INTRODUO HISTOLOGIA

A Histologia definida como sendo a cincia, parte da biologia, que estuda os tecidos.
O termo histologia foi usado pela primeira vez em 1819 por Mayer, que aproveitou o termo
tecido que Bichat (anatomista francs) instituiu, muito tempo antes (por volta de 1800), para
descrever macroscopicamente as diferentes texturas encontradas por ele no corpo animal.
Mayer fez a conjuno do termo histos = tecido e logos = estudo. E o que tecido?

Tecido
H vrios conceitos para tecido. possvel encontrar alguns autores que definem
tecido como sendo um conjunto de clulas que apresentam mesma forma, mesma funo e
mesma origem embrionria. Mas, este conceito no possui muita sustentao histolgica. Se
analisarmos, por exemplo, o sangue, veremos que a forma de uma hemcia (disco bicncavo,
anucleado na maioria dos animais domsticos) totalmente diferente de um neutrfilo
(ovide, quando no sangue, com ncleo lobulado). Quanto funo destas clulas: a hemcia
transporta oxignio e gs carbono, enquanto o neutrfilo uma clula fagocitadora. Portanto,
vemos que apesar de pertencerem ao mesmo tecido elas no tm a mesma forma e to pouco
a mesma funo. Ainda outro exemplo nos remete a raciocinar: no tecido sseo os ostecitos
so clulas arredondadas cuja funo contribuir na manuteno da matriz ssea, enquanto
os osteoclastos so clulas cuja forma varia muito, pois se movem atravs da emisso de
pseudpodes e so responsveis pela reabsoro ssea. Portanto, nem possuem a mesma
forma e muito menos a mesma funo. Poderamos discorrer muito mais, mostrando inmeros
exemplos em que se constata que a grande maioria dos tecidos constituda por clulas que
tm funes e forma diferentes. J quanto afirmao de que as clulas de um tecido
apresentam mesma origem embrionria, de fato esta afirmao aplicvel. As clulas que
compem um tecido normalmente apresentam mesma origem embrionria. Assim, como
conceituar tecido? Tecido um conjunto de clulas que apresentam a mesma funo geral e a
mesma origem embrionria. Diramos a mesma funo geral, pois um tecido apresenta uma ou
mais funes gerais. Por exemplo: os epitlios de forma geral apresentam como funo
principal revestir as superfcies corpreas, assim sua funo geral revestir uma superfcie. No
epitlio, como, por exemplo, o da traquia, tem-se a clulas ciliadas e as clulas caliciformes.
Ambas apresentam formas e funes diferentes, mas as duas realizam a funo geral de
revestir.
Origem Embrionria dos Tecidos
Neste ponto devemos comear do incio: quando o espermatozide (gameta
masculino) e o vulo (gameta feminino), ambas as clulas apresentando a metade do nmero

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de cromossomos (portanto haplides) de uma clula somtica da espcie, encontram-se em
ambiente propcio que pode ser o tero ou em meio de cultura ocorre a fecundao. As
duas clulas aps a fecundao formam uma clula, o zigoto, que uma clula diplide (como
o mesmo nmero de cromossomos de qualquer clula somtica da espcie). Formado o zigoto
ele passa a sofrer sucessivas mitoses, processo denominado de clivagem. Uma clula forma
duas, as duas formam quatro, as quatro formam oito e assim sucessivamente. Por volta do
stimo dia (na maioria dos animais domsticos) ps-fecundao o que se v um amontoado
de clulas envoltas por uma membrana translcida. Cada clula chamada de blastmero,
sendo clulas totipotentes (ainda no diferenciadas e com a potencialidade de originar
qualquer uma das clulas do corpo animal), e a membrana envoltria chamada de zona
pelcida. Este estgio do embrio por se assemelhar muito a uma amora chamado de
mrula. Os blastmeros sintetizam um lquido, rico em cido hialurnico, que vai se
acumulando dentro do embrio e por volta do oitavo/nono dia forma-se uma pequena
cavidade no interior do embrio, a blastocele. Neste momento o embrio passa a se chamar de
blstula ou blastocisto. Posteriormente, a cavidade aumenta e pela expanso interna do
embrio a mrula rompida (blastocisto eclodido). Esta massa celular comea a se dobrar para
dentro de si mesma e a se forma uma cavidade central chamada de gastrocele, neste
momento forma-se a gstrula. Nesta fase possvel identificar os dois primeiros tecidos
embrionrios ectoderma e endoderma. O ectoderma folheto embrionrio externo e o
endoderma o folheto embrionrio interno. Um pouco depois, a partir do endoderma forma-se
o folheto mdio, o mesoderma. A partir da comea haver diferenciao celular e formao dos
tecidos animais. Por exemplo: do ectoderma forma-se o tecido nervoso e alguns epitlios de
revestimento; j do mesoderma origina-se a maioria dos tecidos conjuntivos e musculares; do
endoderma alguns epitlios de revestimento.
Os tecidos embrionrios so trs (ectoderma, mesoderma e endoderma) e deles se
formam todos os tecidos do corpo animal, mas a propsito quantos e quais so os tecidos
encontrados no corpo animal?

Tecidos Fundamentais
Macroscopicamente Bichat, por volta de 1800, conseguiu identificar 21 diferentes tipos
de tecidos. Mas com o advento do microscpio foi possvel identificar muitos outros tecidos
(aproximadamente 41). Mas todos estes tipos podem ser agrupados em quatro diferentes
tecidos, chamados de tecidos fundamentais: os tecidos epiteliais, os tecidos conjuntivos, os
tecidos musculares e o tecido nervoso.

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MTODOS DE ESTUDOS HISTOLGICOS
Vrios so os mtodos de estudos dos tecidos, variando do estudo dos tecidos in vivo
at aqueles que utilizam os tecidos mortos. O mtodo mais utilizado em Histologia o
preparado histolgico permanente (lmina histolgica) estudado em microscpio ptico. A
seguir descrevemos as etapas de produo de uma lmina histolgica:

1 Etapa: Coleta da Amostra

A primeira etapa de todo o processo de preparao de uma lmina histolgica consiste
em coletar a amostra, ou seja, obt-la e isto pode ser feito de cinco diferentes maneiras:
a) Bipsia cirrgica obteno da amostra de tecido ou rgo atravs de uma inciso cirrgica;
b) Bipsia endoscpica usada para rgos ocos (estmago, intestino, etc) atravs de
endoscopia;
c) Bipsia por agulha a amostra (cilindro) obtida pela puno do rgo (fgado, pulmo),
sem precisar abrir a cavidade natural;
d) Cirurgias amplas (radicais) a amostra corresponde a peas grandes (ex. tumores) ou rgos
(ex. mama, tero);
e) Necrpsia procedimento utilizado para estudo anatmico de todos os rgos ou tecidos,
no animal morto.
As peas cirrgicas grandes ou de autpsia devem ser clivadas previamente para
reduzir sua espessura permitindo a penetrao fcil do fixador. O princpio fundamental de
clivagem que o fragmento possua em torno de 4 mm de espessura.

2 Etapa: Fixao
A base de uma boa preparao histolgica a fixao que deve ser completa e
adequada. Para tanto preciso tomar algumas precaues que so obrigatrias:
a) O material coletado deve ser imerso rapidamente no fixador;
b) O volume de fixador deve ser no mnimo dez vezes (10 X) maior que o volume da pea
coletada.
Os principais objetivos da fixao so:
a) Inibir ou parar a autlise tecidual;
b) Coagular ou endurecer o tecido e tornar difusveis as substncias insolveis;
c) Proteger, atravs do endurecimento, os tecidos moles no manuseio e procedimentos
tcnicos posteriores;
d) Preservar os vrios componentes celulares e tissulares;
e) Melhorar a diferenciao ptica dos tecidos;

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f) Facilitar a subseqente colorao.
A fixao pode ser fsica (utilizando-se o calor ou o frio) ou qumica. A fixao em
Histologia quase exclusivamente qumica, onde substncias (fixadores) so utilizadas com a
principal funo de insolubilizar as protenas dos tecidos. Os fixadores podem agir precipitando
as protenas ou as coagulando, assim temos como principais fixadores:
a) Que precipitam as protenas: cloreto de mercrio e cido pcrico;
b) Que coagulam as protenas: aldedo frmico (o mais utilizado, conhecido como fixador
universal), tetrxido de smio e o aldedo glutrico.
Com o intuito de se conseguir o fixador ideal, os histologistas elaboraram diversas
misturas fixadoras como, por exemplo, o lquido de BOUIN e o lquido de HELLY.
O formol a 10% para microscopia ptica e o aldedo glutrico em soluo de 2 a 6%
para microscopia eletrnica so os fixadores simples mais comumente utilizados.
O tempo de fixao varia de acordo com o tamanho da pea, constituio do tecido,
poder de fixao do fixador, objetivos a pesquisar e temperatura ambiente. No entanto, de
forma geral, tendo o fragmento, a ser fixado, uma espessura de 4 mm o tempo mnimo de
fixao de doze (12) horas.
Observao: Para que se possa examinar o tecido sseo ou tecido com reas de
calcificao, deve-se antes de process-lo, inclu-lo e cort-lo, proceder descalcificao que
consiste na remoo dos sais de clcio que se encontram depositados nos tecidos orgnicos
sem alterao da sua estrutura celular.
Os ossos ou outros materiais calcificados devem ser cortados em pequenos pedaos
(cerca de 4 mm) com serra adequada, antes da fixao. Depois de completada a fixao,
coloca-se o material na soluo descalcificadora. Geralmente so empregados como agentes
descalcificadores os seguintes cidos: ntrico, frmico, tricloactico, clordrico, pcrico, EDTA,
sulfossaliclico. No existe uma soluo descalcificadora ideal. A nica diferena entre as vrias
solues que umas agem mais rapidamente do que as outras. O cido usado deve ser
completamente removido do tecido depois de terminada a descalcificao. Isto feito pela
lavagem abundante e cuidadosa em gua corrente ou lcool, conforme o descalcificador
empregado. Esta lavagem deve ser no mnimo por quatro horas.

3 etapa: Processamento
Aps a preservao do tecido, a etapa seguinte consiste em prepar-lo para o exame
microscpico. Com a finalidade de permitir que a luz o atravesse, cortes muito delgados de
tecido tm que ser feitos. Infelizmente, embora o processo de fixao endurea o tecido, o
material no se torna suficientemente firme ou coeso para permitir cortes delgados perfeitos.

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Para que esse grau de firmeza seja atingido, o tecido deve ser completamente impregnado com
algum meio de sustentao que manter juntas as clulas e as estruturas intercelulares. Os
materiais de sustentao usados so denominados materiais de incluso.
Certos materiais de incluso, tais como Carbowax e a gelatina so solveis em gua e
os tecidos no precisam ser desidratados antes do uso. Os materiais mais comumente usados
so substncias semelhantes parafina que no so miscveis com gua. Quando estas
substncias forem utilizadas os tecidos tero que ser desidratados antes da incluso.

4 Etapa: Desidratao
Antes que um material de incluso, tal como a parafina, possa penetrar no tecido seu
contedo em gua deve ser removido. A desidratao levada a efeito imergindo o bloco de
tecido em concentraes crescentes de lcool etlico. O lcool o agente mais comumente
utilizado neste processo, sendo empregado numa srie crescente (70% - 80% - 90% - 100%)
para se evitar a retrao pronunciada do tecido ocasionando leses estruturais da clula de
carter irreversvel. O lcool tem a vantagem de endurecer mais o tecido. O volume de lcool
dever ser 10 a 20 vezes maior que o volume da pea.
Vrias so as substncias utilizadas como agentes de desidratao: lcoois etlico,
butlico, metlico e isoproplico, a acetona, o ter, o clorofrmio e o xido propileno. O lcool
etlico o mais utilizado em tcnica de rotina.
5 Etapa: Diafanizao (Clarificao)
A impregnao do tecido com meio de incluso impossvel nesse estgio porque as
substncias semelhantes parafina usadas para a incluso no se misturam com o lcool. O
tecido deve, portanto, ser imerso em um produto qumico e que o lcool e a parafina sejam
solveis. Assim a diafanizao consiste na infiltrao do tecido por um solvente da parafina que
seja ao mesmo tempo desalcolizante. A parafina no se mistura com gua e nem com lcool.
Ambos devem ser completamente removidos para que a parafina possa penetrar
eficientemente no tecido. O xilol comumente utilizado. Tal produto qumico muitas vezes
chamado de agente clarificador porque torna o tecido semi-translcido, quase transparente.
Entre os reagentes mais utilizados na fase de diafanizao podemos citar ainda: toluol,
clorofrmio, leo de cedro, benzol e salicilato de metila.
A quantidade de xilol (substncia mais empregada) utilizada deve ser 10 a 20 vezes o
volume da pea. A durao da clarificao varia com as dimenses, a constituio do material e
a temperatura.

6 etapa: Incluso (Impregnao)

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 A finalidade da impregnao eliminar completamente o xilol contido no material e a
total penetrao da parafina nos vazios deixados pela gua e gordura, antes existentes no
tecido. Este processo serve tambm para preparar o material para os cortes, removendo o
clarificante e endurecendo-o suficientemente e dando-lhe a consistncia adequada para que
possa ser cortado.
O tecido passado em duas trocas de parafina para assegurar a substituio de todo o
agente clarificador pela parafina. Emprega-se a parafina a uma temperatura de 56 a 60 C
(parafina fundida). O bloco de tecido permanecer imerso na parafina fundida (em estufa)
durante o tempo necessrio para a completa impregnao. Posteriormente sero retirados da
estufa e deixados temperatura ambiente at que a parafina endurea, aps isto o bloco de
parafina com o tecido ser retirado da frma e conduzido ao corte. Pode-se citar ainda como
agentes de impregnao: celoidina, goma arbica, parafina plstica, polietileno glicol e parafina
esterificada.

7 etapa: Microtomia
Para se obter cortes de material includo em parafina ou por congelao necessrio
um instrumento especial: o micrtomo. Os micrtomos variam de acordo com os fabricantes e
tem como fundamento duas peas principais: o suporte ou mandril (onde fixada a pea a
cortar) e a navalha. O suporte sempre encaixado a um parafuso micromtrico ou a uma
espiral metlica que o faz adiantar segundo seu eixo, em medida conhecida e que pode ser
regulada vontade. Esta medida tem como unidade o micrmetro que corresponde milsima
parte do milmetro. Normalmente um micrtomo faz cortes cuja espessura varia de 1 a 50
micrmetros, mas a espessura mais utilizada em microscopia ptica de 4 a 6 micrmetros. H
vrios tipos de micrtomos: rotativo, tipo Minot, de congelao e o destinado a trabalhos de
microscopia eletrnica.

8 etapa: Colagem do Corte Lmina

As fitas de cortes de parafina so estiradas cuidadosamente e os cortes individuais so
separados por um bisturi. Na superfcie de uma lmina de vidro feito um ponto de aderncia
(normalmente com albumina de ovo) e o corte de parafina colocado em banho-maria (gua
morna) de forma que as dobras provocadas pelo corte no tecido desapaream. Aps o que o
corte pescado com a lmina, preparada com albumina, na qual se adere.

9 etapa: Colorao

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 a tcnica tintorial empregada para facilitar o estudo dos tecidos sob microscopia. A
colorao de importncia fundamental em histologia, pois os tecidos no tratados tm pouca
diferenciao ptica. As coloraes de um modo geral se efetuam por processos fsico-
qumicos ou puramente fsicos e podem ser consideradas, segundo a modalidade, a ao, o
carter, o grau de ao, o tempo, o nmero de corantes e a cromatizao.
Quanto cromatizao, ou seja, de acordo com o nmero de cores conferidas s
estruturas pelas coloraes simples ou combinadas, estas tomam a denominao de
coloraes monocrmicas (uma cor), bicrmicas (duas cores), tricrmicas (trs cores) e
policrmicas (mais de trs cores).
Para se corar convenientemente a clula, deve-se recorrer a um mtodo de colorao
sucessiva do ncleo e do citoplasma.
A combinao mais comum de corantes usada em Histologia e Histopatologia a
Hematoxilina e Eosina (HE). A hematoxilina um corante natural obtido da casca de pau
campeche. Ela no realmente um corante e deve ser oxidada em hematena a fim de tornar-
se um corante. Ademais, o corante que resulta (hematoxilina-hematena) no tem afinidade
para os tecidos. Deve ser usado um mordente, como o alumnio ou o ferro, juntamente com a
mistura de hematoxilina antes que ela possa corar os tecidos. A mistura cora em azul-prpura.
A eosina um corante sinttico e produz uma colorao vermelha.
Nas clulas coradas com HE os cidos nuclicos presentes no ncleo so corados pela
hematoxilina, dando ao ncleo um tom azul-prpura. A eosina atrada pelos elementos
bsicos da protena do citoplasma da clula, corando-o de rseo a vermelho. Os componentes
dos tecidos que se coram prontamente com os corantes bsicos so chamados basfilos; os
que tm afinidade pelos corantes cidos so chamados acidfilos. A hematoxilina comporta-se
como um corante bsico e, portanto, cora o ncleo de modo basfilo. A eosina um corante
cido e cora os elementos bsicos da protena do citoplasma de maneira acidfila.
Certos corantes reagem com os componentes do tecido e os coram com uma cor
diferente da cor da soluo corante. A mudana de cor do corante chama-se metacromasia. O
azul-de-metileno, o azul-de-toluidina e a tionina so exemplos de corantes simples que exibem
metacromasia. Com os corantes azuis a cor muda para vermelho. A colorao dos mastcitos
com o azul-de-metileno constitui um bom exemplo. Os grnulos do citoplasma coram-se em
vermelho-prpura, enquanto que o resto do tecido fica azul. A causa da metacromasia no
totalmente compreendida, porm tem sido sugerido que devido polimerizao das
molculas do corante. Julga-se que a presena de macromolculas com radicais eletronegativos
no tecido facilita a polimerizao e provoca a mudana de cor.

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 Antes que o corte seja corado, a parafina em que ele foi includo deve ser removida. O
corte, que j foi aderido lmina de vidro (pescagem em banho-maria), banhado no xilol
para dissolver a parafina. Devido ao fato de muitos corantes serem solveis em gua, torna-se
necessrio remover o xilol do tecido e substitu-lo por gua (hidratao). O corte imerso em
uma srie de concentraes decrescentes de lcool etlico at que esteja hidratado. Depois que
o corte estiver hidratado procede-se colorao propriamente dita. No caso da HE, o tecido
imerso primeiramente em hematoxilina, lavado com gua para retirada de excedente, depois
imerso em eosina e, aps isto tambm se faz lavagem do tecido.

10 etapa: Montagem
Depois que o corte tiver sido corado com a soluo apropriada, ele passado atravs
de concentraes crescentes de lcool para remover, de novo, a gua (desidratao). Objetiva-
se com esta desidratao aumentar a sobrevida do preparado histolgico.
Finalmente, o corte banhado em xilol antes de ser montado em um meio solvel em
xilol, que o meio de montagem (para os cortes de parafina usado o Blsamo de Canad).
Uma gota do meio de montagem colocada sobre o corte e a lamnula posicionada sobre o
corte de forma delicada, de uma forma tal que o meio de montagem cubra completamente o
corte. Depois a lamnula comprimida com firmeza sobre o corte e o meio de montagem se
espalha formando uma delgada pelcula entre a lmina e a lamnula que posteriormente vo
estar firmemente aderidas uma outra pela estabilizao do meio de montagem.

INTRODUO MICROSCOPIA
O estudo da Histologia depende da utilizao da microscopia. Na realidade para se
conhecer a anatomia microscpica dos tecidos e rgos necessrio fazer uso do
microscpio. Portanto, o aluno de Histologia deve necessariamente conhecer os fundamentos
bsicos da microscopia. Assim sendo, passaremos descrio mais detalhada de um
microscpio ptico, depois citaremos alguns conceitos ligados microscopia ptica e
finalizando descreveremos outros tipos de microscpicos, alm do microscpio ptico.

1. Microscpio ptico
Um microscpio ptico pode ser simples ou composto: o microscpio simples possui
uma nica lente e s fornece uma imagem moderadamente aumentada do objeto que se est
estudando; o microscpio composto consiste de uma srie de lentes e fornece um aumento
muito maior.

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Partes de um microscpio ptico composto
Um microscpio composto consiste de partes mecnicas e pticas. A parte mecnica
tem uma base que estabiliza o microscpio, uma coluna ou canho que se estende da base
para cima, e uma platina na qual colocado o objeto a ser examinado. As partes pticas esto
presas coluna acima e abaixo da platina e so elas: oculares, objetivas, condensador e
espelho. Em muitos microscpios o espelho e a lmpada esto alojados, com segurana, na
base do instrumento.
A ocular consiste de uma combinao de lentes que esto embutidas na extremidade
superior do tubo do microscpio. O valor gravado tal como 12,5 x indica o aumento da ocular.
As objetivas (pode haver trs, quatro ou cinco) so uma combinao de lentes presas
extremidade inferior do tubo do microscpio. O valor gravado tal como 10x, indica o aumento
da objetiva. Uma objetiva 10x usada em combinao com uma ocular 12,5x d um aumento
total de 125x. As diferentes objetivas atarraxam-se ao revlver, que por sua vez est preso
extremidade inferior do tubo do microscpio. Troca-se uma objetiva por uma outra pela
rotao do revlver, de modo que quando uma objetiva substituda outra entra em seu lugar.
O condensador uma combinao de lentes situada abaixo da platina. Ele projeta um
cone de luz sobre o objeto que est sendo observado. O condensador pode ser levantado ou
abaixado por um mecanismo de cremalheira, de sorte que a luz pode ser focalizada no objeto.
A passagem de raios marginais no condensador impedida pelo diafragma ris.
O espelho que est situado abaixo do condensador reflete os raios luminosos
emanados da fonte de luz. Situado entre o espelho e o condensador existe um porta-filtro
mvel.

Como Funciona o Microscpio ptico?

O objeto a ser estudado montado em uma lmina de vidro, que colocada na platina
do microscpio. O objeto posto em posio sob a objetiva seja manualmente ou usando a
platina mecnica. Faz-se o foco correto do objeto levantando ou abaixando a platina e
levantando ou abaixando o tubo do microscpio, ao qual esto atarraxados a ocular e as
objetivas. Os raios luminosos aqui so defletidos e convergem para o objeto. Ento passam
atravs das lentes da ocular e so novamente defletidos. Emergindo da ocular, os raios
luminosos so dirigidos para a pupila do olho, aps o que eles incidem sobre a retina. Se o olho
est em repouso, como na viso a longa distncia, deve-se obter uma clara imagem do objeto
quando a objetiva estiver no foco exato. A posio das lentes do microscpio em relao ao
objeto pode ser mudada ajustando os focos fino e grosso. A focalizao grossa produz

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movimentos amplos, enquanto que a fina um mecanismo delicado que se faz com pequenos
movimentos (pequenos e grandes aumentos).
Um microscpio ptico composto , assim, um sistema de aumento em dois estgios.
Primeiro o objeto aumentado pelas lentes da objetiva e depois novamente pelo segundo
conjunto de lentes da ocular. O aumento total o produto dos aumentos da objetiva pelo da
ocular. Um microscpio composto produz uma imagem de cabea para baixo e invertida
lateralmente. A inverso facilmente demonstrada: se o espcime movido para um lado, a
imagem move-se no sentido contrrio.

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