EFECTO DEL HIDROLIZADO PROTEICO DE

Chenopodium petiolare QUINUA NEGRA SOBRE LOS

NIVELES DE PEROXIDACIN LIPDICA EN EL

CEREBRO DE RATONES CON

HIPERCOLESTEROLEMIA INDUCIDA.

Luis Andres Durand1, Jorge Andr Haro1, Jos Luis Huamn1, Sandra Ivonne Irkampa1,

Katherine Pamela Ocros1, Eddy Palomino Surez1, Brayanm Giancarlo Quispe.

(1) Estudiante de pregrado de la escuela acadmico profesional de farmacia y bioqumica.

Resumen:

Antecedentes: La hidrlisis de un alimento rico en protenas, como la quinua negra, junto

a la bromelina, una enzima proteoltica, permite la obtencin de pptidos bioactivos que

pueden tratar y prevenir los problemas relacionados con la peroxidacin lipdica. El

cerebro es el rgano que presenta alta susceptibilidad a sufrir peroxidacin lipidica debido

a altos niveles lpidos insaturados, el elevado consumo de O2 y un bajo sistema

antioxidante, el grado de lipoperoxidacion se determina mediante la cuantificacin de uno

de sus principales productos, el malondialdehido (MDA). El propsito del trabajo es

evaluar el efecto del hidrolizado enzimtico de quinua negra sobre los niveles de

peroxidacin lipdica en el cerebro de ratones con hipercolesterolemia inducida.

Materiales y mtodos: Se emplearon ratones albinos machos distribuidos en ocho grupos

de estudio: grupo 1, grupo control (sin induccin a hipercolesterolemia); grupo 2, dieta

con queso graso (QG) (40%); grupo 3, 4 y 5, se administr QG con el hidrolizado de

quinua 125 ul; 250 ul y 500 ul, respectivamente; grupo 6 QG y atorvastatina; grupo 7 QG
y quinua sin hidrolizar y grupo 8 QG con pia, luego de 1 mes con el tratamiento, se

sacrificaron y se extrajo el cerebro midiendo luego los niveles de MDA en este tejido.

El grupo 3, 4, 5, 7 y 8 presentaron 10.37%, 17.36%, 35.84%, 58% y 15.57%

respectivamente, menores niveles de MDA, con respecto al grupo 2. Conclusiones: El

hidrolizado enzimtico de quinua negra presenta una mayor disminucin de la

lipoperoxidacin con un incremento de la dosis.

Palabras clave: Quinua, peroxidacin lipdica, malondialdehido (MDA)

Summary:

Background: The hydrolysis of a protein rich food, such as black quinoa, together with

bromelain, a proteolytic enzyme, allows the production of bioactive peptides that can treat

and prevent problems related to lipid peroxidation. The brain is the organ with high

susceptibility to lipid peroxidation due to high unsaturated lipid levels, high O2

consumption and a low antioxidant system. The degree of lipoperoxidation is determined

by the quantification of one of its main products, malondialdehyde ( MDA). The purpose

of this work is to evaluate the effect of the enzymatic hydrolyzate of black quinoa on the

levels of lipid peroxidation in the brain of mice with induced hypercholesterolemia.

Materials and methods: Male albino mice distributed in eight study groups were used:

group 1, control group (without induction to hypercholesterolemia); Group 2, diet with

fatty cheese (HG) (40%); Groups 3, 4 and 5, QG was administered with quinoline

hydrolyzate 125 ul; 250 ul and 500 ul, respectively; Group 6 QG and atorvastatin; Group

7 HQ and unhydrolyzed quinoa and group 8 HQ with pineapple, after 1 month with

treatment, were sacrificed and the brain was then measured by measuring MDA levels in

this tissue. Compared to group 2, 4, 5, 7 and 8 presented 10.37%, 17.36%, 35.84%, 58%
and 15.57% respectively, lower levels of MDA than in group 2. Conclusions: The

enzymatic hydrolyzate of black quinoa Decreased lipoperoxidation with increased dose.

Keywords: Quinoa, lipid peroxidation, malondialdehyde (MDA)

Introduccin:

La quinoa de variedad INIA 420 Negra Collana tiene una concentracin de protenas

de 17,62 %, la cual es una de las ms altas en comparacin a las otras variedades de

1,2
quinoa , inclusive supera a cereales como el maz (10,2%), arroz (7,6%) y trigo

(14,3%)3. Recientemente, los pptidos bioactivos han recibido mucha atencin cientfica

por su amplio alcance de bioactividades, incluyendo principalmente la antioxidacin,

antihipertensivos, anticancergenos, y propiedades antimicrobianas. Los pptidos

antioxidantes son especialmente prominentes por sus notables contribuciones a la mejora

de la salud humana a travs de la prevencin y el tratamiento de enfermedades

degenerativas crnicas no transmisibles, tales como enfermedades cardiovasculares y

cerebrovasculares, cncer, artritis reumatoide o la diabetes. Sin embargo, la hidrlisis

enzimtica es el mtodo ms efectivo, comn y confiable para obtener pptidos bioactivos

4
. En distintos estudios se usan Quimiotripsina, Papana, Pepsina, Flavourzyme, Alcalasa

y Protamex para hidrolizar las protenas del a soja 5. Las enzimas gastrointestinales,

usualmente pepsina y tripsina, enzimas vegetales, como papana, diferentes

combinaciones de proteasas, as como enzimas de fuentes microbianas, tales como

alcalasa, flavourzyma, neutrasa, etc., han sido utilizadas para generar pptidos bioactivos

de varias protenas de origen vegetal. Sin embargo no se ha encontrado estudios en donde

la enzima bromelina haya sido usada para hidrolizar protenas procedentes de origen

vegetal. Es por ello que en este estudio adems se demostrar la accin de la bromelina
que se encuentra presente en la pia. El MDA es un cetoaldehdo fisiolgico producido

por descomposicin de lpidos insaturados provenientes del metabolismo del cido

araquidnico. El exceso de MDA producido como resultado del dao tisular puede

combinarse con grupos aminos de protenas (este reacciona fundamentalmente con

residuos de lisina por la reaccin de adicin de Michael) lo que produce aductos de

protenas modificadas. Estas modificaciones son inmunognicas y se han detectado

autoanticuerpos contra residuos de lisina modificados por MDA en suero de conejos y

humanos. Estos auto-anticuerpos se han relacionado con la aterosclersis, insuficiencia

6
arterial coronaria y el infarto de miocardio Entre la variedad de mtodos analticos

desarrollados para determinar el malondialdehido (MDA) endgeno el ms comnmente

7-8
utilizado se basa en la reaccin del mismo con el cido 2-tiobarbitrico (TBA) . El

MDA, en condiciones de bajo pH y alta temperatura, reacciona con el cido tiobarbitrico

(TBA) dando lugar a un aducto MDA-TBA cromgeno o pigmento rojo que es detectable

por espectrofotometra o por fluorimetra9. Este procedimiento mide el malondialdehdo

(MDA) formado como producto principal de la degradacin de hidroperxidos generados

por la oxidacin de lpidos. Producto de color rosa que puede ser medido

espectrofotomtricamente a 532535 m. Como producto final de la peroxidacin

lipdica predomina el malondialdehdo (MDA), principal sustrato de esta reaccin. El

MDA reacciona con el cido tiobarbitrico (TBA). Un mol de MDA reacciona con dos

moles de TBA en medio cido y a alta temperatura. La velocidad de esta reaccin depende

de la concentracin de TBA, la temperatura y el pH9 La espectrometra de fluorescencia

(tambin llamada fluorometra o espectrofluorimetra) es un tipo de espectroscopia

electromagntica que analiza la fluorescencia de una muestra. Se trata de utilizar un haz

de luz, por lo general luz ultravioleta, que excita los electrones de las molculas de ciertos

compuestos y provoca que emitan luz de una menor energa, generalmente luz visible
(aunque no necesariamente). Los dispositivos que miden la fluorescencia se llaman

fluormetros o fluormetros10. Es posible identificar el complejo MDA-TBA por el

mtodo de la espectrofluorometria, con una emisin mxima a los 532-535 nm. Basado

en la capacidad de reaccionar el MDA con un grupo amino de los fosfolpidos y dar un

compuesto fluorescente11-12. El ensayo de TBA puede determinarse por un procedimiento

espectrofluoromtrico dado que el espectro de excitacin del pigmento TBA-MDA posee

un mximo a 532 nm. El propsito del trabajo es evaluar el efecto del hidrolizado

enzimtico de quinua negra sobre los niveles de peroxidacin lipdica en el cerebro de

ratones con hipercolesterolemia inducida.

Material y Mtodos:

Todos los reactivos qumicos y equipos fueron obtenidos de la catedra de bioqumica, se

utiliz agua bidestilada para todos los experimentos obtenido de la cadena de farmacias

INKAFARMA y los animales de experimentacin fueron obtenidos del Instituto Naciona

l de Salud (Lima, Per).

Obtencin del hidrolizado proteico:

Este modelo experimental se comenz a trabajar con 25g. de quinua negra cocida y con

75mL de agua, se licu estos dos componentes; luego se agreg 25 mL de extracto de

pia, el cual se obtendr mezclando 200 g. de pia y 300 mL de agua (por 3 minutos). Se

calent por 2 horas, a50 C manteniendo el pH entre 5 a 7.

Induccin a hipercolesterolemia

En este modelo experimental se utilizaron 59 ratones albinos machos Wistar con peso

promedio de 25 5 gramos procedentes del Instituto Nacional de Salud (Lima, Per). Los

animales fueron alojados dentro del Bioterio del Departamento Acadmico de

Farmacologa de la Facultad de Medicina Humana de la Universidad Nacional Mayor de

San Marcos. Se consider un microambiente adecuado, segn los estndares de gua de

manejo y cuidado de animales de experimentacin, una jaula diseada para su bienestar,

recomendacin de espacio (densidad del animal), lecho, suministro diario de agua y

alimentos de 3-7ml y 3-6g respectivamente y un macro ambiente adecuado, considerando

una temperatura de 20 a 25C con una oscilacin de 2C, humedad relativa ambiental

entre 40 y 70%, ventilacin, intensidad de luz, ruido y olor. Los grupos sern divididos

de la siguiente manera: Se dividirn en ocho grupos: Grupo 1 ser el grupo control (n=8);

Grupo 2 se administrar el queso graso (40%) (n=8); Grupo 3 se administrar el queso

graso con el hidrolizado de quinua 125 ul (n=7); Grupo 4 se administrar el queso graso

con el hidrolizado 250 ul (n=7); Grupo 5 se administrar queso graso con el hidrolizado

500 ul (n=7) ; Grupo 6 se administrar el queso graso con un patrn Atorvastatina (n=7)

, en este caso se utilizar la atorvastatina ; Grupo 7 se administrar el queso graso con la

quinua sin hidrolizar; Grupo 8 se administrar el queso graso con pia.

Tratamiento de la muestra :

13
Para el tratamiento de la muestra se tom en cuenta lo descrito por Florentini, E. ,

Pajuelo, M.14 y Crdenas, A.15 con algunas modificaciones, los ratones fueron dormidos

con ter, luego sacrificados por decapitacin y se procedi a retirar sus cerebros por la

parte occipital del crneo, se lav con solucin de cloruro de sodio 0,9% a 4C poniendo

los cerebros en tubos de 1,5 ml de polietileno e inmediatamente se guard en bolsas

de polietileno previamente marcada y posteriormente se almaceno a -80C hasta su

procesamiento.
Determinacin de malondialdehido (MDA):

Se realiz una curva de calibracin proteica con SBA (sero albmina bovina) partiendo de

una concentracin 0,2 mg/ml para evaluar la concentracin proteica de cada muestra de

homogenizado tenindolo en cuenta para su relacin con la cantidad de MDA. Tomndose

posteriormente 2 L de muestra problema ms 18 L de agua aadiendo finalmente 180

L de reactivo de Bradford para su posterior lectura a 595 nm en un espectrofotmetro

Synergy HTX. El contenido en TBARS fue usado como ndice de lipoperoxidacin

mediante el mtodo espectrofluorometrico descrito por Jimenz A.16 con algunas

modificaciones. Para el anlisis se tom 12,5 mg de tejido cerebral de cada muestra los

cuales se les aadi a 1 mL de buffer fosfato salino 50 mM pH 7,4 a 4C , estos fueron

homogeneizados primeramente con un vrtex durante 30 segundos y luego en un

sonicador durante 10 segundos y fueron almacenados por una semana en congelacin a

20 C. Posteriormente a 30 l del homogenizado se adicion 250 l de cido fosfrico

al 1%, 75 l de cido tiobarbitrico (TBA) al 0,6%. La mezcla reactiva se incub a 100C

en bao de agua durante 45 min. Trascurrido el tiempo se enfri en un bao de hielo y

seguidamente se centrifug a 3000 g durante 10 min a 4C. Se tomaron 150 l del

sobrenadante de cada muestra y se cuantific la fluorescencia a exc 485 y em 530 m

en el Fluormetro Synergy HTX. Paralelamente se prepar una curva de calibracin

MDA como estndar. Los resultados fueron expresados en mol de MDA/mg de

protenas.

Resultados:

El grupo que recibi queso graso (QG) present un mayor nivel de MDA con 2.17248

moles de MDA/ mg de protena, resultando ser un 3.5% mayor con respecto al grupo
 control (sin induccin a hipercolesterolemia). Los grupos que recibieron queso graso y

el hidrolizado de quinua a las concentraciones de 125l, 250l y 500l presentaron un

menor nivel de MDA de 10.37%, 17.36% y 35.84% respectivamente en comparacin al

grupo QG. Entre todos los grupos, el que se administr una dieta alta en grasa ms la

atorvastatina fue el que present la menor disminucin de MDA siendo de 9.6% con

respecto al grupo de QG. Se evidenci una mayor disminucin del nivel de MDA en el

grupo de queso graso ms la quinua sin hidrolizar siendo de 58% menos con respecto al

grupo de QG. El grupo de queso graso ms pia present tambin disminucin en un

15.56% de los niveles de MDA con respecto al grupo de QG. Todos estos resultados se

observan en la figura 1.

FIGURA 1. Niveles de MDA en cerebro de ratones inducidos a hipercolesterolemia. El grupo con

el tratamiento del hidrolizado de quinua a la concentracin de 125 ul, 250 ul y 500 ul present una

disminucin del 10.37%, 17.36% y 35.84%, respectivamente, del MDA. El grupo tratamiento con

la atorvastatina, quinua sin hidrolizar y pia, presentaron una disminucin del MDA de 9.6%, 58%

y 15.56%, respectivamente con respecto al grupo de QG. El grupo 5 presenta significancia

(*p<0.05).
Discusin:

En el presente estudio, la asociacin de una dieta diferente para cada grupo y el nivel de

oxidacin se evaluaron midiendo los niveles de MDA, en el homogenizado cerebral de

ratones. El contenido de MDA se forma a travs de la peroxidacin de cidos grasos

insaturados y se utiliza ampliamente como un ndice de macromolculas biognicas,

particularmente la peroxidacin de lpidos17.Nuestros resultados demostraron que las

diversas dietas administradas a los ratones inducidos a hipercolesterolemia durante un

tiempo de 3 semanas presentaron niveles distintos de MDA. Uno de los principales

factores a evaluar fue la actividad del hidrolizado de quinua sobre la peroxidacin lipdica,

la quinua al poseer actividad hipocolesterolemica ejerce un efecto de disminucin sobre la

peroxidacin lipdica18, sin embargo los estudios hechos solo se basan en la quinua sola y

en este estudio se evidencio la actividad de la quinua hidrolizada. En la induccin a

hipercolesterolemia en los ratones es trascendente mencionar que las grasas lcteas como

el queso tienen un papel fundamental en ello, ya que se ha demostrado en estudios

experimentales que la composicin de estas grasas lcteas en una dieta rigurosa puede

aumentar significativamente la hipercolesterolemia en los ratones19. Segn los resultados

mostrados en la Figura 1 , se observa que el valor de malondialdehido (MDA) en los

grupos a los que fueron inducidos a hipercolesterolemia, muestran un rango mximo de

2.17248 nmol de MDA / mg de muestra en el grupo Queso graso , sin embargo otros

autores pudieron elevar la concentracin de malondialdehido (MDA) en cerebro de

ratones hasta 27.80 0.70 nmol de MDA/ml 2, esto se puede explicar bsicamente por el

tipo de dieta que se va a administrar , ya que en este estudio se incluye el sebo de vacuno

como parte de la dieta20. El sebo o manteca tiene un papel fundamental en la induccin a

hipercolesterolemia, ya que se demuestra que la combinacin de casena como el queso

y manteca de cerdo en (20 %) y (20 %) de la dieta, muestra amplia ventaja de induccin

a hipercolesterolemia que una dieta pura en casena o una dieta pura en grasas de cerdo21.

Cabe destacar que se indujo la hipercolesterolemia a los ratones mediante la dieta de queso

graso , uno de los mtodos ms usados para inducir hipercolesterolemia es el uso de una

dieta de colesterol al 2% en goma tragacanto22 dentro de otro estudio se induce

hipercolesterolemia con maz y sebo de vaca 23. Dentro de los 8 grupos evaluados para

determinar la capacidad antioxidante se determin mediante la concentracin de MDA por

mg de protena, para calcular este dato se us una curva estndar de albumina pero tambin

se puede usar al 1, 1, 3,3-tetrametoxipropano como curva estndar 24. Dentro de nuestros

resultados la administracin de los hidrolizados de quinua a diferentes concentraciones

(125L, 250 L, 500 L) presentaron diferentes valores de MDA, el hidrolizado de quinua

a una concentracin de 500 L presento una significativa disminucin en los niveles de

MDA (1,36396 nmoles de MDA/mg de protena) con respecto al control positivo de Queso

Graso (2,17248 nmoles de MDA/mg de protena) lo cual denota la capacidad antioxidante

del hidrolizado de quinua; sin embargo al grupo que se le administro quinua sin hidrolizar

el valor del MDA fue menor que los grupos con quinua hidrolizada , esto hace su

explicacin mediante los polifenoles que posee la quinua estos compuestos reducen la
25
carga oxidante e inflamatoria de las clulas cerebrales . Un estudio hecho en ratas

inducidas a obesidad con una dieta rica en grasas y carbohidratos las cuales fueron tratadas

con extracto de tamarindo malabar (Garcinia cambogia) que tienen una alta cantidad de

polifenoles , se demostr que los niveles de MDA disminuyen conforme la concentracin

del extracto aumenta en este mismo estudio el grupo control presento una concentracin

baja de MDA con respecto a los otros tratamiento sin embargo en nuestro estudio el grupo

control tuvo una concentracin alta de MDA 26. Otro estudio en el cual utilizan una mezcla

de extracto de hierbas de Arachis hypogaea, extracto de cascara de nuez y Cucurbita

moschata demuestran que la concentracin de MDA (nmol/mg proteina) es menor en

comparacin al grupo tratado con un dieta rica en caloras27. En los hidrolizados de quinua

a diferentes concentraciones (125L, 250 L, 500 L) se agreg extracto de pia, la cual

tiene actividad proteoltica gracias a la bromelina, una glicoprotena del grupo de las

cisteinproteasas. Acta de preferencia sobre los aminocidos bsicos y aromticos de las

28
protenas . Esto con la finalidad de hidrolizar los enlaces peptdicos de las protenas

contenidas en el hidrolizado de quinua negra, la cual tiene una concentracin de 17.62 %,

dejando como residuo polipptidos bioactivos. Para tener una mejor actividad enzimtica

de la bromelina se establece que lo mejor es extraer la bromelina del extracto mediante el

solvente etanol, a temperatura de -10 C y durante un tiempo de siete das. En este mismo

estudio se muestra la actividad enzimtica (nmol/min) de los extractos obtenidos a partir

de las diferentes secciones de la pia, en la cual observamos que para corazn fue de

397,6642 nmol/ min, muy similar a pulpa (374,7928 nmol/min) y por arriba de cscara,

cuyo valor fue de 181,1357 nmol/min 29. En la metodologa de nuestro estudio no se tom

en cuenta la extraccin de la bromelina, solo se agreg 25 ml de extracto de pia sin ningn

tratamiento previo. En el grupo 8 se vio una disminucin significativa de MDA (1.8446

nmoles de MDA/mg de protena) comparado con el grupo de solo queso graso (2.17248

nmoles de MDA/mg de protena), debido a que la pia no tiene efectos antioxidantes

comprobados. En el tratamiento con atorvastatina y queso graso, la disminucin de MDA

es mnima comparada con el grupo de solo queso graso. En un estudio se concluye que la

atorvastatina conduce a una disminucin significativa del estrs oxidativo, determinado

por las concentraciones de MDA en pacientes con SOP (Sindrome de Ovario

Poliqustico)30. El hecho de que el hipercolesterolemia eleve los niveles de MDA y el

tratamiento con estatinas los disminuya, apoyara el carcter pro y antioxidante atribuido

en cada caso, respectivamente 31. Resaltar que, la mayora de estudios que demuestran las

propiedades antioxidantes directas de las estatinas, utilizan dosis suprafarmacolgicas de

las mismas. Una excepcin son los estudios de Mason RP y cols (2004) que utiliza un

derivado o-hidroxilado de la atorvastatina a niveles farmacolgicos (nM). Este metabolito

activo de la atorvastatina, es capaz de captar radicales libres por mecanismos de

protodonacin despus de su particin en el ambiente lipdico, siendo su capacidad de

absorcin de radicales diez veces superior a la del Trolox, un anlogo soluble de la

vitamina E con potentes propiedades antioxidantes (Mason RP y cols, 2004). Resaltar que

este mecanismo se ha descrito en el caso particular de la atorvastatina, por lo que

desconocemos su aplicabilidad al resto de estatinas, que tienen distinta estructura

qumica.31

Conclusiones:

El hidrolizado de quinua negra (hidrolisis enzimtica de pptidos por bromelina) a

diferentes concentraciones (125 ul, 250 ul, 500 ul) mostr eficacia en la disminucin de

la lipoperoxidacin en el cerebro de los ratones que fueron inducidos a

hipercolesterolemia, por lo tanto la semilla de quinua negra presenta una mayor capacidad

antioxidante a la concentracin de 500 ul .

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