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Rev Inst Nal Cancerol (Mex)

1999; 45 (4).
Artculo original 203

Vol. 45, Nm. 4


Octubre-Diciembre 1999
pp 203 - 208

ADN del virus del papiloma humano


en plasma de pacientes con
carcinoma cervicouterino: Un potencial
marcador de enfermedad residual mnima
Alfonso Dueas,*,** Adela Carrillo,* Litzie Fresnedo,*
Luz Mara Hinojosa,*** Citlalli Rojas,* Alejandra Snchez-Navarro,*
Catalina Trejo,* Carlos Lpez G,*** Blanca Segura,* Marcela Lizano*

RESUMEN que la deteccin del ADN del VPH en el plasma de las pacien-
tes es especfica de aqullas con cncer invasor y que esto po-
Antecedentes: El carcinoma cervicouterino es la primera dra constituir un marcador de enfermedad residual mnima
causa de muerte por cncer en mujeres mexicanas. Estudios y predictor temprano de recadas.
moleculares han demostrado que el virus del papiloma hu-
mano (VHP) es el principal agente etiolgico de esta enfer- Palabras clave:Cncer cervicouterino, virus del papiloma
medad. En este tumor no existe un marcador sensible y espe- humano, reaccin en cadena de la polimerasa.
cfico que pudiera utilizarse como marcador de enfermedad
residual mnima y para prevenir recadas tempranamente.
Dado que la amplificacin en plasma de secuencias de ADN ABSTRACT
especficas a tumores se ha utilizado con este fin, en este tra-
bajo se determin la factibilidad de amplificar, mediante reac- Background: Cervix carcinoma is the main cause of cancer
cin en cadena de la polimerasa en el ADN del plasma, se- death in Mexican women. There are molecular evidences that
cuencias de VPH en pacientes con cncer cervicouterino. the human papillomavirus (HPV) is implicated in its develop-
Material y mtodos:Se analizaron 34 pacientes con carci- ment. In this tumor there is not yet a useful marker of mini-
noma cervicouterino invasor con diferentes estadios clnicos mal residual disease nor to detect early recurrences. In other
sin tratamiento previo y 24 mujeres con infeccin cervical tumors, the PCR amplification of tumor-specific DNA se-
por VPH pero sin lesiones invasoras. La extraccin del ADN quences from the plasma of cancer patients with that aim has
se realiz mediante tcnicas estndar: digestin con proteina- been reported. In this work we have determined the feasibility
sa K, extraccin con fenol-cloroformo y precipitacin con of amplifying VPH sequences from the plasma DNA in patients
etanol. Para verificar la calidad del ADN, se amplific un with cervix cancer. Material and methods:We analyzed 34
fragmento del gen de la -globina. Las secuencias del VPH se patients with untreated cervix cancer irrespective of the clini-
amplificaron con los oligonucletidos generales LICI-LIC2. cal stage and 24 patients with proven HPV cervical infection
Las muestras positivas tambin se amplificaron con oligonu- but no invasive disease. DNA was obtained from the plasma
cletidos especficos para VPH tipos 16 y 18. Resultados: using standard techniques: proteinase K digestion, phenol-
ADN del VPH se encontr en el 70% de los casos de pacientes chloroform extraction and ethanol precipitation. To verify the
con cncer y no se amplific en los 24 controles. No se en- quality of DNA a fragment of the -globin gene was ampli-
contr correlacin entre el resultado de la reaccin en cadena fied. HPV sequences were amplified using the primers LICI-
de la polimerasa con el estadio clnico ni con el tipo viral, LIC2 and the positive samples were also typified using prim-
pero se observ menor frecuencia de positividad en los tumo- ers specific for types 16 and 18. Results: HPV sequences were
res adenoescamosos. Conclusin: Los resultados sugieren amplified in 70% of the patients with cancer and the PCR was
negative for the 24 control women. There was no correlation
between the DNA amplification and clinical stage or viral
type, however, adenosquamous tumors were more frequently
negative. Conclusion: Our results suggest that the detection
* Divisin de Investigacin Bsica. Instituto Nacional de of HPV DNA in plasma is specific for patients with invasive
Cancerologa (INCan). Mxico, D.F. cervical cancer and that it could be a marker for minimal re-
* * Departamento de Oncologa Mdica. (INCan). sidual disease and for early detection of relapse.
*** Departamento de Ginecologa. (INCan).
Key words: Cervical cancer, human papillomavirus,
Fecha de recepcin 03/08/99. Fecha de aceptacin 07/09/99. polymerase chain reaction.
Dueas A y cols. ADN del virus del papiloma humano como marcador de enfermedad residual mnima en cncer cervicouterino
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El cncer cervicouterino (CaCu) representa la prin- MATERIAL Y MTODOS


cipal causa de muerte por neoplasias en mujeres
mexicanas.1 El virus del papiloma humano (VPH) Pacientes
es el principal agente etiolgico, ya que el cido
desoxirribunocleico (ADN) de este virus se ha iden- Pacientes con cncer: Se analizaron 34 mujeres con-
tificado en ms de 90% de las muestras de carcino- secutivas con cncer cervicouterino, independiente-
ma cervicouterino.2 En el tumor no existe un mar- mente del estadio clnico e histologa del tumor, que
cador de utilidad demostrada para evaluar la res- acudieron al Instituto Nacional de Cancerologa. El
puesta al tratamiento ni para detectar de manera nico requisito para ser incluidas en el estudio fue
temprana las recurrencias. la disponibilidad de biopsia del tumor primario y
Desde hace varios aos se ha demostrado que el sangre, y que otorgaran su consentimiento para par-
ADN se encuentra circulando en el suero tanto de ticipar en el estudio.
individuos normales como de pacientes que pade- Pacientes sin cncer: El grupo control estuvo
cen cncer. En stos ltimos la cantidad de ADN constituido por pacientes que acudieron a la con-
circulante se relaciona directamente con la carga sulta externa del Hospital Gea Gonzlez por diver-
tumoral, ya que los niveles de ADN en suero dis- sos motivos, todos ellos patologa benigna del
minuyen en el 99% de losenfermos con mejora cl- tracto genital inferior o simplemente para citolo-
nica, reduccin del tamao tumoral; o aumentan ga de rutina. A estas mujeres, se les tomaba biop-
en caso de progresin. 3 sia cervical y muestra de sangre como parte de
otro estudio (no relacionado y efectuado por otra
La amplificacin mediante reaccin en cadena institucin) relacionado con el factor de crecimien-
de la polimerasa (PCR) del ADN en plasma de se- to epidrmico.
cuencias especficas a tumores como oncogenes
mutados, podra utilizarse como un marcador de Extraccinde ADN
enfermedad residual mnima, como predictor de re-
cada y para valorar la respuesta al tratamiento. Extraccin del ADN: El tejido (biopsias de crvix) se
En este sentido, el oncogn K-ras mutado se ha deposit en un tubo eppendorf; se disgreg mecni-
encontrado en suero de pacientes con carcinoma de camente y se adicionaron: 400 L de tampn de lisis
pncreas y colorrectal,4 as como el oncogn N-ras (Tris 50 mM +EDTA 1 mM), 12 L de SDS 20% y 6
en la leucemia mieloblstica aguda y sndromes L de proteinasa K (20 mg/mL). Posteriormente, la
mielodisplsicos. 5 Se ha observado que el tipo de muestra se incub a 55o C durante toda la noche.
mutacin encontrada en el tumor primario es Extraccin del ADN de plasma: Se recolectaron
siempre la misma que la detectada en el suero o 3 mL de sangre en un tubo que contena EDTA
plasma de los pacientes con estas neoplasias, lo (tubo para biometra hemtica) y, una vez centri-
cual hace factible su utilizacin como marcador de fugados, se tomaron 500 L de plasma en un tubo
respuesta al tratamiento. eppendorf al cual se adicionaron 1,000 L de tam-
Por otro lado, tanto en carcinomas de cabeza y pn de lisis (Tris 50 mM +EDTA 1 mM), 25 L de
cuello, como en el de clulas pequeas de pulmn, SDS 20% y 12 L de proteinasa K (20 mg/mL).
se ha detectado la presencia de microsatlites de Posteriormente, la muestra se incub a 55 o C toda
ADN en suero, lo que correlaciona especficamente la noche. Despus de la digestin con proteinasa
con la alteracin detectada en el tumor prima- K, la extraccin del ADN de las muestras de tejido
rio. 6,7 Finalmente, se ha amplificado con PCR 8,9 y plasma, se realiz mediante fenol-cloroformo y
reordenamientos del gen de cadenas pesadas de in- precipitacin con etanol de acuerdo a lo descrito
munoglobulinas en plasma de pacientes con linfo- por Sambrook. 10 El ADN obtenido se cuantific
mas. Esto resulta de gran utilidad para evaluar la mediante espectrofotometra.
respuesta al tratamiento y para detectar la presen-
cia de enfermedad molecular residual; adems de Reaccin en cadenade
que pudiera predecir recadas. Por lo anterior, la polimerasa(PCR)
dado que el ADN del VPH se encuentra ya sea en
forma episomal o integrado en las clulas tumora- Amplificacin del gen de -globina: Para comprobar que
les del crvix, su deteccin en el suero o plasma el ADN extrado del plasma era adecuado para utilizarse
podra ser posible y de utilidad para monitorear la en la PCR, todas las muestras se probaron para la am-
respuesta y predecir recadas tempranas. plificacin del gen de la -globina, que es un gen muy
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conservado. Se utilizaron los siguientes oligonucleti- de control (LCR).15 18LCR.a 5 -GGGGATCCCGG-


dos11: GH20: 5-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3 y TTGCATAAACTATGTAT- 3 y 18LCR.b 5 -GGA-
PC04: 5-CAACTTCATCCACGTTCACC-3 AGCTTTCGGTTGCCTTTGGCTTATG- 3
Estos oligonucletidos amplifican un fragmento de En las reacciones se utiliz como control positivo
268 pares de bases (pb) a una temperatura de 55o C. ADN extrado de la lnea celular HeLa (que contiene
Amplificacin de una regin del gen L1: El ADN secuencias de HPV18 integradas); y como control ne-
que se comprob adecuado para la reaccin de PCR gativo ADN de la lnea celular C33, originada de un
fue utilizado para amplificar secuencias del VPH. Con tumor epidermoide de crvix que no contiene secuen-
este fin, se utilizaron los oligonucletidos generales cias de VPH.
L1C1: 5-CGT AAA CGT TTT CCC TAT TTT TTT-3 Los productos de la amplificacin por PCR de las
y L1C2: 5-TAC CCT AAA TAC TCT GTA TTG-3, que muestras se visualizaron en geles de agarosa al 1.5%
generan un fragmento de aproximadamente 240 pares teidos con bromuro de etidio.
de bases de la regin L1 y detectan un gran nmero de Se analiz la correlacin entre los resultados de
secuencias de VPHs.12 Para un volumen de 20 L por la amplificacin por PCR de las muestras de plasma
reaccin, se aadieron 20 pmoles de cada uno de los de las mujeres con y sin cncer mediante la prueba
primers; 2 L de tampn 1X para PCR, 2 L de dNTPs exacta de Fisher. Se utiliz la misma prueba para
(dATP, dGTP, dCTP ydTTP) a 200 mM, cloruro de el anlisis de la correlacin entre los resultados de
magnesio a una concentracin final de 2 mM y 0.15 L la amplificacin por PCR en el plasma, el tipo de
(0.75U) de la enzima Taq Gold Polimerasa (Perkin El- VPH encontrado y las caractersticas clinicopatol-
mer). Las reacciones se sometieron a 40 ciclos de am- gicas de las pacientes.
plificacin en un termociclador (Modelo 480, Perkin-
Elmer). El programa consisti en: un ciclo de 12 minu- RESULTADOS
tos a 94o C, 38 ciclos de 94o C por un minuto, 48o C por
un minuto y 72o C por un minuto; ms un ciclo final de Se realiz la prueba de PCR para la deteccin de se-
extensin a 72o C por 10 minutos. cuencias del ADN del VPH del plasma de las 34 pa-
Determinacin de VPH16 y VPH18: Con el fin de cientes cuyas biopsias del tumor primario estuvie-
determinar el tipo viral en las muestras de biopsias ron asociados a VPH. El 70% (24 pacientes) resul-
positivas a VPH, se utilizaron oligonucletidos espe- taron positivas, lo cual representa un 70% de
cficos para los tipos de VPH ms frecuentes en le- sensibilidad de la prueba. La figura 1 muestra un
siones invasoras del crvix: VPH16 y VPH18.13 ejemplo de la amplificacin por PCR de la regin L1
Para VPH16, se utiliz un par de oligonucletidos de dichas muestras.
que amplifican un fragmento de 792 pb de la regin Se analizaron 24 muestras de plasma provenien-
E6-E7:14 16E6.1: 5-ATGCACCAAAAGAGAACTGC- 3 tes de pacientes con infeccin cervical por VPH, pero
y 16E7.2: 5- GGATCAGCCATGGTAGATTA- 3 sin cncer. El ADN del VPH no se amplific en nin-
Para VPH18, se utilizaron oligonucletidos que guna de las muestras de plasma de estas pacientes.
amplifican un fragmento de 220 pb de la regin larga Para descartar que en los casos negativos la falta de

Figura 1.

Amplificacin mediante reaccin en


cadena de la polimerasa en plasma de
un fragmento de la regin L1 del virus
del papiloma humano, utilizando los
oligonucletidos L1C1 y L1C2 de
muestras de pacientes con cncer
cervicouterino. El fragmento esperado
es de 240 pares de bases. Como control
negativo se utiliz el ADN extrado de la
lnea celular C33 y como control positivo
el extrado de la lnea celular HeLa.
Dueas A y cols. ADN del virus del papiloma humano como marcador de enfermedad residual mnima en cncer cervicouterino
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Figura 2.

Amplificacin mediante reaccin en


cadena de la polimerasa de un
fragmento del gen -globina de muestras
de plasma de mujeres con infeccin
cervical por virus del papiloma humano,
pero sin cncer. El fragmento esperado
es de 268 pares de bases. La banda de
454 pares de bases corresponde al
fragmento de la regin L1 (primers
MY09/MY11), empleado como control
positivo de la reaccin en cadena de la
polimerasa en la lnea celular HeLa.
Como control negativo se utiliz el ADN
extrado de la lnea celular C33.

amplificacin haya sido debido a mala calidad del DISCUSIN


ADN u otros problemas tcnicos, a todas las mues-
tras se les amplific un fragmento del gen de la -glo- El carcinoma cervicouterino es una neoplasia alta-
bina (Figura 2). mente prevalente en nuestro pas y la principal cau-
Al comparar los resultados de la amplificacin en- sa de muerte por cncer en mujeres mexicanas.1
tre las mujeres con y sin cncer, se encontr una di- Aunque se estn realizando esfuerzos importantes en
ferencia altamente significativa (p < 0.0000001) ya la prevencin del mismo, la esperada reduccin de
que en el 70% de las mujeres (24 de 34 pacientes) con mortalidad no es un efecto inmediato, por lo que es
cncer se les detect el ADN, mientras que no se de- necesaria la investigacin dirigida a mejorar, de una
tect en ninguna (0%) de las 24 sin cncer. Esto in- u otra manera, el pronstico de estas pacientes una
dica que la sensibilidad de la prueba es del 70% y la vez diagnosticada esta enfermedad.
especificidad del 100%. El tratamiento convencional del cncer cervi-
El anlisis de la correlacin entre el resultado couterino no se ha modificado sustancialmente en
de la PCR con el estadio clnico de las enfermas no las ltimas dcadas y consiste en ciruga y/o radio-
mostr asociacin significativa. Se encontr posi- terapia. Ms recientemente, la quimioterapia se ha
tividad desde estadios clnicos IB1 hasta en esta- estado evaluando en combinacin con alguna de las
dios IV; sin embargo, casi la mitad de los casos modalidades locales.16 El tratamiento del cncer de
fueron IIIB, por lo que estos resultados deben to- crvix es efectivo en etapas clnicas tempranas; sin
marse con precaucin debido al pequeo nmero embargo, en las etapas clnicas a partir del estadio
de casos con estadios I. Al analizar los resultados IB2 los resultados del tratamiento no son muy sa-
con relacin al tipo histolgico (cuadro I) se encon- tisfactorios con supervivencias a cinco aos que va-
tr que los tumores adenoescamosos grado 2 (epi- ran entre el 15 y 85%.
dermoides poco diferenciados productores de moco) Los marcadores tumorales, sobre todo cuando
fueron ms frecuentemente negativos (p = 0.0001). son sensibles y especficos, son de gran utilidad
La relacin fue la siguiente: de 23 tumores de clu- para el manejo de los pacientes con cncer. El ejem-
las escamosas, 20 resultaron positivos y tres nega- plo ms tpico de ello es el carcinoma germinal de
tivos; y de nueve adenoescamosos, tres fueron po- testculo en donde las decisiones del manejo estn
sitivos y seis negativos. en gran parte determinadas por los niveles de mar-
El anlisis del tipo de VPH en las biopsias L1 cadores; adems, la determinacin de marcadores
positivas, mostr que 17 de las 34 pacientes fueron es til para predecir de manera temprana las reca-
positivas a VPH16 (50%), mientras que ocho re- das. En el carcinoma cervical no existe un marca-
sultaron positivas a VPH18 (20%), y nueve corres- dor sensible y especfico que se utilice rutinaria-
pondieron a otros tipos virales. Sin embargo, no mente en el manejo de las pacientes.
existe ninguna correlacin entre el tipo de VPH de En este trabajo se demuestra que el ADN del
la muestra y la positividad o negatividad a VPH VPH se encuentra circulando en el plasma del 70%
en plasma. de las pacientes cuyos tumores primarios son posi-
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tivos al virus e, importantemente, est ausente en sino tambin en otras neoplasias escamosas; pero
las pacientes sin cncer pero con infeccin cervical su utilidad es muy limitada por su falta de especifi-
por VPH lo que sugiere que lo detectado en suero cidad ya que se ha encontrado elevado en varias
no se debe a viremia o la liberacin de ADN por condiciones patolgicas no neoplsicas, como tuber-
las clulas no tumorales infectadas por el virus. culosis, sarcoidosis, quistes broncognicos, eccema,
Lo anterior sugiere que, de manera similar a lo pnfigo y psoriasis.20 Otros autores sealan que los
que sucede con marcadores tales como K o N-ras niveles del SCC muestran excelente correlacin con
mutados, microsatlites o reordenamientos de in- el estadio clnico; sin embargo, es esta ltima varia-
munoglobulinas, la deteccin de estas secuencias ble la ms importante para determinar la respuesta
en el plasma o suero de los pacientes es indicativo al tratamiento y el pronstico.21 Por otra parte, la
de que la nica fuente posible de las mismas son falta de especificidad y la necesidad de establecer
las clulas tumorales.4-9 valores de corte para determinar su significado cl-
Es notorio que no todas las mujeres con carci- nico hacen poco til la aplicacin del SCC para eva-
noma de crvix asociado a VPH mostraron ADN luar la presencia de enfermedad residual mnima o
del virus en circulacin. El hecho de que en esas detectar recadas tempranamente.22
pacientes se haya podido amplificar -globina des- La determinacin mediante PCR del VPH en plas-
carta degradacin del ADN u otros problemas tc- ma de las pacientes con cncer de crvix pudiera te-
nicos de la prueba. Es posible que existan diferen- ner implicaciones teraputicas en el sentido de que
cias biolgicas entre un tumor con mayor o menor su persistencia, pese a una respuesta clnica comple-
capacidad de liberar ADN a la circulacin. De he- ta, podra ser un marcador de enfermedad residual o
cho, aunque est demostrado in vitro que las clu- molecular mnima ya que tericamente la fuente de
las pueden liberar ADN al medio de cultivo,17,18 no ese ADN necesariamente tendran que ser las clulas
se conocen los mecanismos responsables, ni si esto tumorales. En esta situacin, el uso de terapias
tiene una funcin biolgica. Lo que s se conoce es adyuvantes o complementarias podra ser de mayor
que el ADN circulante no es consecuencia de des- utilidad por la seleccin de pacientes en riesgo de re-
truccin celular (necrosis o apoptosis) ya que en currencia clnica. Por otra parte, como ha sido docu-
este caso el ADN estara degradado y, por lo tan- mentado con la deteccin de otras secuencias espec-
to, incapaz de ser amplificado. Un dato que apoya ficas de tumor en plasma o suero,4-9 una paciente
lo anterior es que en pacientes con cncer que son con PCR negativa para el VPH despus de trata-
tratados, ya sea con quimioterapia o radioterapia, miento que durante el seguimiento se transforme en
la respuesta tumoral que obviamente se produce positiva podra ser un indicador de recada inminen-
por apoptosis o necrosis no se acompaa de aumen- te. De comprobarse esto, entonces se podr estar en
to inmediato del ADN circulante, sino de disminu- la situacin de investigar prospectivamente si el pro-
cin.3 Otra posibilidad es que el estado de integra- nstico de estas pacientes mejora al detectar y tratar
cin del genoma de VPH y/o el nmero de copias in- las lesiones de manera ms temprana. Finalmente,
fluyen en la capacidad de las clulas tumorales de se debe mencionar que el procedimiento es prctico y
liberar este ADN. muy simple, por lo que, de comprobarse su utilidad,
Aunque en este trabajo no se encontr ninguna podra ser realizado rutinariamente en cualquier
asociacin entre el tipo viral contenido en la mues- hospital con un laboratorio que cuente con la capa-
tra de biopsia y la deteccin de VPH en el plasma cidad de efectuar la PCR.
de la misma paciente, no se descarta la posibilidad En conclusin, nuestros resultados demuestran
de que este aspecto influya en la capacidad de libe- por primera vez que mediante la PCR es factible de-
racin de ADN de los tumores. Se ha propuesto tectar la presencia de ADN del VPH en el plasma de
que existen diferencias en conductas biolgicas en- las pacientes con cncer de crvix; tambin indican
tre variantes intratipo, 19 las cuales no se determi- que esta prueba es altamente especfica y que podra
naron en este estudio. ser un marcador molecular de enfermedad residual
Estos resultados preliminares podran ser de mnima y predictor de recadas.
gran inters ya que la determinacin mediante am-
plificacin por PCR del VPH en las pacientes con
cncer cervicouterino podra ser un marcador sen- AGRADECIMIENTOS
sible y altamente especfico. Hasta el momento, el Este trabajo ha sido realizado con el apoyo del CONACYT a
antgeno de clulas escamosas (SCC) ha sido eva- los proyectos de investigacin I 29873-M y 28673-M otorgados
luado extensamente no slo en cncer de crvix, al Dr. Dueas y a la Dra. Lizano, respectivamente.
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