вания генома применялись векторные вирусные системы на основе ретро- и лентивирусов, где в качестве вектора использовались четыре перепрограммирующих фактора.

9

Medica mente

№ 1, 2015

ВЗГЛЯД В БУДУЩЕЕ

Ретровирусы способны вызывать инсерционный мутагенез и приводить к возникновению иммуногенности иПСК [10]. Данные проблемы оказывали влияние на качество иПСК. Введение в мышиные эмбрионы изначально полученных иПСК вызывало гибель зародышей. Однако впоследствии качество иПСК улучшилось, вместо вирусов были использо- ваны эписомные плазмиды, неспособные интегрировать в ДНК хромосом [11]. Таким образом, были получены химер- ные мыши. К сожалению, два из четырех используемых для перепрограммирования генов (а именно, с-Мус и KLF4) явля- ются онкогенными, и у 20% химерных мышей развился рак. В более позднем исследовании Яманака сообщил, что можно создать иПСК даже без с-Мус. Этот процесс занимает больше времени и не столь эффективен, но в результате у химер рак не развивался [12]. Одним из неоспоримых преимуществ при использовании иПСК для клеточной терапии, по сравне- нию с ЭСК, является аутологичность, т.е. иПСК получают из того же пациента, в котором их и применяют. Кроме того, неэмбриональное происхождение иПСК снимает все этиче- ские ограничения. За открытие иПСК в 2012 г. были удостое- ны Нобелевской премии С. Яманака и Д. Гердон с формули- ровкой «за открытие, что зрелые клетки могут быть перепро- граммированы и стать плюрипотентными». На данный момент существуют значительные проблемы с клиническим использованием иПСК. Было проведено всего одно клиническое испытание на одном человеке. Для срав- нения, ЭСК используются в 11 клинических испытаниях, неко- торые из которых уже перешли ко 2-й фазе [13]. Компания Advanced Cell Technology (ACT, Мальборо, штат Массачусетс) в 2010 г. не смогла ответить на ряд вопросов при проведении исследований для Управления США по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов. Обнаружились нерешенные проблемы с преждевременной клеточной смертью иПСК, появлением онкогенных мутаций и низких темпов пролиферации. В результате интересы компа- нии сместились в сторону использования ЭСК. Первое клиническое испытание иПСК было начато в 2013 г. под руководством доктора Такахаши из Центра биологии развития RIKEN (RIKEN – Center for Developmental Biology) в главной больнице Медицинского центра г. Кобе (Kobe City Medical Center General Hospital). Предварительно министер- ство здравоохранения Японии одобрило клинические испы- тания метода на человеке. Такахаши и ее коллеги в тестах на обезьянах и мышах показали, что трансплантированные клетки не отторгались и не провоцировали рост опухоли. Первым пациентом была 70-летняя жительница Японии, страдавшая возрастной макулодистрофией – часто встреча- ющимся заболеванием глаз, приводящим к слепоте. Клинические испытания, начатые в 2013 г., закончились успешной операцией в августе 2014 г. За это время были про-

Литература

изведены иПСК из клеток кожи пациентки и в дальнейшем дифференцированы в клетки пигментного эпителия сетчат- ки. Полученные клеточные пласты толщиной от 1,3 до 3,0 мм были имплантированы в сетчатку пациента командой из трех офтальмологов, во главе с Я. Куримото [14]. После пер- вого успешного клинического испытания Киотский универ- ситетский госпиталь в Кобе объявил в феврале 2015 г., что будет открыт лечебный центр иПСК в 2019 г. в целях проведе- ния клинических исследований на 30 коек [15]. Таким обра- зом, единственным местом, где проводятся клинические испытания иПСК, стал университет, в котором работает их создатель – С. Яманака. Одним из перспективных направлений стало получение иПСК от пациентов для моделирования заболевания и испытания потенциальных лечебных препаратов. иПСК представляют собой практически неограниченный источ- ник клеток пациента, который может быть превращен в любой тип клеток организма. Это особенно важно потому, что многие другие виды клеток человека, полученные от больных, как правило, прекращают рост после нескольких пассажей в лабораторной культуре. Плюрипотентные клет- ки уже получены для широкого спектра генетических забо- леваний человека, в том числе синдрома Дауна и поликис- тоза почек [16, 17]. Соматические клетки, полученные из иПСК, в частности, сердечные миоциты и гепатоциты, могут также использоваться для токсикологического тестирова- ния в качестве альтернативы существующим подходам [18]. Новое научное направление, возникшее из иПСК- технологии, – это прямое перепрограммирование из одной соматической линии в другую. В свете успеха иПСК- перепрограммирования ученые перешли от поиска едино- го фактора к поиску различных сочетаний. Д. Мелтон и его коллеги в 2008 г. показали преобразование экзокринных клеток поджелудочной железы мыши в эндокринные клет- ки с помощью сочетания трех факторов транскрипции [19]. Вскоре появилось много работ, где были показаны in vitro- преобразования фибробластов в различные соматические клетки, такие как предшественники нейронов [20], гепато- циты [21], сердечные миоциты [22] и гемопоэтические про- гениторные клетки [23]. Прямое перепрограммирование является простым и быстрым в исполнении, единственным препятствием может быть недостаточное количество кле- ток-мишеней. Лучшее использование этой новой техноло- гии может быть прямое перепрограммирование in situ [24]. Постоянно расширяется круг применений рСК и разви- ваются связанные с ними технологии. рСК используются в фундаментальной биологии, а также в клеточной терапии и моделировании заболеваний. Потенциал рСК еще полно- стью не раскрыт, и рСК будут находить новое применение и в лаборатории, и в клинике.

1. Tachibana M., Amato P., Sparman M. et al. Human Embryonic Stem Cells Derived by Somatic Cell Nuclear Transfer. Cell. 2013; 153(6); 1228–38.

2. Wilmut I., Schnieke A.E., McWhir J., Kind A.J. et al. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature. 1997; 385: 810–3.

3. Wakayama T., Perry A.C., Zuccotti M., Johnson K.R. et al. Ull-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature. 1998; 394: 369–74.

4. Zhou Q., Renard J.P., Le Friec G., Brochard V. et al. Generation of fertile cloned rats by regulating oocyte activation. Science. 2003; 302: 1179.

5. Polejaeva I.A., Chen S.H., Vaught T.D., Page R.L. et al. Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature. 2000; 407: 86–90.

6. Mercer T.R., Neph S., Dinger M.E., Crawford J. et al. The human mitochondrial transcriptome. Cell. 2011; 146: 645–58.

7. Koilkonda R.D., Guy J. Leber’s hereditary optic neuropathy-gene therapy: From benchtop to bedside. J Ophthalmol. 2011; 179412.

8. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 2006; 126: 663–76.

9. Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M., Narita M., Ichisaka T., Tomoda K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell/ 2007; 131: 861–72.

10

ВЗГЛЯД В БУДУЩЕЕ

№ 1, 2015

Medica mente

10. Zhao T., Zhang Z.N., Rong Z. Xu Y. Immunogenicity of induced pluripotent stem cells. Nature. 2011; 474: 212–15.

11. Okita K., Matsumura Y., Sato Y., Okada A., Morizane A., Okamoto S., Hong H., Nakagawa M., Tanabe K., Tezuka K. et al. A more effi- cient method to generate inte- gration-free human iPS cells. Nat. Methods. 2011; 8: 409–12.

12. Nikhil S.«Stem Cells – This Time Without the Cancer. Scientific American News. 2007; 11: 30.

13. Kimbrel E.A., Lanza R. Current status of pluripotent stem cells: moving the first therapies to the clinic. Nat Rev Drug Discov. Oct 2015; 14(10): 681–92.

14. Cyranoski D. ‘Japanese Woman Is First Recipient Of Next-Generation Stem Cells’. Nature. 2014; n. pag; Web. 6 Mar. 2015.

15. The Japan Times, ‘Kyoto University Hospital To Open Ips Cell Therapy Center In 2019. The Japan Times’. N.p., 2015. Web. 7 Mar. 2015.

16. Park I.H., Arora N, Huo H., Maherali N., Ahfeldt T., Shimamura A. et. al. «Disease-specific induced pluripotent stem cells.». Cell. 2008; 134 (5): 877–86.

17. Freedman B.S., Lam A.Q., Sundsbak J.L., Iatrino R., Su X. et al. Reduced ciliary polycystin-2 in induced pluripotent stem cells from polycystic kidney disease patients with PKD1 mutations. J. JASN October 2013; 24 (10): 1571–86.

18. Yamanaka S. A fresh look at iPS cells. Cell. 2009; 137: 13–7.

19. Zhou Q., Brown J., Kanarek A., Rajagopal J., Melton D.A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 2008; 455: 627–32.

20. Vierbuchen T., Ostermeier A., Pang Z.P., Kokubu Y., Su¨ dhof T.C., Wernig M. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 2010; 463: 1035–41.

21. Huang P., He Z., Ji S., Sun H., Xiang D., Liu C., Hu Y., Wang X., Hui L. Induction of functional hepatocyte-like cells from mouse fibroblasts by defined factors. Nature. 2011; 475: 386–389.

22. Ieda M., Fu J.D., Delgado-Olguin P., Vedantham V., Hayashi Y., Bruneau B.G., Srivastava D. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 2010; 142: 375–386.

23. Szabo E., Rampalli S., Risueno R.M., Schnerch A., Mitchell R., FiebigComyn A., Levadoux-Martin M., Bhatia M. Direct conversion of human fibroblasts to multiline- age blood progenitors. Nature. 2010; 468: 521–6.

24. Qian L., Huang Y., Spencer C.I., Foley A., Vedantham V., Liu L., Conway S.J., Fu J.D., Srivastava D. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. Published online April 18, 2012.

cardiomyocytes. Nature. Published online April 18, 2012. Х РОМОСОМНАЯ СТАБИЛЬНОСТЬ

ХРОМОСОМНАЯ СТАБИЛЬНОСТЬ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ IN VITRO (КЛИНИЧЕСКАЯ ЛЕКЦИЯ)

Н.В. Андронова, Н.В. Зарецкая, к.м.н.; О.В. Муравенко, д.б.н.; О.К. Ступко, В.А. Бахарев, д.м.н., проф.; И.В. Арутюнян, Т.Х. Фатхудинов, д.м.н. 1 Лаборатория репродуктивной генетики ФГБУ Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова, Москва 2 Лаборатория регенеративной медицины ФГБУ Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова, Москва

Резюме. Клиническая лекция содержит информацию об источниках получения мезенхимальных стволо- вых клеток человека (МСК), методах выявления хромосомных аномалий в культуре МСК, результаты исследований хромосомной стабильности МСК на ранних и поздних пассажах.

Ключевые слова: мезенхимальные стволовые клетки человека, хромосомные аномалии, цитогенетический анализ, FISH-анализ

В последние годы мезенхимальные стволовые клетки (МСК) человека все шире применяются для клеточной

терапии различных заболеваний. Согласно критериям, опре- деленным Международным обществом клеточной терапии – International Society for Cellular Therapy, МСК характеризуются следующими признаками: 1) способностью к образованию в культуре колоний фибробластоподобных клеток, 2) экспрес- сией поверхностных антигенов CD73, CD90 и CD105 при отсутствии экспрессии гематопоэтических маркеров CD45, CD34, CD14, CD19 и HLA-DR, а также 3) способностью транс- формироваться в мезенхимальные элементы различных линий дифференцировки (остеоидные, хондрогенные, ади- погенные и другие клетки-предшественницы) [1]. Наиболее распространенным в настоящее время источником МСК человека, широко применяемым в клинических исследова- ниях, является костный мозг [2]. Однако выделение МСК из

красного костного мозга сопряжено с инвазивной болезнен- ной процедурой, концентрация МСК в ткани красного кост- ного мозга относительно невысока, а, главное, способность МСК к пролиферации и дифференцировке снижается с воз- растом [2, 3]. Это определило актуальность поисков новых источников МСК. В качестве одного из многообещающих источников МСК в последние годы рассматривают ткани пупочного канатика. Преимуществом данного подхода явля- ется возможность использовать МСК пупочного канатика для аутологичной и аллогенной трансплантации, а также для пре- натальной клеточной терапии [4]. Ряд авторов указывают на высокую стабильность кариотипа МСК пупочного канатика, в том числе по сравнению с клеточными линиями иного про- исхождения. Так, исследования V. Sabapathy и др. подтвердили отсутствие хромосомных аномалий в культивируемых МСК пупочного канатика на отдаленных сроках (25 пассажей) [5].

11

Оценить