Claves para Conseguir

CaraCterizaCiones
de pptidos ptimas:
Una gua prctica de mapa de pptidos
introduCCin
Mapa de pptidos, una herramienta inestimable para compuestos
biofarmacuticos, es un mtodo muy potente adems de la prueba de
identidad ms utilizada para protenas, especialmente las que se producen
por medios recombinantes. Por lo general, incluye la digestin enzimtica
(normalmente con el uso de tripsina) de una protena para producir
fragmentos de pptidos, seguida por la separacin e identificacin de los
fragmentos en una forma reproducible; esto permite la deteccin y control
de cambios de aminocidos individuales, oxidacin, deamidacin y otros
productos de degradacin. Tambin permite la deteccin directa de
variantes comunes de anticuerpo monoclonal como la ciclizacin
N-terminal, el procesamiento de lisina C-terminal y la N-glicosilacin,
as como otras modificaciones post-traslacionales.
Un mapa de pptidos es una identificacin de una protena, as como el
producto final de varios procesos que proporcionan una comprensin
completa de la protena que se analiza. Incluye cuatro pasos principales:
aislamiento y purificacin de la protena; divisin selectiva de los enlaces
de pptidos; separacin cromatogrfica de los pptidos y anlisis validado
de los pptidos.
El mapa de pptidos se considera un procedimiento comparativo que
confirma la estructura primaria de la protena y detecta alteraciones en
su estructura. De forma adicional, muestra consistencia en el proceso y
estabilidad gentica. Un mapa de pptidos debe incluir la identificacin
positiva de la protena, maximizar la cobertura de la secuencia de pptidos
completa y proporcionar informacin adicional, as como la identificacin
de la secuencia ms all de la que se obtiene al nivel de protena no
digerida.
La seleccin de una tcnica cromatogrfica para separar pptidos y
generar mapas de pptidos depende de la protena, de los objetivos
experimentales y del resultado previsto. Sin embargo, la excelente
potencia resolutiva de la cromatografa de fase reversa (RPC) hace que
esta sea la tcnica de HPLC predominante para separaciones de mapa
de pptidos. Tambin resulta ideal para separaciones analticas y de
preparacin, debido a la disponibilidad de eluyentes de fase mvil voltil.
Es importante tener en cuenta que las columnas preferidas para las
separaciones de mapa de pptidos son similares a las que se usan para
molculas pequeas; sin embargo, debido a que las separaciones de
mapa de pptidos se realizan con un pH bajo y una temperatura elevada,
se utilizan de forma rutinaria columnas con una estabilidad de pH
excelente y efectos de silanoles mnimos.
Es necesaria una inspeccin cuidadosa de la estrategia de caracterizacin
completa para generar mapas de pptidos correctos. Un perfil puede
consistir en unos 100 picos que representan pptidos individuales y sus
derivados; debido a ello, requiere conocimiento de mtodos de preparacin
de muestras, tcnicas de separacin potentes y protocolos validados.
La capacidad y la informacin necesarias para desarrollar un mapa de
pptidos correcto le ayudar a conseguir la mejor separacin posible de
sus digestos proteolticos, as como a conseguir un resultado de
caracterizacin de pptidos correcto y fiable.
El objetivo de esta gua prctica de mapa de pptidos es destacar las
reas que son importantes para generar mapas de pptidos mediante
cromatografa de fase reversa, compartir algunas de las tcnicas
fundamentales que se usan en procedimientos de mapa de pptidos y
subrayar consideraciones para la optimizacin de sus separaciones de
mapa de pptidos, con el fin de conseguir los mejores resultados posibles.
2
Digestin de protenas:
Preparacin de protena para mejorar
la separacin de mapa de pptidos
Para garantizar una digestin completa y satisfactoria, as como para opciones a tener en cuenta para la optimizacin de la digestin, deben
proporcionar un alto grado de seguridad en la estrategia elegida, resulta seguirse algunos enfoques comunes. Los cinco pasos que se siguen para
til tener un buen conocimiento de los pasos de la digestin de una la digestin de protenas, resumidos en la Tabla 1, son (1) preparacin de
protena antes del anlisis. Con frecuencia, el mtodo de digestin muestra (2) seleccin de agentes de divisin (3) alquilacin/reduccin (4)
requiere su propia serie de protocolos de desarrollo para proporcionar una proceso de digestin (5) enriquecimiento/limpieza.
muestra adecuada y estable para la inyeccin LC. Aunque hay muchas

Tabla 1
Cinco pasos para la digestin de protenas
procedimiento
1. Preparacin de muestras
2. Seleccin de agente de divisin
3. Reduccin y alquilacin
4. Proceso de digestin
5. Enriquecimiento/limpieza
efecto previsto
Preparacin de la muestra para digestin
Requisito de divisin especfico
La reduccin reduce los enlaces de disulfuro
La Alquilacin inhibe los grupos SH
Divisin de protenas
Preparacin de muestra para anlisis de LC o LC/MS
experimento general
Reduccin, enriquecimiento, dilisis, desalinizacin
Ninguno
Reduccin: DTT, 45 min, 60 C
Alquilacin: IAM, 1 h, con oscuridad
Digestin: pH 8, 37 C, durante la noche
Atenuacin: adicin de TFA
Puntas de C18, concentracin, dilisis, columnas de afinidad

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3
Paso 1: preparacin de muestras
En funcin del tamao o de la configuracin de la protena, existen
diferentes enfoques para el pretratamiento se su muestra.
En determinadas condiciones, puede ser necesario enriquecer la muestra
o separar la protena de las sustancias aadidas y los estabilizadores que
se usan en la formulacin del producto; esto es as especialmente si
interfieren con el procedimiento del mapa. Existen muchos mtodos para
realizar estos procedimientos y cada protena tiene su propia serie de
medidas o procesos de limpieza. Sin embargo, algunos de los enfoques
ms habituales que se usan para la limpieza de muestras antes de la
digestin incluyen reduccin/enriquecimiento, dilisis y desalinizacin
mediante filtracin de gel.
Se han desarrollado estrategias de reduccin y enriquecimiento para
eliminar las protenas de alta abundancia o aislar protenas objetivo en
la muestra, respectivamente. La reduccin se usa ms a menudo en
aplicaciones de proteinmica para reducir la complejidad de muestras
biolgicas, como por ejemplo el suero, que contiene concentraciones
altas de albmina e inmunoglobulinas. Las columnas HPLC y los
cartuchos centrfugos del sistema de eliminacin por afinidad mltiple
(MARS, por sus siglas en ingls) de Agilent permiten la identificacin y
caracterizacin de protenas de alto valor y baja abundancia, as como de
biomarcadores que se encuentran en el suero, el plasma y otros fluidos
biolgicos. Se elimin ~94% de la masa proteica total mediante la
reduccin de 14 protenas de alta abundancia con MARS. El proceso de
reduccin es slido, fcil de automatizar y de gran eficacia.
MARS est disponible en una variedad de dimensiones de
columna de LC y en formatos de cartucho centrfugo. Entre las
protenas reducidas se incluye la albmina, IgG, antitripsina,
IgA, transferrina, haptoglobina, bringeno, macroglobulina
alfa2, glicoprotena cida alfa1, IgM, apolipoprotena Al,
apolipoprotena All, complemento C3 y transtiretina.
Las estrategias de reduccin utilizan tcnicas de inmunoafinidad
(como inmunoprecipitacin, coinmunoprecipitacin y cromatografa de
inmunoafinidad). De forma alternativa, las tcnicas de enriquecimiento
aslan las subclases de protenas celulares basadas en la actividad
bioqumica nica, las modificaciones post-traslacionales (PTM, por sus
siglas en ingls) o la localizacin espacial dentro de una clula. Las
modificaciones posteriores a la aplicacin (como la fosforilacin y la
glicosilacin) pueden enriquecerse con el uso de ligandos de afinidad
como la cromatografa de afinidad de in metlico (IMAC, por sus siglas
en ingls) o lectinas inmovilizadas, respectivamente. Para introducir
compuestos qumicos de protenas nicos, otras tcnicas conllevan
la incorporacin metablica o enzimtica de aminocidos o PTM
modificados.
Ya sean simples o complejas, a menudo las muestras necesitan dilisis
o desalinizacin para garantizar que son compatibles y estn optimizadas
para la digestin. Por ejemplo, debido a que la espectrometra de masas
(MS, por sus siglas en ingls) mide iones cargados y sales (especialmente
sodio y sales de fosfato), deben retirarse antes de la MS para minimizar su
interferencia con la deteccin. Los productos de dilisis y desalinizacin
permiten el intercambio de tampones, la desalinizacin o la eliminacin
de molculas pequeas para evitar interferencias con los procesos
posteriores.
La dilisis es un procedimiento establecido para reducir la concentracin
de sal en las muestras. Requiere el llenado de una bolsa de dilisis
(envoltura de membrana de porosidad definida), anudar la bolsa y ponerla
en un bao con agua o tampn, donde la concentracin de sal se equilibrar
mediante difusin. Las molculas ms grandes que no pueden difundirse
en la bolsa permanecen en ella. Si el bao es de agua, la concentracin
de las molculas pequeas en la bolsa disminuir lentamente hasta que
la concentracin dentro y fuera sea la misma. Una vez completado
el equilibrado, la bolsa se rompe y la solucin se vierte en un recipiente de
recogida. La dilisis se puede usar para volmenes de varios litros, pero no
resulta prctica para volmenes de muestra grandes, ya que pueden
necesitarse varios das para completar la eliminacin de sales.
Para desalinizar muestras antes de la digestin, la filtracin por gel
(GF, por sus siglas en ingls) es el procedimiento de laboratorio ms
prctico. Este mtodo es una tcnica de cromatografa de no absorcin
que separa molculas en funcin del tamao molecular. La desalinizacin
se usa para eliminar por completo o para reducir la concentracin de sal u
otros componentes de bajo peso molecular en la muestra, mientras que el
intercambio de tampones sustituye el tampn de muestra por un nuevo
tampn.
4
 Las columnas Bio SEC de Agilent pueden
clasicar ecazmente (por tamao)
y desalinizar mezclas de protenas antes
de las aplicaciones de mapa de pptidos.

La filtracin en gel es uno de los mtodos de cromatografa ms sencillos
de realizar; esto se debe a que las muestras se procesan mediante una
elucin isocrtica. En su forma analtica, la filtracin en gel (tambin
conocida como cromatografa de exclusin por tamao) puede distinguir
entre molculas (como protenas) con pesos moleculares que no difieran
ms del doble. En estas aplicaciones, la diferencia de tamao entre
sustancias separadas es muy grande (por ejemplo, protenas frente a
sales). Se elige un medio de filtracin en gel que excluya por completo las
molculas de mayor tamao, mientras que se permite que las molculas
ms pequeas se difundan libremente en todos los espacios porosos.
La columna se equilibra con un tampn, que puede ser el mismo
o diferente al de la muestra. Despus de la aplicacin de la muestra a la
columna, se aade ms del tampn de columna (tampn de elucin) para
llevar las molculas de la muestra por la columna. Las molculas mayores
(que no pueden introducirse en los poros del medio) se eluyen de la
columna en primer lugar, seguidas por las molculas ms pequeas que se
difunden en los poros, volvindolas ms lentas en relacin a las molculas
mayores. Si el tampn de elucin es diferente de la muestra que se ha
aplicado, las molculas mayores se desplazan de las sales originales y se
eluyen en este nuevo tampn, que est completamente separado del
tampn de muestra original.

Filtros de unin baja de protenas Captiva

Independientemente de la preparacin de Filtros de pes Captiva
muestra que se est realizando, siempre es
buena idea filtrar la muestra con un filtro de dimetro (mm) tamao de poro (m) Certificacin Carcasa referencia
unin baja de protenas. 15 0,2 LC/MS Polipropileno 5190-5096
4 0,45 LC Polipropileno 5190-5095
Los filtros de PES Agilent proporcionan 4 0,2 LC/MS Polipropileno 5190-5094
uniones bajas de protenas superiores y
15 0,45 LC Polipropileno 5190-5097
consistentes para el filtrado relacionado con
25 0,2 LC/MS Polipropileno 5190-5098
protenas. Las membranas del filtro de PES
son una opcin mejor que las membranas 25 0,45 LC Polipropileno 5190-5099
de PVDF para la mayora de anlisis de LC.
La PES de Agilent tiene una compatibilidad
similar a los filtros de PVDF para disolventes
de LC comunes; tambin resulta superior
en trminos de unin de protenas
y limpieza. Descubra ms en
agilent.com/chem/filtration

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Paso 2: seleccin de agentes de divisin
Existen dos mtodos para la divisin de enlaces de pptidos: el qumico Tabla 2
y el enzimtico. La divisin qumica supone el uso de reactivos no
enzimticos nucleoflicos, como el bromuro de ciangeno (CNBr) para
dividir qumicamente la unin de pptidos en una regin especfica tipo de divisin
mientras que ha quedado demostrado que las enzimas proteolticas, como
la tripsina, son muy tiles para varias localizaciones de divisin especficas tipo de agente
divisin de divisin especificidad
de una zona. El mtodo y el agente de divisin dependern de la protena
Enzimtico Tripsina Lado C-terminal de Arg y Lis
en prueba y de las expectativas de resultados concretos del anlisis.
Pepsina No especfico
De forma adicional, el proceso de seleccin conlleva la exploracin
minuciosa de todo el proceso de mapa de pptidos, as como Quimotripsina Lado C-terminal de residuos hidrfobos
consideraciones para caracterizaciones relacionadas. El agente de divisin Glutamil Lado C-terminal de glu. y asp.
ms habitual que se utiliza para el mapa de pptidos es la tripsina, debido endopeptidasa
a su especificidad bien definida. La tripsina hidroliza solo los enlaces de Producto Bromuro de Lado C-terminal de Met
pptidos en los que el grupo carbonilo va seguido por una arginina (Arg) qumico ciangeno
o lisina (Lys). En la tabla 2 se muestran algunos agentes de divisin cido diluido Asp. y pro.
habituales y su especificidad. BNPS-escatol Trp

Paso 3: desnaturalizacin, reduccin y alquilacin

Para que la enzima proteoltica divida eficazmente las cadenas
de pptidos, la mayora de las muestras deben desnaturalizarse, reducirse
y alquilarse, con el uso de diversos reactivos. La desnaturalizacin y la
reduccin a menudo pueden realizarse de forma simultnea mediante una
combinacin de calor y un reactivo, como por ejemplo 1,4-ditiotreitol (DTT),
mercaptoetanol o tris(2-carboxietil)fosfina. El ms usado es el DTT, que es
un agente reductor potente que reduce los enlaces disulfuro y evita la
formacin inter e intramolecular de disulfuro entre cistenas en la protena.
Mediante la combinacin de desnaturalizacin y reduccin, puede evitarse
la renaturalizacin (que es un problema cuando solo se usa calor como
agente de desnaturalizacin) debida a la reduccin de enlaces disulfuro.
Despus de la desnaturalizacin y reduccin de protenas, la alquilacin de
cistena es necesaria para reducir ms an una posible renaturalizacin.
Los agentes ms utilizados para la alquilacin de muestras de protenas
antes de la digestin son la iodoacetamida (IAM) y el cido yodoactico
(IAA).
La figura 1 muestra un buen ejemplo de un mtodo de separacin
cromatogrfica de fase reversa, usado para evaluar la integridad de la
reduccin y alquilacin de un anticuerpo monoclonal antes de la digestin.

Figura 1: perl de reduccin/alquilacin mediante cromatografa de fase reversa

mAU 0,534

3,399
350
matriz roja/alqulica
300 Cadena pesada 2

250

200
Cadena ligera 2,759
Cadena pesada 1 Figura 1: separacin de fase reversa de un anticuerpo
3,287 monoclonal reducido y con grupos alquilo antes del
150
protocolo de digestin, con una columna de 2,1 x
0,464 50 mm Agilent 300SB-C8 de resolucin rpida y alta
100 denicin (RRHD, por sus siglas en ingls), n. de ref.
0,406
2,404 Agilent 857750-906. La separacin se realiz a
0,333 Fragmento de cadena
50 0,5 ml/min, a 75 C con agua (0,1% TFA)/ACN
0,229 2,956 4,462 4,855 (0,08%) en condiciones con multisegmento en un
LC Agilent 1290 Innity.
0
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 min

6
Paso 4: digestin
Como ya se ha mencionado, la tripsina es la peptidasa ms utilizada para
la digestin, debido a su especificidad bien definida. Ya que la tripsina es
una protena, puede digerirse a s misma en un proceso llamado autolisis.
No obstante, Ca++, presente de forma natural en la mayora de muestras,
se une en el bucle de unin de Ca++ en tripsina y evita la autolisis. Con la
tripsina modificada que se utiliza ahora en la mayora de laboratorios,
la autolisis se reduce adicionalmente y no suele suponer un mayor
problema.
La digestin trptica se realiza con un pH ptimo en el rango 7,5 8,5 y
habitualmente a 37 C. Para proporcionar un pH ptimo para la divisin
enzimtica, se aade un tampn, normalmente 50 mM de bicarbonato de
amonio de trietilo (tABC), o 12,5 mM de bicarbonato de amonio (ABC)
antes de la adicin de tripsina. Un tampn de 2-amino-2-hidroximetil
propano-1,3-diol (Tris) tambin se puede usar para este fin, pero se debe
tener en cuenta que el tampn de Tris no es compatible con el anlisis
de MS, como MALDI y ESI-MS; por tanto, deber reducirse mediante
extraccin de fase slida (SPE, por sus siglas en ingls) o ZipTips. Para
garantizar una cantidad suficiente (pero no demasiado alta) de enzima
en la realizacin de la digestin, es imprescindible tener la relacin
enzima-protena correcta.
Las protenas pueden actuar de forma diferente en diferentes entornos;
cuando se digieren protenas modelo en una mezcla, se observan
digestiones menos eficaces que cuando se digieren de forma separada.
Una razn que explica este hecho puede ser la competicin creciente por
zonas de divisin de tripsina, cuando se digieren ms protenas juntas.
De forma adicional, puede haber muchos factores y parmetros
condicionales que afecten a la integridad y eficacia de la digestin de
protenas, produciendo una variedad de resultados previstos. Si estos
factores se comprenden o controlan mejor, los resultados de la digestin
pueden mejorarse considerablemente. El pH de la reaccin, el tiempo de
digestin y la temperatura, as como la cantidad de agente de divisin
empleado, son fundamentales para la eficacia de la digestin.
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7
pH de digestin. En general, el pH de la mezcla de digestin est
empricamente determinado para garantizar la optimizacin del
rendimiento de un agente de divisin concreto. Por ejemplo, cuando se
usa bromuro de ciangeno como agente de divisin, es necesario un
entorno de acidez alta (p. ej., pH 2, cido frmico); no obstante, cuando
se usa tripsina como agente de divisin, resulta ptimo un entorno
ligeramente alcalino (pH 8). Como norma general, el pH del medio de
reaccin no debe modificar la integridad qumica de la protena durante
la digestin ni el proceso de la reaccin de fragmentacin.
tiempo y temperatura de digestin. El tiempo y la temperatura
desempean una funcin importante en una digestin ptima. Para
minimizar las reacciones qumicas, es adecuada (y recomendada)
una temperatura entre 25 C y 37 C para la mayora de digestiones de
protenas (p. ej., las digestiones de tripsina se realizan habitualmente a
37 C). No obstante, el tipo y tamao de protena determinar en ltima
instancia la temperatura de la reaccin debida a la desnaturalizacin
de protenas, a medida que la temperatura de la reaccin aumenta.
El tiempo de reaccin tambin es un factor a tener en cuenta en la
optimizacin del protocolo de digestin. Si hay una cantidad de muestra
suficiente disponible, se considerar la realizacin de un estudio
experimental para determinar el tiempo ptimo para obtener un mapa
reproducible, al mismo tiempo que se evita una digestin incompleta.
El tiempo de digestin vara de 2 h a 30 h, en funcin del tamao y tipo
de muestra, mientras que la reaccin se detiene mediante la adicin de
un cido, lo cual no interfiere en el mapa, o bien mediante congelacin.
Concentracin de enzima de divisin. La concentracin del agente de
divisin debe minimizarse para evitar su contribucin a los patrones de
mapas. Con frecuencia se utiliza una cantidad excesiva de agente de
divisin para lograr un tiempo de digestin razonablemente rpido
(es decir, de 6 a 20 horas); sin embargo, debe tenerse mucho cuidado
con este aumento en las cantidades. Por lo general se usa una relacin
protena-peptidasa entre 10:1 y 200:1, y se recomienda que el agente
de divisin de aada en dos o ms fases para optimizar la divisin.
La tripsina se aade de esta forma en muchos procedimientos estndar
de digestin de tripsina. Sin embargo, el volumen de reaccin final
permanece lo suficientemente pequeo para facilitar la separacin,
que es el siguiente paso en el mapa de pptidos. Para resolver los
artefactos de digestin que podran interferir con el anlisis posterior,
se realiza una determinacin en blanco; para ello se usa un control de
digestin con todos los reactivos, excepto la protena de prueba.
El mtodo de digestin de tripsina que se describe a continuacin, resumido en las figuras 2 y 3, es un procedimiento comn que se utiliza de forma
rutinaria para la reduccin, alquilacin, digestin en solucin y limpieza de protena (0,5 mg). Este procedimiento es escalable para pequeas cantidades
de protenas y, adems, proporciona una lista til de reactivos Agilent y nmeros de referencia.

Figura 2: procedimiento de digestin de tripsina (partes i-v)

0,5 mg de protena aadir 4,0 l de solucin aadir 1,0 l de solucin
25 l de solucin madre de bicarbonato madre de iam madre de dtt
de amonio
25 l de tFe
1,0 l de solucin
madre de dtt

1. Resuspender, desnaturalizar y reducir protena. 2. Alquilato. 3. IAM de exceso de atenuacin.

(Vrtex; calentar 1 h a 60C o 20 min a 90 C) Realizar con oscuridad. Realizar con oscuridad.
(1 h a temp. ambiente) (1 h a temp. ambiente)

aadir 300 l de agua + 100 l de aadir solucin madre aadir 1 l de cido

solucin madre de bicarbonato de amonio de tripsina frmico o tFa

4. Diluir y ajustar pH. 5. Digestin. 6. Reducir pH a <4.

(pH 7 9) (37 C durante 4 18 horas)

Figura 3: cronograma esperado del procedimiento de digestin

permitir que transcurran 3,5 horas seguidas para estos pasos

resuspender, alquilato atenuacin digerir

desnaturalizar, 60 min 60 min 4 18 horas
reducir
60 min diluir
Ajustar pH
10 min

8
preparacin de solucin de reduccin, alquilacin y digestin: Resumen
100 mm de bicarbonato de amonio: aadir 100 ml de agua a 0,7906 g de bicarbonato de amonio. Almacenar en un refrigerador a 4 C hasta 2 meses.

solucin madre de tripsina: Se puede adquirir tripsina modificada: Tripsina de calidad protemica de Agilent (n. de ref.; 204310, consulte en la siguiente
pgina "Reactivos y equipo"). Est liofilizada y puede almacenarse bajo esta forma a -20 C durante ms de un ao sin que haya una prdida significativa
de actividad. Cuando sea necesario, debe prepararse solucin madre de tripsina mediante la hidratacin de tripsina liofilizada en 100 l de 50 mM de cido
actico hasta obtener una concentracin final de 1 g/ml. Para minimizar los ciclos de congelacin-descongelacin y aumentar la estabilidad de
almacenamiento, debe dividirse la tripsina hidratada en cuatro tubos separados de ~10 l cada uno. Debe almacenarse cada muestra exacta a -20 C en
un congelador sin No Frost. Esta solucin de 1 g/l se utiliza para preparar la solucin intermedia de tripsina segn sea necesario (lase ms abajo).
Tenga en cuenta que la tripsina de calidad protemica de Agilent incluye documentacin tcnica que proporciona un protocolo alternativo para la digestin
trptica. Hemos utilizado el mtodo que aparece a continuacin y hemos concluido que es sencillo y fiable.

dtt 200 mm: aadir 1 ml de agua a 0,031 g de DTT en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Vrtex. Dividir la solucin de DTT en muestras alcuotas segn
convenga (por ejemplo, 100 l) en tubos de microcentrifugadora. Almacenar cada muestra exacta a -20 C hasta un mes en un congelador sin No Frost.
No descongelar y volver a congelar.

200 mm de iam (preparar justo antes de su uso): aadir 1 ml de agua a 0,037 g de IAM en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Vrtex.

protocolo de digestin de tripsina

resuspensin, desnaturalizacin y reduccin de protena digestin
1. Aadir 0,5 mg de protena total a un tubo Eppendorf de 0,5 ml. 1. Elaborar nueva solucin madre de tripsina en solucin de almacenamiento de tripsina.
2. Aadir 25 l de solucin madre de bicarbonato de amonio. Dejar pasar 15 min para una resuspensin completa.

3. Aadir 25 l de agente de desnaturalizacin de TFE. 2. Si desea digerir menos de 20 g de protena total, preparar solucin intermedia de
tripsina diluyendo solucin madre 10 veces mayor con la adicin de 45 l de agua
4. Aadir 1,0 l de solucin madre de DTT. ultrapura. Esta solucin de 100 ng/l puede almacenarse a -20 C durante 2 meses sin
5. Vrtex para mezclar. prdida de actividad significativa.
advertenCia: Si el IAM no se destruye, empezar a aadir grupos de alquilos lisinas lentamente.
6. Calentar bajo una de las series de condiciones para desnaturalizar:
60 C entre 45 minutos y 1 hora 3. Aadir solucin madre de tripsina entre 1:20 y 1:50 segn masa de
90 C entre 20 minutos (protenas hidroflicas) y 1 hora (protenas enzima:sustrato. Por ejemplo, para 500 g de protena, aadir entre 10 y 25 g
hidrfobas) de tripsina (entre 10 y 25 l de solucin madre de tripsina).

7. Enfriar a temperatura ambiente. 4. Vrtex, brevemente.

5. Colocar el tubo en el calentador e incubar a 37 C entre 4 y 18 horas.
alquilacin
6. Enfriar solucin.
1. Aadir 4,0 l de solucin madre de IAM.
2. Vrtex, brevemente.
disminucin del pH para interrumpir la actividad de tripsina

3. Incubar muestra con oscuridad (gradilla cubierta con lmina) a temperatura 1. Aadir 1 l de de cido frmico limpio o TFA para reducir el pH y detener la
ambiente durante 1 hora. actividad de tripsina.
Si hay que desalinizar, usar TFA ya que ayuda en la unin de pptidos a la
atenuacin de exceso de iam resina durante la limpieza.
1. Aadir 1,0 l de solucin madre de DTT para destruir el exceso de IAM. 2. Vrtex, brevemente.
2. Dejar durante 1 hora con oscuridad (gradilla cubierta con lmina) 3. Si el pH de la muestra original es algo a tener especialmente en cuenta,
a temperatura ambiente. comprobar el pH (normalmente entre 3,0 y 3,3). Aadir ms cido si el pH es
dilucin y ajuste de pH superior a 4.

1. Aadir 300 l de agua para diluir el desnaturalizante. limpieza de digestin

2. Aadir 100 l de solucin madre de bicarbonato de amonio para elevar el pH.
3. De forma opcional, comprobar el pH poniendo entre 0,5 y 1 l en una tira de
papel indicador de pH. El valor normal est entre 7,5 y 8,0. Es ms importante
comprobar el pH cuando el pH de la muestra inicial es desconocido.
1. En funcin del origen de la muestra, puede que sea necesario desalinizar
antes del anlisis de MS.
2. Si no es necesaria la desalinizacin, pero la muestra se muestra opaca, filtrar la muestra
antes del MS. Usar filtros centrfugos Agilent, n. de ref. 5185-5990.

4. Aadir ms base (bicarbonato de amonio) si el pH no se encuentra en el La opacidad puede deberse a restos celulares en la muestra.
rango entre 7 y 9. 3. Diluir una muestra exacta segn sea necesario para el anlisis.
Si la protena tiene un peso molecular de 50 kDa y si la digestin lleg a
completarse, la solucin es de unos 20 pmol/l.
Si la muestra es menos compleja, diluir hasta conseguir una solucin de
50 fmol/l.

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Paso 5: limpieza y enriquecimiento de digestos
Antes del mapa de pptidos, la limpieza y/o enriquecimiento es a menudo
necesaria para un anlisis satisfactorio de mapas de pptidos. Existen muchos
tipos de mtodos para conseguir la limpieza y el enriquecimiento, en funcin del
tipo de muestra y del objetivo en cuestin. Por ejemplo, el enriquecimiento de PTM
especficos (p. ej., fosforilacin, ubicuitinacin y glicosilacin) se realiza mediante
purificacin de afinidad con el uso de anticuerpos o ligandos especficos de PTM,
mientras que los fosfopptidos pueden enriquecerse mediante IP con el uso de
anticuerpos anti-fosfo-especficos, o bien mediante despliegue con el uso de TiO2,
que une selectivamente la serina, tirosina o treonina fosforilada.
Despus del enriquecimiento de pptidos, las sales y los tampones
pueden eliminarse con el uso de puntas o columnas de grafito o C-18;
los detergentes de pueden eliminar mediante el uso de columnas de afinidad o
reactivos de precipitacin de detergente. La dilucin de muestras tambin puede
concentrarse con el uso de concentradores de rangos de corte de peso molecular
variable (MWCO, por sus siglas en ingls). Una vez purificadas, las muestras de
pptidos estn listas para la preparacin final del anlisis de MS, que vara segn el
tipo de anlisis. Para anlisis de LC/MS o LC-MS/MS, es necesaria una eleccin
adecuada de fases mviles y reactivos de emparejamiento inico para lograr una
buena resolucin de LC y unos buenos resultados analticos. La MALDI-MS requiere
la combinacin de la muestra de pptidos con matrices especficas (molculas de
colorante de absorcin de energa cristalina), que a continuacin se secan en placas
de MALDI antes del anlisis.

reactivos y equipo
elemento necesario ejemplo
Bicarbonato de amonio, de pureza analtica Catlogo de Sigma n. A-6141
Ditiotreitol (DTT), >+99% Catlogo de Sigma n. D-5545
Iodoacetamida (IAM), 97% Catlogo de Sigma-Aldrich n. I-670-9
Trifluoroetanol (TFE), +99% Catlogo de Sigma-Aldrich n. T63002-100G
Tripsina, modificada Tripsina de calidad protemica de Agilent (n. de ref. 204310)
Agua, 18 megaohmios o equivalente N. de ref. Agilent 8500-2236
cido frmico, pureza analtica o cido trifluoroactico, N. de ref. Agilent G2453-85060
grado de secuenciacin
Tubos de microcentrifugadora con cierre de seguridad N. de ref. Eppendorf 022363611 (0,5 ml, caja de 500) o n. de ref. 022363204 (1,5 ml, caja de 500)
Eppendorf
Micropipetas y puntas: rango de 1 1000 l
Calentador/sellador de tubos Agitador calentador Eppendorf
Tiras indicadoras del pH, rangos de pH 2,5 4,5 Tiras Science ColorpHast de EM, catlogo n. 700181-2
y 7,0 9,0
Balanza analtica
Puntas Bond Elut OMIX, 10 l (volumen de elucin Puntas de 1 x 96 (n. de ref. Agilent A5700310); Puntas de 6 x 96 (n. de ref. Agilent A5700310K)
2 10 l)
Puntas Bond Elut OMIX, 100 l (volumen de elucin Puntas de 1 x 96 (n. de ref. Agilent A57003100); puntas de 6 x 96 (n. de ref. Agilent A57003100K)
10 100 l)

10
 para la limpieza de volmenes ms pequeos de pptidos:
Puntas Bond Elut OMIX
mtodo de Bond elut omiX (volumen 10 l) para limpieza de digesto de pptidos
pretratamiento de Ajustar la muestra a una concentracin de cido trifluoroactico (TFA) de 0,5% 1,0% con el uso de una solucin de TFA de 2,5%
muestra
acondicionamiento Aspirar 10 l de acetonitrilo al 50% (ACN): introducir agua y descartar el disolvente. Repetir. Aspirar 10 l de solucin de TFA al 1,0% y
y equilibrado descartar el disolvente. Repetir.
aplicacin de Aspirar hasta 10 l de muestra pretratada en punta OMIX. Dispensar y aspirar la muestra 3 5 ciclos para obtener la mxima eficacia.
muestra Pueden usarse hasta 10 ciclos para mejorar la unin.
enjuagar Aspirar 10 l de tampn de TFA al 0,1% y descartar el disolvente. Repetir.
elucin Anlisis de LC/MS o LC/MS/MS: aspirar 2 10 l de cido frmico o cido actico al 0,1% en 50 75% de acetonitrilo o 50 75% de
solucin de metanol y dispensar en un vial de inyector automtico o placa de pocillos.

Para obtener los mejores resultados, ajustar la pipeta para que coincida con el volumen de punta (10 l) para los pasos de equilibrado, aplicacin de
muestra y enjuague. Para la elucin, tomar una muestra del volumen exacto de solucin de elucin en un contenedor separado y mantener la pipeta
en el ajuste mximo de volumen para que coincida con el volumen de punta, 10 l.

para aplicaciones de pptidos de alto rendimiento:

Soluciones de preparacin de muestras automatizada
para mapa de pptidos
"El uso de la combinacin de una digestin
extremadamente consistente junto con la
limpieza automatizada de fase reversa con
AssayMAP, nos ha permitido contemplar
estudios de colaboracin de magnitud y
resultados nunca antes vistos".
Dr. Jacob D. Jaffe
Director Adjunto, Plataforma de
protemica

Obtenga ms informacin sobre la preparacin de muestras automatizada para mapa de pptidos en la pgina 22.

Descubra ms acerca de las columnas Agilent para mapa de pptidos en agilent.com/chem/advancebio

11
Cromatografa de fase reversa:
la mejor eleccin para mapas
de pptidos
La seleccin de una columna y un mtodo para generar mapas de pptidos depende, en ltima instancia, de la asignacin de la
protena y de los objetivos del flujo de trabajo. El mtodo de columna de mapa de pptidos ms utilizado, especialmente en la
industria biofarmacutica, es la cromatografa de fase reversa (RPC). La excelente potencia resolutiva y el uso de fases mviles
voltiles (compatibles con espectrometra de masas) han llevado a esta tcnica a convertirse en el mtodo de HPLC
predominante para la mayora de separaciones de pptidos. Es superior a otros modos de separaciones de HPLC con respecto a
la velocidad y la eficacia. En la figura 4 se muestra una separacin de pptidos bien resuelta con el uso de albmina de suero
bovino; donde se demuestra la multitud de fragmentos de pico de pptidos que pueden resolverse mediante el uso de RPC para
mapa de pptidos.

Figura 4: separacin de mapa de pptidos de fase reversa

mAU

70

60
Absorbancia de UV

50

40

30

20

10

0 Figura 4: separacin de fase reversa de BSA con

una columna de 2,0 x 150 mm Agilent Polaris
0 2,5 5 7,5 10 12,5 15 17,5 20 min C18-A (n. de ref. Agilent A2001150X020).

12
Requisitos para una correcta
separacin de mapa de pptidos
El enfoque general en el desarrollo de un mtodo de RPC prctico para
mapa de pptidos requiere una buena comprensin de los requisitos
de columna especficos de pptidos y del desarrollo de mtodos
cromatogrficos. Aunque muchos de los mismos principios
cromatogrficos se aplican a la separacin de pptidos, en comparacin
con separaciones de molculas pequeas, hay algunas variables
especficas de la condicin para la optimizacin del mtodo de pptidos,
seleccin de columnas
El aspecto ms importante para conseguir una separacin de mapa de
pptidos fiable y bien resuelta es la seleccin de una columna adecuada.
El tamao de poro de columna, el tipo y tamao de partcula y la qumica y
estabilidad de fase ligada (qumica y lecho compacto) tienen una funcin
importante en la facilitacin de la separacin de mapa de pptidos,
la estrategia de optimizacin y el anlisis espectromtrico. Para
separaciones de pptidos, los tamaos de poro de columna preferidos
se sitan entre 100 y 120, mientras que la seleccin de fase ptima
es normalmente C18. Aunque algunas columnas comerciales ofrecen
tamaos de poro para pptidos de hasta 60, estos estn normalmente
relacionados con separaciones de fragmentos de pptidos ms pequeos
o anlisis de patrones. Del mismo modo, se usan longitudes de cadena de
carbono de fase ligada ms pequeas; sin embargo, estas tienen relacin
con mtodos especficos y su funcionalidad es limitada para conseguir
retencin a lo largo de la amplia variedad de hidrofobicidad de pptidos.
Descubra ms acerca de las columnas Agilent para mapa de pptidos en agilent.com/chem/advancebio
as como para conseguir una separacin reproducible y slida.
La seleccin de columna, la calidad de columna, la seleccin de fase mvil
y los requisitos de deteccin son todos componentes importantes en las
separaciones de mapa de pptidos; estos componentes pueden mejorar
considerablemente la calidad de sus mapas de pptidos.
Las separaciones de pptidos producen nmeros de placa ms pequeos
debido a sus coeficientes de difusin ms altos; tambin han favorecido el
uso de materiales de columna totalmente porosos de menor dimetro con
flujos ms lentos. Esto ha generado un aumento en los envases por debajo
de 2 m para obtener mapas de pptidos ms eficaces. Sin embargo, ms
recientemente, las columnas superficialmente porosas han ganado
popularidad para las separaciones biolgicas (especialmente en la
industria biofarmacutica), ya que resuelven las limitaciones de la difusin
de masa de protenas y pptidos. Estas columnas ofrecen una ruta de
difusin ms corta que permite las separaciones de molculas mayores a
velocidades lineales altas, sin los aumentos de contrapresin del sistema
asociados con las partculas ms pequeas. En la figura 5 se muestra el
ejemplo de un mapa de pptidos de resolucin alta rpida, con el uso de
una columna superficialmente porosa.
13
Figura 5: secuencia de mapa de pptidos de alta resolucin rpida y ecaz de albmina de
suero bovino (Bsa, por sus siglas en ingls)
mAU

70

60

50

40

30

20

10

0 2,5 5 7,5 10 12,5 15 17,5 20 min

Figura 5: separacin de fase reversa de BSA con una columna de 2,1 x 150 mm de mapa de pptidos Agilent AdvanceBio (n. de ref. Agilent 653750-902).
La separacin de mapa de pptidos se realiz a 0,3 ml/min, a 40 C con gradiente lineal de agua (0,1% TFA)/ACN (0,08%).

La calidad de columna (reproducibilidad y estabilidad de un anlisis a otro) es un requisito esencial, que a veces se pasa por alto, para mantener
separaciones de mapa de pptidos reproducibles y slidas. La separaciones de fase reversa de pptidos se realizan generalmente con pH bajo (pH<3)
y a temperaturas elevadas (>40 C). Los mapas de pptidos requieren una operacin repetible para obtener identificaciones de mapa precisas, as como
protocolos de validacin repetidos. Al elegir una columna para mapa de pptidos, la calidad de la columna debe ser lo primero a tener en cuenta en la
decisin. En la figura 6 se muestra un ejemplo excelente de mapa de pptidos reproducible de un digesto trptico de anticuerpo monoclonal, separado en
condiciones de pH bajo y temperatura elevada, durante un anlisis de LC/MS.

Figura 6: reproducibilidad de mapa de pptidos durante anlisis de lC/ms

mAU
anlisis 2

550

anlisis 4
500

450 anlisis 6

400
anlisis 8

350

anlisis 10 Figura 6: cinco inyecciones repetidas de un digesto trptico de

anticuerpo monoclonal con una columna de mapa de pptidos de
300 3,0 x 150 mm Agilent AdvanceBio (n. de ref. Agilent 653950-302)
en un sistema LC Agilent 1200 combinado con un 6520 Q-TOF.
La separacin se realiz a 0,3 ml/min, a 40 C con gradiente de
2 4 6 8 10 12 min
agua (0,1% FA)/ACN (0,1% FA).

14
seleccin de fase mvil
El disolvente usado con ms frecuencia en el mapa de pptidos es agua
con acetonitrilo como modificador orgnico, para el que no se recomienda
ms del 0,1% de agente de emparejamiento inico. En determinadas
circunstancias, puede aadirse alcohol proplico o alcohol isoproplico para
solubilizar los componentes de digesto, teniendo en cuenta que la adicin
no aumenta excesivamente la viscosidad de los componentes. Las fases
mviles con una solucin tampn que contienen fosfato se usan para dar
algo de flexibilidad a la seleccin de condiciones de pH; esto se debe a
que los cambios de pH en el rango 3,0 5,0 aumentan la separacin de
pptidos que contienen residuos cidos (p. ej., cidos glutmicos y
asprticos). Los fosfatos de sodio o potasio, el acetato de amonio y el
cido fosfrico con un pH entre 2 y 7 (o mayor en el caso de soportes
basados en polmeros) se han usado tambin con gradientes de
acetonitrilo. El acetonitrilo que contiene cido trifluoroactico se usa con
mucha frecuencia.
deteccin
La deteccin de pptidos es normalmente de entre 210 nm y 220 nm y/o
280 nm (figura 7). La deteccin a 280 nm se realiza a menudo en paralelo
con la deteccin a 210 nm en mapas de pptidos. El triptfano, la tirosina y
la fenilalanina son sensibles a 280 nm, mientras que la deteccin a 210 nm
es relativamente poco selectiva para muchas otras sustancias biolgicas
en la matriz de muestra. No obstante, la sensibilidad a 210 nm y 220 nm es
entre dos y cuatro veces mayor que a 280 nm. De forma adicional, tiene
cierta importancia para el perfil de deteccin de mapas de pptidos la
Figura 7: mapa de pptidos con diferentes longitudes de onda
mAU
50
40
30
20
10
0
0
4 10 20 30 40
3
2
1 Figura 7: columna de mapa de pptidos AdvanceBio
0 caracterizacin de digesto de e.coli con 220 nm
-1
0 10 20 30 40
Descubra ms acerca de las columnas Agilent para mapa de pptidos en agilent.com/chem/advancebio
15
Las fases mviles que se emplean en la cromatografa de fase reversa
(RPC, por sus siglas en ingls) para el anlisis de protenas y pptidos
contienen un aditivo que sirve como agente de emparejamiento inico.
Este componente aumenta la hidrofobicidad de pptidos mediante la
formacin de emparejamientos inicos con sus grupos cargados. Como
consecuencia, la interaccin de los pptidos con la fase estacionaria
hidrfoba es posible y, por tanto, tambin lo es su separacin mejorada
mediante un aumento de retencin. Otros aditivos habituales, como el
cido trifluoroactico (TFA), el cido frmico (FA) y el cido actico (AcOH)
pueden dar lugar a pH muy bajos y promover el despliegue y la
desnaturalizacin de protenas. De este modo las molculas, como los
pptidos, se eluyen en bandas ms pronunciadas y ms simtricas. El
agente de emparejamiento inico ms usado para la separacin de
protenas y pptidos es el TFA, tanto por su compatibilidad (volatilidad alta)
con espectrometra de masas como por la afinidad del pptido cargado.
mezcla de 0,1% de TFA en agua (disolvente A) y 0,08% de TFA (disolvente
B) en ACN, que se usa para minimizar la deriva inicial provocada por
cambios en la absorbancia durante el curso del gradiente de elucin. En la
figura 7 se muestra una comparacin de ejemplo de una separacin de
mapa de pptidos con variacin de longitud de onda entre 220 nm y 280
nm; se muestran en detalle las diferencia en los perfiles de sensibilidad de
absorbancia y de pico de UV.
220 nm
50 min
280 nm
(n. de ref. Agilent 651750-902), 2,1 x 250 mm,
(superior) y 280 nm (inferior) en un LC Agilent 1290
Innity.
50 min
Desarrollo de un mtodo de
mapa de pptidos ecaz
El enfoque general para el desarrollo de un mtodo de RPC para una
separacin de mapa de pptidos es el mismo que se emplea con las
prcticas de desarrollo tpicas del mtodo de fase reversa; sin embargo,
existen requisitos especiales y especficos del desarrollo de mapa de
pptidos. En esta seccin se proporcionar un enfoque bsico
recomendado para la preparacin de un mapa de pptidos bien resuelto
(1) optimizacin de las condiciones de gradiente
Siempre se recomienda especialmente un gradiente de tampn de ACN de
pH bajo para la separacin de pptidos, ya que:
Facilita la separacin de una gran variedad de tipos y estructuras de
pptidos.
Suprime la ionizacin de silanoles, que pueden provocar interacciones
no deseadas con cadenas laterales amino bsicas en la molcula, lo que
produce formas de pico insuficientes.
Ayuda a desnaturalizar el fragmento de pptidos mediante una mejora
en la retencin y la resolucin.
Permite una deteccin de UV baja (<210 nm) para maximizar la
sensibilidad de la deteccin.
Proporciona bandas ms estrechas debido a la viscosidad ms baja de la
fase mvil.
Aumenta la retencin de pptidos pequeos mal retenidos mediante
emparejamiento inico con aminocidos bsicos y aminoterminales
libres (cuando se usa TFA en el tampn).
16
mediante (1) optimizacin de las condiciones del gradiente para retencin,
(2) variables para el cambio de selectividad y (3) mayor optimizacin de las
condiciones de columna, con el fin de mejorar el equilibrio entre el tiempo
de anlisis y la resolucin. Debe tenerse siempre mucho cuidado en cada
paso de este proceso de desarrollo de mtodos con el tipo de muestra y
con el propsito previsto de su experimento de mapa de pptidos.
El propanol o el isopropanol (IPA) puede sustituirse por acetonitrilo (ACN)
como modificador orgnico, as se proporciona una mejor recuperacin de
pptidos hidrfobos. Sin embargo son ms viscosos, lo que produce una
mayor contrapresin de columna y bandas un poco ms anchas en
algunos casos. Estos disolventes tambin requieren una longitud de onda
ms alta para la deteccin (>220 nm) y presentan una prdida en la
sensibilidad de deteccin.
La mayora de pptidos se eluyen con menos del 60% de ACN, pero en
ocasiones es necesaria una concentracin de ACN ms alta. Un buen
punto de partida para un anlisis de desarrollo de mapa de pptidos es de
0 a 60% en 45 minutos (2%/min). Sin embargo, a menudo es necesario
un gradiente ms suave en el mtodo final para obtener la resolucin
deseada. La pendiente del gradiente, o el %B/min, determina la retencin
media (k') de una banda de muestra durante su migracin en una
columna. El valor de k' depende de las dimensiones de la columna, el flujo,
el peso de la muestra y la pendiente del gradiente.
(2) variables para el cambio de selectividad (a) del mapa de
pptidos
Los cromatografistas que trabajan con muestras biolgicas, por lo general, En la figura 8 se detalla una comparacin entre dos regiones de gradiente
posponen un cambio de las condiciones de columna (N) hasta que el idntico cuando se aumenta la temperatura de 30 C (cromatograma
espacio de bandas (a) ha mejorado. Los cambios en la temperatura y en la superior) a 60 C (cromatograma inferior) para un digesto trptico de
pendiente del gradiente resultan tiles (sin cambios en la fase mvil o mioglobina. A una temperatura elevada de 60 C, el perfil de separacin
columna) y deben explorarse en primer lugar para mejorar el espacio de detalla cambios en la forma de banda y en la posicin de pico que se
bandas (a) para la optimizacin de una separacin de mapa de pptidos. resalta mediante los picos 1 7. Es evidente que algunos de los cambios
destacados en esta regin del cromatograma son la separacin mejorada
entre los picos 1, 2 y 3 y las diferencias de posicionamiento de banda
Un cambio en la temperatura es un mtodo potente de cambiar
(selectividad) entre los picos 4 y 5.
la selectividad que podra provocar un cambio de retencin para residuos
peptdicos concretos. La elevacin de la temperatura de una separacin de
mapa de pptidos produce bandas ms estrechas, reduce la contrapresin
del sistema y cambia la selectividad. Se recomienda una temperatura
inicial de 30 35 C; sin embargo, la temperatura ptima para una
separacin de mapeo concreta depender de muchos factores segn
el tipo de digestin y la composicin. Algunos pptidos muy hidrfobos
requieren una temperatura de 60 80 C para una recuperacin mxima,
mientras que la selectividad para una muestra concreta ser a menudo
mejor para una temperatura concreta entre 30 y 60 C.

Figura 8: efecto de la temperatura sobre la selectividad para un digesto trptico de mioglobina

mAU 5
60

50
30 C 6, 7
334 bar 2
3
40
4
1
30

20

10

5 5,25 5,5 5,75 6 6,25 6,5 6,75 7 7,25 min

mAU
60
60 C 5
50
289 bar 6, 7
40 3
1 4
30

20 2

10

5 5,25 5,5 5,75 6 6,25 6,5 6,75 7 7,25 min

Figura 8: separacin de gradiente de digesto trptico de mioglobina a 5,0 8,0 min de un gradiente de 20 min
con una columna de mapa de pptidos AdvanceBio de 2,1 x 150 mm (n. de ref. Agilent 653950-302). Las dos
separaciones se completaron con un gradiente lineal de agua (1,0% TFA)/ACN (0,08% TFA), 0,3 ml/min con
215 nm en un sistema LC cuaternario bioinerte Agilent 1260 Innity. El cromatograma superior se separ a una
temperatura de 30 C y el cromatograma inferior se complet a una temperatura de 60 C.

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17
Los cambios en la pendiente del gradiente tambin pueden mejorar
considerablemente el espacio de bandas y cambiar la selectividad de la
separacin de mapa de pptidos. La pendiente del gradiente puede variar
de dos formas, ya sea manteniendo la velocidad de flujo constante y
cambiando el tiempo de elucin a tiempos de anlisis ms cortos
(aumentando la pendiente) o ms largos (disminuyendo la pendiente ),
o bien manteniendo el tiempo de anlisis constante y cambiando la
velocidad de flujo.
La figura 9 muestra los cambios de selectividad resultantes de la variacin
de la pendiente del gradiente. Con el uso de un digesto de pptido trptico
de mioglobina, un tiempo de anlisis de gradiente brusco de 15 minutos
(cromatograma superior) se compar con un tiempo de anlisis de
gradiente ms largo de 40 minutos (cromatograma inferior), mientras que
ambas separaciones se mantuvieron a una velocidad de 0,6 ml/min a
50 C. Una comparacin de los cromatogramas y la identificacin de los
mismos picos (asteriscos) en cada separacin, muestra numerosos
cambios en el espacio de bandas, las cuentas de picos y la forma de pico.

Figura 9: efecto de pendiente del gradiente durante una separacin de digesto trptico de
mioglobina
mAU
40 gradiente de 15 minutos
35 42 picos
30
25
20
15
10
5
0
-5
0 2 4 6 8 10 12 14 min

mAU
40 gradiente de 40 minutos
35
56 picos
30
Figura 9: separaciones de gradiente de digesto trptico
25 de mioglobina con una columna de mapa de pptidos de
20 2,1 x 150 mm AdvanceBio (n. de ref. Agilent 653950-302)
15 en un sistema LC cuaternario bioinerte Agilent 1260
10 Innity, con gradiente lineal de agua (1,0% TFA)/ACN
5 (0,08% TFA), 0,6 ml/min a 50 C. El cromatograma
0
superior se complet en 15 minutos, mientras que el
cromatograma inferior se complet en 40 minutos.
-5
Los asteriscos en cada cromatograma representan los
0 5 10 15 20 25 30 35 min mismos picos.

18
(3) ajustar las condiciones de columna para una mayor
optimizacin
Una vez se ha optimizado el gradiente en trminos de retencin (k') y
selectividad (a), son posibles ms mejoras en la separacin mediante la
variacin de la longitud de columna y de la velocidad de flujo. La eleccin
de la condicin de columna que se variar en la elucin del gradiente es,
fundamentalmente, la misma que para la separacin isocrtica. En ambos
casos, los valores ms altos de eficacia (N) pueden obtenerse a expensas
de tiempos de anlisis ms largos. Para las mejoras en la resolucin de
poca importancia, en las que es menos importante un aumento en el
tiempo de anlisis, es recomendable reducir la velocidad de flujo. Sin
embargo, cuando se necesita un aumento de resolucin mayor,
normalmente es preferible aumentar la longitud de la columna. Si la
resolucin es mayor de la necesaria despus de optimizar la selectividad,
esta resolucin excesiva puede cambiarse por un tiempo de anlisis ms
corto, mediante el aumento de la velocidad de flujo y/o la reduccin de la
longitud de columna. En la figura 10 se muestra un ejemplo de resolucin
de mapa de pptidos mejorada para un digesto trptico de mioglobina, con
una longitud de columna aumentada de 150 mm a 250 mm. En esta
comparacin, las condiciones y el tiempo del gradiente se mantuvieron
constantes mientras se aumentaba la longitud de columna de 150 mm
a 250 mm. Se aadi un recuadro rojo a las mismas reas de las
separaciones para indicar la mejora de resolucin gracias a los 250 mm
de longitud; as tambin se pusieron de manifiesto las ganancias en la
capacidad de picos por unidad temporal.
Se ha demostrado que la elucin del gradiente, las variables posteriores
asociadas en la optimizacin de la selectividad y las optimizaciones de
condicin de columna mencionadas en (1), (2) y (3) son estrategias
bsicas para mejorar cualquier estrategia de separacin, incluido el mapa
de pptidos. Los mtodos descritos anteriormente se describen mejor en
los pasos a continuacin:
pasos del desarrollo de mtodos de mapa
de pptidos
1. seleccionar las condiciones de gradiente iniciales: longitud de columna,
composicin de fase mvil, velocidad de flujo, temperatura y deteccin.
La separacin inicial debe optimizarse para la retencin (k). Esto requiere
un gradiente que no sea demasiado brusco.
2. ajustar el rango de gradiente. Esto se utiliza para minimizar el tiempo de
anlisis mediante la eliminacin del espacio desperdiciado al comienzo y
al final del cromatograma.
3. variar selectividad. Si se observan bandas solapadas o el tiempo de
ejecucin es demasiado elevado, pueden probarse las opciones
comentadas sobre ajustes de selectividad.
tener en cuenta la forma del gradiente. Puede lograrse un espacio de
4.
banda adicional mediante el uso de una forma de gradiente no lineal de
modo opcional; as se mejora an ms la separacin.
5. ajustar condiciones de columna. Cuando el espacio de bandas y la
selectividad se optimicen, debe considerarse la variacin del tiempo de
anlisis y/o de la longitud de columna; as se mejora la resolucin y/o
la velocidad del anlisis.

Figura 10: efecto de la longitud de columna en la resolucin

mAU
70
2,1 x 150 mm
60
50
40
30
20
10
0 Figura 10: efecto de la longitud de columna en la
mAU
0 5 10 15 20 25 min resolucin; comparacin de mapa de pptidos con
70 un digesto trptico de mioglobina (n. de ref. Agilent
2,1 x 250 mm 651750-902). Las reas resaltadas en rojo indican
60
reas equivalentes de separacin para mostrar
50
claramente la resolucin y la forma de pico.
40 Las separaciones se realizaron con una columna de
30 mapa de pptidos Agilent AdvanceBio, 2,1 x 150 mm
20 (n. de ref. Agilent 651750-902), en un sistema LC
10 cuaternario bioinerte Agilent 1260 Innity, con un
0 gradiente lineal de agua (1,0% TFA)/ACN (0,08%
TFA), 10 60% B en 30 minutos, 0,3 ml/min, a 45 C.
0 5 10 15 20 25 min

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19
Caracterizaciones de mapa de pptidos
mediante espectrometra de masas
El uso de RPC con espectrometra de masas ha hecho que esta tcnica
combinada sea el mtodo predilecto para la caracterizacin de pptidos y
los mapas de pptidos. Por ejemplo, en la industria biofarmacutica,
resulta esencial establecer y controlar la identidad de secuencia de un
objetivo teraputico. Adems, la estabilidad de la biologa de una protena
es un aspecto importante en el desarrollo teraputico para controlar
modificaciones como la oxidacin, la reduccin, la glicosilacin y el
truncamiento. Se puede emplear MS como prueba de pureza no reguladora;
as se establece la estabilidad gentica de un producto durante todo su
ciclo de vida.
Los pptidos se analizan con espectrometra de masas mediante infusin
directa de los pptidos aislados (o mediante el uso de LC/MS en lnea
para el anlisis estructural y, a continuacin, se correlaciona con la
secuencia proteica de aminocidos. De este modo, los pptidos
identificados confirman las secuencias de aminocidos especficas
cubiertas con el mapa de pptidos, as como la identidad de la protena. El
mapa de pptidos de espectrometra de masas se aplica para:
Confirmar la identidad de una protena concreta.
Obtener una caracterizacin detallada de la protena, como la
confirmacin de pptidos N-terminales y C-terminales, mapas
de pptidos de alta cobertura de secuencia, sustituciones de
aminocidos, etc.
Cribar e identificar modificaciones post-translacionales
(p. ej. glicosilaciones, enlaces disulfuro, cido piroglutmico terminal del
extremo N, oxidacin de metionina y triptfano, etc.)
20
En general, los tipos de anlisis de MS incluyen electrospray y
MALDI-TOF-MS, as como bombardeo por tomos rpidos (FAB, por sus
siglas en ingls). La MS en tndem tambin se ha usado para realizar la
secuencia de una protena modificada, as como para determinar el tipo de
modificacin de aminocido que se ha producido. Con el uso de ionizacin
de electrospray (ESI) o MALDI-MS, los pptidos proteolticos se pueden
ionizar de manera precisa en la fase gaseosa. La mayora de las
separaciones de pptidos se realizan con instrumentos LC/MS de
ionizacin de electrospray (ESI), debido a la conveniencia del acoplamiento
a LC y a la mejor calidad del espectro de masa en tndem para la
identificacin segura de protenas. Por ejemplo, un instrumento de MS de
tiempo de vuelo (QTOF) de cuadrupolo a menudo proporciona ms
informacin estructural, especialmente para pptidos de mayor tamao,
debido a su alta potencia resolutiva y a la exactitud de masa.
Basndose en la informacin de MS las protenas pueden identificarse
fcilmente, en las que las masas medidas se comparan con los valores
previstos derivados de la protena intacta, o de la base de datos de
protenas, para determinar la informacin de cobertura de masa y
secuencia. El objetivo de la caracterizacin de una protena mediante
mapa de pptidos es conciliar y registrar al menos el 95% de cobertura de
secuencia de la composicin terica de la estructura proteica. La figura 11
muestra el ejemplo de un mapa de pptidos con optimizacin alta de
digesto de protena eritropoyetina (EPO) con el uso de ESI-MS. Las
condiciones cromatogrficas optimizadas y los parmetros de MS han
permitido el 100% de la cobertura de secuencia y resaltan una separacin
de mapa de pptidos bien caracterizada.
Figura 11: mapa de pptidos optimizado de protena epo que proporciona un 100% de
cobertura de secuencia
mAU

300

250

200

150

100

50

0
0 5 10 15 20 25 30

x106
6.5
6
5.5
5 Figura 11: el cromatograma superior muestra una
4.5 separacin de mapa de pptidos de digesto de
4
3.5 EPO, completamente optimizada, realizada en una
3 columna de mapa de pptidos de 2,1 x 150 mm
2.5
2
AdvanceBio. El cromatograma inferior muestra
1.5 el anlisis cualitativo (con un extractor de
1 caractersticas moleculares) para la cobertura
0.5
0 de secuencias generada mediante un Q-TOF de
14.5 15 15.5 16 16.5 17 17.5 18 18.5 19 19.5 20 20.5 21 21.5 22 22.5 23 23.5 24 24.5 25 25.5 Agilent.

Recuentos frente a tiempo de adquisicin (min)

Informacin para pedidos

Para los mapas de pptidos, Agilent recomienda:

mapa de pptidos advanceBio:

la primera eleccin para la mayora
de aplicaciones
referencia
zorBaX rrHd 300-HiliC
descripcin referencia precolumna rpida
para datos adicionales de hidroflicos y glicopptidos
4,6 x 150 mm, 2,7 m 653950-902 850750-911 descripcin referencia
3,0 x 150 mm, 2,7 m 653950-302 853750-911 2,1 x 50 mm, 1,8 m 857750-901
2,1 x 250 mm, 2,7 m 651750-902 851725-911 2,1 x 100 mm, 1,8 m 858750-901
2,1 x 150 mm, 2,7 m 653750-902
2,1 x 100 mm, 2,7 m 655750-902
*Las precolumnas rpidas prolongan la vida til de las columnas sin retardar la sepa- patrn de control de calidad de pptidos
racin ni afectar a la resolucin.
Utilice el patrn de control de calidad de 10 pptidos de Agilent, el
mismo que utiliza Agilent en el control de calidad de sus columnas,
zorBaX rrHd 300-C18 para digesto incompleto para evaluar el rendimiento de su columna durante su vida til.
o muestras que contienen un ncleo hidrfobo Puede utilizarse para HPLC o LC/MS. Aproximadamente 20
inyecciones por vial.
descripcin referencia
2,1 x 50 mm, 1,8 m 857750-902 descripcin referencia
2,1 x 100 mm, 1,8 m 858750-902 Patrn de control de calidad de pptidos, 5190-0583
71 g en vial de 2 ml

Descubra ms acerca de las columnas Agilent para mapa de pptidos en agilent.com/chem/advancebio

21
preparacin de muestras de pptidos para anlisis de
espectrometra de masas, automatizada inteligentemente
La preparacin manual de muestras de pptidos es un proceso que lleva mucho tiempo.
Si se dedica a realizar aplicaciones de mapas de pptidos en MS, es probable que desee aumentar el
nmero de muestras analizadas. Y depender de un flujo de trabajo altamente reproducible de
principio a fin para garantizar que sus resultados son coherentes.

AssayMAP transforma los flujos de trabajo de digestin, limpieza y fraccionamiento para permitir
una precisin y un nmero de muestras analizadas antes imposibles de alcanzar:

Reproducibilidad mejorada gracias a que el error humano es menor: <5% de CV La solucin de preparacin de muestras de
pptidos AssayMAP se basa en la potente
Mayor nmero de muestras analizadas: hasta 384 muestras cada da combinacin de cromatografa miniaturizada y
de lecho compacto, la plataforma moderna de
Reduce significativamente el tiempo de preparacin manual, dejando a los cientficos libres para realizar manipulacin de lquidos Bravo y una interfaz de
tareas analticas usuario sencilla basada en aplicaciones; todo ello
crea un entorno de acceso abierto para usuarios
Desarrollo de mtodos ms rpido: la plataforma automatizada le permite optimizar mtodos con rapidez expertos e inexpertos y, adems, simplica los
ujos de trabajo de preparacin de muestras ms
difciles.

Solucin de preparacin de muestras de pptidos AssayMAP

Para anlisis de espectrometra de masas
C
B
digerir limpieza Fraccionar:
A

digestin: limpieza: Fraccionamiento:

Digestin en solucin con reactivos
suministrados por el usuario
Proceso paralelo hasta placas de
pocillos de 4 x 96
Un paso de pipeteo manual
ventajas:
Reducir variabilidad de usuario
Mejorar nmero de muestras analizadas y
reproducibilidad
Mtodo de separacin cuantitativa con
cartuchos de fase reversa
Proceso paralelo de placa de pocillos
de 1 x 96
ventajas:
10 l de elucin equivalen a tiempos de
secado cortos o mtodo "diluir e inyectar"
Control del proceso: cada muestra se trata
de forma idntica
Los cartuchos de intercambio catinico
fuerte (SCX, por sus siglas en ingls)
generan hasta 6 fracciones para simplificar
la muestra mediante elucin por etapas con
pH o sal
Proceso paralelo de placa de pocillos
de 1 x 96
ventajas:
Aumenta el nmero de muestras analizadas de
LC/MS realizando el fraccionamiento fuera de
lnea, reduciendo tiempos de gradiente de LC largos
Potente herramienta de enriquecimiento para
simplificar muestras y aislar pptidos objetivo antes
del anlisis

ventaja para el ujo de trabajo total:

Las interfaces de usuario para flujos de trabajo se normalizan para ganar facilidad de uso y se vinculan para conseguir integracin del flujo de
trabajo.

AssayMAP reduce la necesidad de duplicar muestras y requiere menos repeticiones de muestras.

22
Consiga reproducibilidad del ujo de trabajo total con la solucin Agilent AssayMAP para
preparacin de muestras antes del anlisis de espectrometra de masas
La solucin de preparacin de muestras de pptidos AssayMAP se us
para digerir 64 repeticiones de cada uno de los dos tipos de muestras: BSA
en urea y HCL de guanidina. Las muestras se limpiaron con cartuchos de
fase reversa AssayMAP y se analizaron con una columna de mapa de
pptidos Agilent AdvanceBio, LC Agilent 1290 Infinity y espectrmetro de
masas Q-TOF iFunnel Agilent 6550. El experimento se repiti en el da dos
para examinar la reproducibilidad. El % de CV se determin en 25 pptidos
dentro de cada muestra, como puede observarse en la tabla 1. Se muestran
los diferentes intervalos de % de CV. Se ilustran las contribuciones de la
media total de % de CV. Para mostrar la reproducibilidad, el rea de pico
para pptidos representativos se muestra en la figura 12.

lvnelteFaK, % de Cv = 1,3

rHpeYavsvllr, % de Cv = 2,5
rea de picos de pptidos (x107)

4
aeFvevtK, % de Cv = 1,8

HCl de guanidina
lvvstQtala, % de Cv = 2,5 25 pptidos urea (n=64, 62) (n=64, 64)
3
da 1 da 2 da 1 da 2
aWsvar, % de Cv = 3,3 % de CV de rea media de picos 3,3 3,7 2,3 2,6
pptidos con % de Cv<5 23 21 25 23
2
0 16 32 48 64 80 96 112 128 Pptidos con 5>% de CV<10 2 3 1
Pptidos con % de CV>10 1 1
Nmero de muestra (digestin de BSA con HCI de guanidina)

Figura 12: representaciones de dispersin que muestran el rea de picos de tabla 1: % de CV al da con diferentes intervalos de % de CV.
4 pptidos a lo largo de 2 das.

La preparacin de muestras AssayMAP llev unas cuatro horas diarias, El flujo de trabajo total de CV fue del <4%. El flujo de trabajo completo
con solo dos horas de actividad al da. La preparacin de muestras manual incluy el sistema de preparacin de muestras de pptidos AssayMAP,
para el mismo flujo de trabajo llevara unas ocho horas diarias, con cuatro una columna de mapa de pptidos Agilent AdvanceBio, el sistema LC 1290
horas de actividad al da. Infinity y un espectrmetro de masas Q-TOF iFunnel Agilent 6550.

Para conocer ms detalles sobre esta aplicacin, consulte la publicacin

de Agilent 4991-2474EN.

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23
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a los cientficos biofarmacuticos innovar en la investigacin de enfermedades, acelerar el
descubrimiento de frmacos y tener una mayor seguridad durante todo el desarrollo y
fabricacin. La gran variedad de soluciones Agilent de tecnologas de investigacin de
genmica, automatizacin, separacin y deteccin (junto con soluciones de software para flujos
de trabajo) ayuda a proporcionar las respuestas necesarias para que los tratamientos eficaces
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Con una variedad de biocolumnas y pequeas columnas disponibles, Agilent ha

introducido las columnas de LC y la preparacin de muestras NAVIGATOR para
ayudarle a elegir la columna adecuada para su aplicacin.

NAVIGATOR presenta cuatro opciones de bsqueda sencillas:

Por n. de referencia: remisin a columnas LC y productos de preparacin de

muestras para encontrar el mejor repuesto de Agilent

Por columna: recomendaciones basadas en el mtodo

Por compuesto: lista desplegable
Por mtodo USP
Adems, la herramienta ofrece soporte de columna para optimizar la
cromatografa, recomendaciones de productos para preparacin de muestras y
acceso rpido a fuentes de asistencia tcnica, as como otras herramientas.

Esta informacin est sujeta a cambios sin previo aviso.

Agilent Technologies, Inc. 2013
Impreso en EE. UU. 13 de noviembre de 2013
5991-2348ES