MANUAL DE PROTOCOLOS DE MICROBIOLOGA Y PARASITOLOGA 2017-II

Escuela de Medicina Humana

FACULTAD DE MEDICINA
ESCUELA DE MEDICINA HUMANA

MANUAL DE PROTOCOLOS

MICROBIOLOGA Y
PARASITOLOGA 2017-II

Equipo de Docentes de Prcticas

Mgtr. Liliana Alvarado Pineda

Mgtr. Blga. Zhandra Arce Gil.

Mgtr. Blgo. Jos Llontop Nuez.

Mgtr. Mara Teresa Sanchez Julca
Mgtr. Antero Yacarini Martinez

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 MANUAL DE PROTOCOLOS DE MICROBIOLOGA Y PARASITOLOGA 2017-II
Escuela de Medicina Humana

PRESENTACIN

El proceso de enseanza- aprendizaje de la Microbiologa en la formacin mdica

requiere de una metodologa especfica que permita promover de manera relevante
las caractersticas estructurales de los diferentes microorganismos asociados al origen
infeccioso de la patologa que afecta al hombre. El equipo docente propone el presente
Manual de Protocolos que permitir al estudiante de Medicina-USAT, tener a su alcance los
procesos experimentales que se llevarn a cabo en el Laboratorio de Microbiologa y
Parasitologa y poner en p rctic a las tc nicas b sic as util iz adas para la
i de nt i f i ca c i n m icrob iana ca us an te de la in f ec c in .

Es importante que el estudiante se concentre en la realizacin de las

prcticas programadas, as mismo es responsable de informarse y cumplir con las
normas de bioseguridad establecidas, no solamente para una proteccin personal
sino para garantizar la seguridad de todo el equipo de trabajo y as poder cumplir
satisfactoriamente el desarrollo de las prcticas propuestas y el logro de los objetivos de la
asignatura.

En este documento de trabajo se consideran las normas y

procedimientos generales de trabajo, de bioseguridad e instrucciones para el desarrollo de
cada una de las sesiones prcticas propuestas para el presente semestre acadmico y as
se convierta en una herramienta de ayuda en su proceso formativo y de investigacin
adquiriendo competencias que le permita al estudiante entender con ms claridad los
procesos patognicos microbianos que pudieran estar afectando a uno u otro rgano del ser
humano.

Los autores.

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 OBJETIVOS

Con las sesiones de trabajo en el laboratorio, se pretende conseguir que los alumnos
sean capaces de:

1. Conocer los principios empleados por la Microbiologa para la adecuada identificacin

microbiana causante de la infeccin en el ser humano.

2. Conocer las principales tcnicas empleadas en Microbiologa para el aislamiento e

identificacin correcta de microorganismos asociados con la patologa o enfermedad
infecciosa.

3. Poner en prctica los conocimientos adquiridos para aplicarlos en el diagnstico

clnico siguiend0 una adecuada y ordenada interpretacin de los estudios
microbiolgicos.
NORMAS GENERALES DE TRABAJO EN EL LABORATORIO
DE MICROBIOLOGA y PARASITOLOGA

El estudio de las bacterias, virus, parsitos, hongos y otros agentes infecciosos que
pueden ser patgenos para el hombre, los animales u otras formas de vida implican
riesgos que varan segn el agente infeccioso y los procedimientos utilizados. Las normas
de Seguridad Biolgica pretenden reducir a un nivel aceptable el riesgo inherente a la
manipulacin de material peligroso y son muy rigurosas para los agentes ms peligrosos y
menos exigentes para los que causan problemas de menor entidad. Deben ser
consideradas como compromisos destinados a conseguir que las personas que trabajan
con agentes infecciosos en el Laboratorio de Microbiologa estn expuestas al mnimo
riesgo posible.

El laboratorio de Microbiologa es un lugar convenientemente habilitado donde se

pueden manejar y examinar microorganismos. Este tipo de trabajo debe ser llevado a cabo
con una buena tcnica asptica y por tanto, se requiere un ambiente limpio y ordenado; y
trabajar siempre en condiciones de esterilidad (en campanas de esterilidad biolgica o en la
proximidad de la llama de un mechero de alcohol o de gas).

Aunque los microorganismos que se manipulen no sean considerados patgenos, todos los
cultivos de todos los microorganismos deben ser manejados con precaucin por su
potencial patogenicidad.

Es necesario cumplir dos REQUISITOS BSICOS:

Restringir la presencia de los microorganismos en estudio a sus recipientes y
medios de cultivo para evitar el riesgo de contaminarse uno mismo o a un
compaero.

Evitar que los microorganismos ambientales (presentes en piel, pelo, aire, ropa,
etc.) contaminen las muestras.

Adems es importante tener en cuenta lo siguiente:

1. Libros, carpetas, mochilas y cualquier otro material que no se utilice en la realizacin de

la prctica deben estar apartados del lugar de trabajo.

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2. Mantener una adecuada disciplina durante su estancia en el laboratorio,
demostrando seriedad y responsabilidad en su trabajo.

3. Estar atentos a las instrucciones del d o c e n t e . No debe efectuar experimentos no

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 autorizados por el docente.
4. Concentrarse en su trabajo y no molestar a sus compaeros. En el laboratorio no se
permiten las conversaciones ruidosas, silbidos, actitudes escandalosas o fuera de
lugar, ni tampoco el uso de telfonos celulares.
5. Formar grupos de trabajo, los cuales se mantendrn a lo largo del semestre
acadmico. Todo el subgrupo es responsable del material asignado.

6. Tomar nota de todos los datos, observaciones y resultados. Si tuvieran alguna duda o
dificultad debern consultar con el docente.

7. Debern reponer el material roto o instrumento deteriorado durante la prctica, antes

de la siguiente sesin, de lo contrario, no podrn ingresar.

Smbolo de Riesgo Biolgico

 NORMAS DE BIOSEGURIDAD

1. Es imprescindible el uso de bata de laboratorio.

2. Al iniciar y finalizar las prcticas, el estudiante se lavar las manos con agua y jabn.
3. El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado. Antes de comenzar cada
prctica es conveniente desinfectar la superficie de trabajo. Los desinfectantes ms
habituales para esto son la leja y el alcohol (etanol 70).
4. Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama de un mechero.
Se deben evitar los desplazamientos innecesarios por el laboratorio, ya que pueden
crear corrientes que originen contaminaciones o producir accidentes.

5. Durante las prcticas est prohibido comer, beber y fumar. Cuando se manipulan
microorganismos hay que evitar llevarse las manos a la boca, nariz, ojos, etc.

6. Para deshacerse del material contaminado se utilizarn los recipientes adecuados, que sern
esterilizados posteriormente. Nunca se debe tirar nada contaminado por la fregadera
o a la basura comn.

7. Bajo ningn concepto debe sacarse una muestra contaminada del laboratorio.
8. No se debe pipetear nunca con la boca. Utilizar siempre pipeteadores manuales.
9. En caso de accidente (ruptura de material, derramamiento de microorganismos, etc.)
se comunicar inmediatamente al docente.

10. Revisar el material que se recibe, fijarse que no est roto o rajado y que est limpio.
Al trmino de la prctica, se devolver el material limpio y completo.

11. Saber los aspectos ms relevantes del correcto uso de los materiales, instrumentos,
equipos y reactivos del laboratorio para evitar accidentes. Deben adems,
familiarizarse con la simbologa utilizada para indicar la peligrosidad de los reactivos
qumicos. Si sucediera cualquier accidente debe ser notificado de inmediato al
docente.

12. En caso de derrame de alguna sustancia (colorante, medio de cultivo, muestras

clnicas), deben limpiarse de inmediato. La limpieza y el orden en el laboratorio son
esenciales.

13. Evitar arrojar residuos slidos en los vertederos. Los lquidos se eliminan de acuerdo a
las instrucciones del docente.

14. Al terminar la prctica, asegurarse que las llaves de gas y del agua estn cerradas, los
frascos de los reactivos debidamente tapados y su mesa limpia y en orden. Si algn
 material se hubiera roto comunicar al asistente de Laboratorio.

15. Antes de salir del laboratorio, lavarse las manos. Si fuera necesario, tambin el rostro,
por tanto debe portar jabn de tocador y una toalla de manos.
 Niveles de Seguridad Biolgica

Existen cuatro niveles establecidos segn las tcnicas utilizadas, los equipos de seguridad y
la estructura del laboratorio.

Nivel 1. En el nivel de bioseguridad 1 los microorganismos que pueden ser manipulados

estn bien definidos y caracterizados por tener una muy baja o ninguna virulencia
para personas adultas saludables. En este nivel se incluyen bacterias como Bacillus
subtilis o ciertas cepas no patgenas de Escherichia coli como E. coli K12. Sin
embargo, estos microorganismos podran representar algn riesgo para el
pblico en general, especialmente para nios e in dividuos con compromiso
inm unolgico. En trminos generales, el nivel de bioseguridad 1 no es apropiado
para el trabajo con bacterias patgenas e incluye condiciones apropiadas para la
enseanza de la microbiologa a un nivel introductorio.

Nivel 2. En laboratorios del nivel de bioseguridad 2 es donde se efecta la mayor parte del trabajo
rutinario del laboratorio de microbiologa clnica, incluyendo el manejo de muestras
clnicas de diversa ndole y la manipulacin de cultivos de microorganismos. Los
microorganismos que deben ser trabajados en el nivel de bioseguridad 2 incluyen la mayor
parte de las bacterias aisladas frecuentemente en muestras clnicas, como Salmonella,
Shigella, Vibrio cholerae, Campylobacter, Haemophilus, Neisseria,
Pseudomonas, Staphylococcus aureus y especies de Staphylococcus coagulasa-negativa,
Streptococcus y Enterococcus, entre o t r a s .

Nivel 3. Este nivel es adecuado para trabajar con microorganismos de alto riesgo. El uso
de animales de laboratorio siempre implica uso de guantes. Los animales se
desinfectarn antes de desecharlos. El laboratorio debe estar aislado de la
circulacin general, existiendo doble puerta de entrada, con una habitacin para
cambiarse y con ducha. Debe tener adems, un sistema especial de extraccin de aire. Los
microorganismos que deben ser trabajados en el nivel de bioseguridad 3 son altamente
infecciosos, pueden causar graves infecciones sistmicas en seres humanos
inmunocompetentes e incluyen a Mycobacterium tuberculosis, Coxiella
burnetii y las especies de Brucella.

Nivel 4. Este nivel solo se establece en laboratorios de experimentacin y no en laboratorios

de microbiologa clnica. Se suelen manejar microorganismos de altsimo riesgo o
que son exticos del pas, especialmente virus (bola, Hanta).
PRCTICA N 1

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 BIOSEGURIDAD E INSTRUMENTAL BSICO DEL
LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Y PARASITOLOGA
REACCIONES INMUNOLGICAS

Mgtr. Zhandra Arce Gil

I. OBJETIVOS
Conocer las normas de bioseguridad para el trabajo experimental en el
Laboratorio de Microbiologa.

Identificar y conocer los materiales y equipos de uso ms comn en el

Laboratorio de Microbiologa y Parasitologa.

Conocer la importancia y el fundamento inmunolgicos de las

pruebas: hCG y ASO.

II. INTRODUCCIN

La bioseguridad es un conjunto de medidas probadamente eficaces para evitar

la adquisicin accidental de infecciones con patgenos contenidos en las
muestras, as como los riesgos relacionados con la exposicin a agentes
qumicos, fsicos o mecnicos a los que est expuesto el personal en los
laboratorios.
Es necesario establecer normas de bioseguridad en el Laboratorio de
Microbiologa porque son herramientas para evitar que los riesgos
relacionados con la exposicin a agentes qumicos, fsicos y mecnicos, se
conviertan en accidentes como la contaminacin con microorganismos
patgenos o afecciones a la piel en las diferentes partes del cuerpo.
Algunos de los instrumentos ms utilizados en los laboratorios, son los
elaborados en vidrio que se caracterizan por ser resistente a altas
temperaturas, por su alto contenido de dixido de silicio, bajo lcali, xido
brico y vestigios de otros xidos, lo que condiciona su escaso coeficiente de

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 dilatacin, teniendo una gran aplicacin en la fabricacin de materiales de
laboratorio, uno de los ms conocidos es el vidrio PYREX. As como los
elaborados de distintos metales pesados como platino, mercurio, aluminio,
cobre que les otorgan caractersticas como buenos conductores del calor o
porque al medio ambiente son muy manejables sin alterar su composicin.
Para trabajar en un laboratorio de Microbiologa se requieren unas tcnicas
especficas y diferentes de las que se utilizan en otras disciplinas. Es
imprescindible trabajar en condiciones aspticas: el material e instrumental
que se va a utilizar, as como los medios de cultivo, deben ser sometidos a
algn procedimiento de esterilizacin, eliminndose de ellos cualquier posible
microorganismo. Para mantener las condiciones de esterilidad, debemos
trabajar en campana de flujo laminar o en la proximidad de la llama de un
mechero Bunsen.
En el laboratorio, el trabajo con microorganismos suele realizarse utilizando
cultivos axnicos o puros, es decir, que contienen organismos de una sola especie
microbiana. La posibilidad de contaminacin est siempre presente porque los
microorganismos se encuentran en todos los ambientes: en el aire, en el agua, en
nuestra piel y, en general, en todo lo que tocamos.
Para evitar las contaminaciones hemos de observar las siguientes normas:
El medio de cultivo y el recipiente que lo contiene deben estar estriles.
Los tubos o matraces deben ser tapados con algodn hidrfobo estril o
cubiertos con un capuchn metlico, para impedir la entrada de
microorganismos. Si se usan placas de Petri deben mantenerse tapadas
mientras no se estn manipulando.
Los instrumentos que van a entrar en contacto con el medio de cultivo,
con los distintos recipientes o con los microorganismos en estudio (asa
de siembra, pipetas, etc.) deben ser previamente esterilizados.

La inmunologa es la ciencia que estudia los procesos moleculares y

celulares implicados en la defensa de la integridad biolgica del
organismo a travs de la identificacin de las sustancias propias y
deteccin de las sustancias extraas y su destruccin. Entendemos por
respuesta inmune todos aquellos eventos desarrollados por el sistema
inmune al objeto de defender la integridad biolgica del individuo frente a
cualquier agresin (estmulo antignico). La respuesta inmune puede ser, pues,
de tipo inespecfica o innata y especfica.

III. MATERIAL Y PROCEDIMIENTOS

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3.1. MATERIALES Y EQUIPOS E INSTRUMENTOS BSICOS EN EL
LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

3.1.1 MATERIALES
A) DE VIDRIO
Beaker (200 ml).
Baln de Base Plana (250 ml).
Probeta (100 ml).
Placa Petri (10 y 20 cm dimetro).
Pipetas Volumtricas (5 y 10 ml).
Matraz Erlenmeyer (250 ml).
Laminas Portaobjetos.
Laminillas Cubreobjetos.
Tubo de ensayo (13x100, 10x75, 15x150 y 15x180: tapa de rosca).
B) DE METAL
Pinzas para tubos.
Asas bacteriolgica (en anillo, en punta).
C) REACTIVOS, COLORANTES Y MEDIOS DE CULTIVO
Solucin Salina Fisiolgica.
Colorante Wright (Inflamable Toxico).
Colorante Azul de Metileno.
Colorantes Safranina.
Frasco con Reactivo de Kovacs.
1 Frasco con Etanol absoluto Inflamable.
Frasco con Medio de cultivo diferencial: Agar TSI.
Frasco con Medio de cultivo Selectivo: Agar Mc Conkey.
3.1.2. EQUIPOS, INSTRUMENTOS Y OTROS
Incubadora (37C, 100C).
Balanza de Precisin.
Centrifuga.
Refrigeradora.
Autoclave.
Microscopios pticos.
Micropipetas (2-20 L, 50-100 L, 100-1000 L).
Racks con puntas amarillas y azules.
Gradillas (metal plastificado y madera).
Horno esterilizador.

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 Jarra de anaerobiosis.
Esptula.
Hisopos.
3.2. MATERIALES Y EQUIPOS E INSTRUMENTOS DE USO EN REACCIONES
INMUNOLGICAS

3.1.1. MATERIALES
1. Biolgico
Suero sanguneo.
2. Reactivos
1 Kit de determinacin Prueba de embarazo (hCG).
1 Kit de determinacin de ASO.
3.1.2. EQUIPOS, INSTRUMENTOS Y OTROS
3 Micropipetas de 10-100l.
3 Racks con puntas amarillas.
3 frascos con agua y leja para desechos.
IV. PROCEDIMIENTO
4.1. RECONOCIMIENTO Y USO DE MATERIAL DE VIDRIO
Sobre la mesa de trabajo, clasificar el material de vidrio, reconocerlo y
explicar el uso al que se destina.
Anotar los requisitos de calidad del material de vidrio antes de su
adquisicin.

Explicar porque el uso del vidrio en el material de laboratorio de

microbiologa.

4.2. RECONOCIMIENTO Y USO DE MATERIAL DE METAL Y OTROS

Poner el material sobre la mesa de trabajo y anotar el uso y cuidado de
cada uno (gradillas, goteros, pinzas, guantes, mecheros, morteros,
jeringas, etc.).
Anotar los requisitos de calidad del material de metal antes de su
adquisicin.

Explicar por qu el uso del metal en el material de laboratorio y las

medidas de bioseguridad que deben observarse.

4.3. RECONOCIMIENTO Y USO DE EQUIPOS

Reconocer, graficar y anotar la utilidad de cada equipo de laboratorio
(centrifuga, incubadora, horno, autoclave, etc.) explicando el

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 fundamento de su funcionamiento.

4.4. DETECCIN DE LA INMUNIDAD HUMORAL:

Prueba ASO
En una lmina de fondo oscuro colocar una gota del suero sanguneo y
agregar una gota del reactivo. Homogenizar por 5-8 minutos. Observar la
reaccin de aglutinacin, segn figuras N 1 y 2.

FFig. N 1. Kit para ASO latex Fig. N 2. Resultado ASO latex.

Prueba hCG (Gonadotropina Corinica Humana)

Trabajar con una muestra de suero u orina (de preferencia la primera

de la maana)

Dispensar 0,5 mL de muestra en un pequeo tubo o vial. Introducir

verticalmente la tira hCG en la muestra durante 5 segundos para las
muestra de orina o 10 segundos para las muestras de suero. No
sobrepasar la marca roja, coloque la tira en otro tubo o sobre una
superficie limpia, plana y seca. Leer en ambos casos el resultado a los
3-5 minutos.

4.5. MANEJO DE RESIDUOS

Las tarjetas ASO y/o los tubos con las muestras para hCG sern
lavados con detergente o colocadas en un recipiente conteniendo
hipoclorito de sodio.

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V. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
1. Organizacin Mundial de la Salud (OMS). Manual de bioseguridad en el
laboratorio. 3 Edicin. 2005, Ginebra.

Disponible en:
http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/CDS_
CSR_LYO_2004_11SP.pdf?ua=1
2. SPINREACT. ASO-Latex Aglutinacin en porta. Pruebas rpidas Spinreact.
2013, Madrid-Espaa.
Disponible en: http://www.spinreact.com.mx/public/_pdf/1200102.pdf

3. ABON hCG

Disponible en:
http://www.biosystemsantioquia.com.co/images/nuestras-marcas/abon/FHC-201-Abon-

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 CUESTIONARIO

1. Qu utilidad tiene el autoclave en el

laboratorio de microbiologa?

2. Es lo mismo incubar que esterilizar. Explique

brevemente.

3. Por qu es importante trabajar frente a un mechero o con una cabina de bioseguridad

cuando procesamos muestras biolgicas?

4. Qu utilidad tiene la jarra de anaerobiosis?

5. Explique la reaccin inmunolgica de la prueba

para embarazo realizada en prctica.

6. Por qu las pruebas realizadas en prctica

pertenecen al tipo de inmunidad humoral?

7. Qu otros tipos de inmunidad Usted conoce?

Explique brevemente

8. Defina brevemente anticuerpo monoclonal y

policlonal.

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FUNDAMENTACIN CLNICA

Nia de 8 aos regresa a casa del colegio sintindose muy mal. Presenta fiebre elevada e irritacin
farngea. Tiene dificultades para deglutir cualquier tipo de alimento, rechaza la comida y llora
durante toda la noche. Al da siguiente su padre la lleva a consulta en un Centro de salud cercano a
su casa. El mdico al chequearla, observa inflamacin de la faringe. Solicita un hisopado de la
faringe para cultivo en agar sangre, despus de dos das se observ crecimiento de colonias Beta
hemolticas que a la tincin Gram se muestran como cocos Gram (+) en cadenas.
La Prueba de ASO (Antiestreptolisina O) result con un ttulo de: 400 U/mL

Beta hemlisis en placa de agar sangre Cocos en cadena en Coloracin Gram

PREGUNTAS DE APLICACIN

1.- Explique Por qu el hisopado farngeo se sembr en agar sangre?

2.- Cmo ayuda la coloracin Gram para este tipo de diagnstico?

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3.- Por qu es importante la determinacin de ASO en el diagnstico de faringitis producido por
Streptococcus pyogenes?

4.- Fundamente la prueba ASO. Identifique el antgeno y el anticuerpo.

5.- Qu otros factores de virulencia presenta S. pyogenes?

6.- Cmo es el crecimiento de las colonias de S. pyogenes en agar sangre? 7.-
Cules son los valores de referencia para la prueba ASO?

8.- Cmo interpretara el resultado de la prueba ASO encontrada en el paciente?

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