CEEA Tecnicas61 2

CONSEJO SUPERIOR
MINISTERIO DE INVESTIGACIONES
DE CIENCIA CIENTFICAS
E INNOVACION CENTRO NACIONAL
DE BIOTECNOLOGA
CEEA Tcnicas de obtencin e inoculacin de muestras
A. Tcnicas de obtencin de muestras
1. A Extraccin de sangre de vena mandibular

2. A Extraccin de sangre de seno retro-orbital
3. A Biopsia de cola
4. A Marcaje en orejas
5. A Perfusin in vivo
B. Tcnicas de inoculacin de muestras
1. B Inoculacin Subcutnea
2. B Inoculacin Intraperitoneal
3. B Inoculacin Intramuscular
4. B Inoculacin Intradrmica
5. B Inoculacin Intravenosa
6. B Inoculacin en Almohadillas Plantares
1
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Tcnica n1.A Extraccin de sangre de Vena Mandibular
Anestesia: No requerida
Material: Aguja 19 21 G
Volumen de extraccin: Consultar Tabla I
Descripcin de la tcnica:
1. Sujetar firmemente al ratn de manera que la cabeza quede alineada con el cuerpo, es
decir, que no est inclinada hacia el trax o hacia los lados.
2. Comprimir ligeramente los vasos del cuello del lado opuesto al que se va a realizar la
puncin.
3. Localizar la pequea zona circular desprovista de pelo situada centralmente en la
mandbula inferior (puede no estar presente en algunas cepas).
4. Con una aguja de 19-21 G, dependiendo de la edad y/o tamao del ratn, realizar la
puncin (inclinando dorsalmente la aguja 1-2 mm) en la zona anteriormente descrita. La
profundidad ptima es de 2-3 mm.
5. Recoger la sangre en el recipiente adecuado teniendo en cuenta que el flujo ser de
aproximadamente una gota (20l) por segundo.
6. Una vez obtenida la muestra liberar al ratn. El sangrado se detendr automticamente.
http://www.univ.trieste.it/~servpoli/stabpst.m1v
Tcnica n2.A Extraccin de sangre de Seno Retro-orbital
Anestesia: Obligatoria
Material: Capilares tratados con anticoagulante (EDTA, heparina)
Restricciones: Esta tcnica debe ser llevada a cabo nicamente cuando no exista mtodo alternativo y
siempre por personal cualificado debido al elevado riesgo de daar estructuras adyacentes al globo ocular, lo
que puede originar infecciones severas, ceguera etc
Volumen de extraccin: Consultar Tabla I
1. Una vez anestesiado el ratn y comprobado que se ha alcanzado el plano quirrgico,

sujetar al ratn estirando la piel del cuello hacia atrs asegurndose de no dificultar la
respiracin
2. Insertar el capilar en el ngulo externo del ojo (2 mm aprox) y girar suavemente hasta que
la sangre fluya por el mismo.
3. Recoger la muestra y retirar el capilar.
4. Oprimir ligeramente la zona de puncin con una gasa o papel para detener la hemorragia.
5. Aplicar pomada oftlmica (Lubrifilm) al ojo.
6. Comprobar que la recuperacin de la anestesia se produce adecuadamente aportando
las medidas que se consideren necesarias para ello (i.e , aporte de calor )
CAMPUS DE LA UNIVERSIDAD
AUTNOMA DE MADRID.
CORREO ELECTRNICO: CANTOBLANCO.
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7. Observar al animal los das posteriores al sangrado para detectar la aparicin de posibles
complicaciones: protrusin de tejido adyacente al ojo, infecciones, hemorragias
Fig. 1
Tcnica n 3. A Biopsia de cola
Anestesia: En funcin de la edad y seccin de cola que se quiera obtener.

Material: Escalpelo, tijeras o cauterizador elctrico.
Longitud mxima de la muestra: 5 mm
Requerimientos:
1. La longitud mxima a cortar es de 5 mm. De este fragmento se obtienen unos 50 g de

DNA, suficiente para mltiples ensayos de genotipado. Muestras mayores a 5 mm
requerirn autorizacin expresa del Comit tico del centro.
2. La edad ptima para la realizacin de este procedimiento es de 15 a 21 das, antes de la
calcificacin de las ltimas vrtebras.
3. Requerimientos de anestesia:
- Ratones de menos de 28 das: anestesia no requerida.
- Ratones de ms de 28 das: anestesia requerida para muestras de ms de 2 mm
- Segunda biopsia: anestesia requerida independientemente de la longitud de la
muestra a tomar.
4. Este procedimiento no debe ser desarrollado ms de dos veces en el mismo ratn sin
permiso del Comit tico de Experimentacin Animal.
1. Inmovilizar al ratn en una mano o bien introducirlo en los cepos destinados a tal efecto.
2. Con las tijeras (previamente esterilizadas en llama), el escalpelo o cortacolas elctrico,
seccionar 2 mm de la cola.
3. Presionar la zona del corte con papel para detener la hemorragia.
4. No devolver al ratn a su jaula hasta comprobar que el sangrado se detiene
completamente.
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Tcnica n4. A Marcaje por muescas en orejas
Material: Marcador de orejas
1. Inmovilizar al ratn con una mano de modo que las orejas queden perfectamente
accesibles.
2. Proceder al marcado siguiendo el cdigo de marcaje elegido. En nuestro caso, el cdigo
de marcas en las orejas es el siguiente:
- En la oreja derecha del ratn se marcan invariablemente las unidades, desde el 1
en la zona de la oreja ms prxima al hocico, hasta el 4 en la parte ms craneal
de la misma. El 2 y 3 se marcan a ambos lados de la lnea imaginaria que divide
a la oreja en dos desde la zona ms interna a la ms externa; el 2 de la lnea
hacia abajo (hocico) y el 3 de la lnea hacia arriba:
- Los nmeros mayores de 4 se marcan segn las combinaciones siguientes:
5=4+1
6=4+2
7=4+3
8=4+3+1
9=4+3+2
- Las decenas se marcan en la oreja izquierda del ratn siguiendo la misma

disposicin que las unidades, es decir, desde la zona de la oreja ms prxima al
hocico del animal (10) a la ms craneal (40), siendo las combinaciones para
formar el 50, 60, 70, 80, y 90 exactamente igual que las utilizadas para las
unidades (50 = 40 + 10 etc)
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Tcnica n 5. A Perfusin in vivo
Anestesia: Requerida. Ketamina / Xilacina (150mg/kg : 10mg/kg), Avertina, Pentobarbital etc

Material: Solucin de lavado (PBS 1x o Solucin salina)
Solucin de fijado (PFA 4%, Formaldehdo 10%...)
Aparato de perfusin, jeringuillas o bomba peristltica.
Agujas: 22G para ratn, 20G para rata.
Volmenes: Solucin de lavado: 10-25 ml (ratn) 50-100 ml (rata)
Solucin de fijado: 50-100 ml (ratn) 400-600 ml (rata)
Restriccin: Debido a la utilizacin de productos txicos como el formaldehdo, este procedimiento deber llevarse a
cabo en una cabina de qumicos.
1. Una vez anestesiado el ratn y alcanzado el plano quirrgico (ausencia de reflejo podal)
colocarlo en posicin decubito supino sobre una placa/rejilla adecuada para la recogida
de los lquidos de lavado y fijacin.
2. Estirar y sujetar las extremidades.
3. Lavar la superficie del ratn con etanol 70
4. Realizar un corte en la piel a la altura del final del esternn, separar la piel y cortar las
costillas en paralelo a los pulmones para exponer el corazn.
5. Insertar la aguja, bien de la jeringuilla o bien de la botella (en caso de utilizar el aparato
de perfusin) que contiene la solucin de lavado, en el ventrculo izquierdo y profundizar
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hasta alcanzar la aorta clampando la aguja a este nivel segn se ve en el esquema

siguiente:
En ratones puede ser muy difcil clampar la aorta por lo que la aguja deber mantenerse
sujeta mientras se realiza la perfusin.
6. Realizar una incisin en la aurcula derecha para permitir el escape de la circulacin de

retorno de los lquidos de lavado.
7. Proceder al lavado con la solucin salina o PBS 1x. La velocidad de perfusin de los
lquidos de lavado influir en la correcta fijacin de los rganos estimndose un tiempo
mnimo de 10-20 min en ratn y 10 a 30 min en rata para los volmenes anteriormente
especificados. En el caso de utilizar el sistema de perfusin por gravedad, la altura a la
que deben situarse las botellas con los lquidos de lavado y fijacin es de 100 a 120 cm
sobre el animal.
8. Proceder a la perfusin de la solucin de fijado
9. Una vigorosa contraccin muscular es indicativa de la correcta fijacin del animal. En este
momento retirar la aguja y proceder a la extraccin de los rganos deseados.
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Tcnica n 1. B Inoculacin Subcutnea (SC o SQ)
Material: Aguja 25G (ratn y rata)
Volumen mximo: 2-3 ml (ratn) 5-10 ml (rata)
Inoculaciones mximas: 2-3 inoculaciones por da
pH inoculacin: Fisiolgico (aprox. 7). Consultar Anexo 2.
1. Depositar al ratn sobre la rejilla permitindole agarrarse a ella con las patas delanteras y
levantar la piel de la espalda con los dedos ndice y pulgar tal y como se muestra en la
figura 2. De igual manera puede hacerse en la regin inter-escapular.
2. Insertar la aguja en la base de la zona de piel que estamos sujetando manteniendo la
aguja paralela al cuerpo del ratn para evitar inocular en capas inferiores a la piel.
3. Aspirar ligeramente para asegurarnos de no haber penetrado en algn vaso sanguneo.
4. Inyectar el volumen de muestra a una velocidad moderada.
5. Retirar la aguja y presionar la piel en la zona de inyeccin para evitar que el fluido salga
por el punto de piel perforada.
6. Observar que no se produce sangrado.
7. Debido a que la muestra se deposita en la zona subcutnea, y si sta se ha desarrollado
correctamente, podremos observar la formacin de un abultamiento en el lugar de
inyeccin que ir desapareciendo a medida que el fluido es dispersado.
Fig. 2
Tcnica n 2. B Inoculacin Intraperitoneal (IP)
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Material: Aguja 27-25G (ratn) 25-23G (rata)
Volumen mximo: 2-3 ml (ratn) 5-10 ml (rata)
pH inoculacin: Consultar Anexo 2.
1. Con el ratn correctamente inmovilizado (evitando cualquier movimiento durante el

procedimiento) inclinarlo caudalmente y trazar una lnea imaginaria que cruce su
abdomen transversalmente justo sobre sus rodillas tal y como se muestra en la figura 3
(lnea negra).
2. La aguja deber ser insertada sobre esta lnea, en el lado derecho del animal y lo ms
cercano posible a la lnea que divide longitudinalmente el abdomen (lnea roja). De esta
manera disminuimos el riesgo de inyectar en ciego o vejiga urinaria.
3. La aguja debe alcanzar una profundidad de aproximadamente medio centmetro (ratn) y
debe insertarse con una inclinacin de unos 30 con respecto a la superficie del
abdomen.
4. Aspirar para asegurarse de que no se ha alcanzado ningn vaso sanguneo, ciego o
vejiga urinaria.
5. Si ningn fluido es aspirado, proceder a la inyeccin de la muestra.
6. Retirar la aguja y presionar ligeramente la zona de inyeccin.
Fig. 3
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Tcnica n 3. B Inoculacin Intramuscular (IM)
Anestesia: No requerida.
Material: Aguja 27G (ratn) 25G (rata)
Lugar de inoculacin de eleccin: Cuadriceps
Volumen mximo: 50 l por sitio de inyeccin (ratn) 300l por sitio de inyeccin (rata)
Inoculaciones mximas: 2 inoculaciones por da
pH inoculacin: Fisiolgico (aprox. 7). Consultar Anexo 2.
1. Pueden ser necesarias dos personas para el correcto procedimiento de esta tcnica, una
para sujetar al animal y otra para la inoculacin.
2. Sujetar firmemente la pata trasera del animal y proceder a la insercin de la aguja en el
sitio de inoculacin.
3. Aspirar ligeramente para asegurarse de que no se ha perforado ningn vaso sanguneo.
4. El contenido de la jeringuilla debe ser expelido muy lentamente y la zona de inyeccin
masajeada cuidadosamente una vez realizada la inoculacin.
Fig. 4
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Tcnica n 4. B Inyeccin Intradrmica (ID)
Anestesia: No requerida, pero facilita el procedimiento.

Lugar de inoculacin de eleccin: Zona dorsal
Volumen mximo: 50-100 l por sitio de inyeccin (ratn y rata)
Inoculaciones mximas: 6 sitios de inoculacin
pH inoculacin: Fisiolgico (aprox. 7).Consultar Anexo 2.
1. La aguja debe ser mantenida casi paralela a la superficie de la piel y avanzar

cuidadosamente unos pocos milmetros dentro de ella.
2. Si se nota una perdida de resistencia al paso de la aguja es que habremos pasado a la
capa subcutnea. En este caso, retirar la aguja y proceder de nuevo a la inoculacin.
3. Realizar una ligera rotacin de la aguja despus de la inoculacin y justo antes de
extraerla ayudar a minimizar la prdida de compuesto inyectado.
Fig. 5
Tcnica n 5. B Inoculacin Intravenosa (IV)
Lugar de inoculacin: Vena lateral de la cola
Volmenes recomendados: 200l -300l (ratn) 500l (rata). Consultar Tabla II.
pH inoculacin: Consultar Anexo 2.
1. Antes de realizar la inyeccin es conveniente inducir la vasodilatacin de la vena para

facilitar su canulacin. Para ello puede recurrirse a la utilizacin de lmparas de
infrarrojos (evitando que incida directamente sobre los ojos del animal o causarle
quemaduras por exposicin excesiva), inmersin de la cola en agua caliente ( T no
superior a 43C) o utilizacin de agentes vasodilatadores (como Xilacina o
Acepromacina).
2. Las venas laterales se localizan a ambos lados de la lnea central de la cola y muy
superficialmente de manera que la inyeccin debe hacerse prcticamente paralela a la
superficie (figura 6)
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3. Si aparece sangre al aspirar, la colocacin de la aguja ser la adecuada. De todas formas

es fcil comprobar que hemos accedido a la vena ya que, si la aguja ha sido alojada en el
lumen de la vena, no se apreciar resistencia al presionar el mbolo de la jeringuilla de
modo que la muestra fluir sin dificultad en el torrente sanguneo.
4. Una vez inoculada la muestra retirar la aguja y presionar la zona de inyeccin con un
algodn para detener la hemorragia.
Fig. 6
Tcnica n 6. B Inoculacin en Almohadillas Plantares
Anestesia: Puede ser requerida si la inoculacin la realiza una nica persona.

Material: Agujas 27-30G (ratn) 27G (rata)
Volmenes mximos de inyeccin: 50 l (ratn) 100 l (rata)
pH de inoculacin: Fisiolgico (aporx. 7)
Restricciones: Solo se utilizar esta va de administracin en aquellos casos en los que el resto de rutas de
inoculacin se hayan comprobado no efectivas.
Consideraciones especiales:
1. Inocular en dos patas interfiere con la locomocin, por ello nunca se inocular en ms
de una pata por animal.
2. Limitar el volumen y concentracin del inculo a los mnimos posibles.
3. Los animales no deben ser alojados en jaulas desprovistas de viruta (tipo jaulas
metablicas).
4. La monitorizacin del sitio de inyeccin deber ser tan frecuente como sea necesario
para detectar de inmediato reacciones adversas que puedan impedir el acceso del
animal a agua y comida. En caso de aparicin de las mismas se proceder con el
protocolo de Determinacin del Punto Final previsto.
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Anexo 1
Tabla I. Volmenes de extraccin de sangre.
Tabla I.A. Volmenes de extraccin referidos a Vc (volumen circulante)
Extraccin nica Extracciones mltiples
Perodo de % Vc extrado Perodo de

% Vc extrado
recuperacin en 24h recuperacin
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7.5 % 1 semana 7.5 % 1 semana
10 % 2 semanas 10 % 2 semanas
15 % 4 semanas 15 % 3 semanas
Vc: Volumen circulante

Vc ratn: 72 ml/kg
Vc rata: 68 ml/kg
Tabla I.B. Volmenes de extraccin referidos a Vt (Volumen total)
Extraccin de sangre
7.5 % 10 % 15 % 20 %
V t (ml)
(ml) (ml) (ml) (ml)
Ratn
1.8 0.1 0.2 0.3 0.4
(25g)
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Rata
16 1.2 1.6 2.4 3.2
(250g)
Vt: Volumen total: aprox. 6% del peso (en ml)
Tabla II. Volmenes de inoculacin.
Rutas y volmenes de administracin

(ml/kg excepto *ml/sitio)
IV IV
oral SC IP IM
Bolus Perf.
0.05*
Ratn 10 (50)10 (40)20 (80) 5 (25)
(0.1)*
10 5 10 0.1*
Rata 5 (20)
(40) (10) (20) (0.2)*
() Volmenes mximos
- No ms de 2 inoculaciones IM por da
- No ms de 2 3 inoculaciones SC por da
- IV : no exceder 4% volumen circulante (bolus) o 4 ml/kg/h en perfusin
Anexo 2
Se recomienda un rango de pH de trabajo de 4,5-8 (Waynforth and Flecknell, 1992) teniendo en cuenta que el
grado de tolerancia de pH para las diferentes vas de administracin es:
Va oral > Va intravenosa > Va intraperitoneal > Va intramuscular > Va subcutnea Va

intradrmica
El pH, por s solo, no es un indicador suficiente del potencial irritante ya que la irritabilidad depende tambin
de la concentracin y del punto de ionizacin (pK) del compuesto. Estos factores, as como la solubilidad,
biocompatibilidad, viscosidad y esterilidad, debern ser valorados antes de proceder a la inoculacin del
compuesto en cuestin por cualquiera de las vas mencionadas.
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Referencias
1. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and
volumes. Karl-Heinz Diehl, Robin Hull, David Morton, Rudolf Pfister, Yvon Rabemampianina, David
Smith, Jean-Marc Vidal, Cor Van De Vorstenbosch . J Appl Toxicol 21 15-23, 2001.
2. Refining procedures for the administration of substances. Report of the BVAAWF/ FRAME/ RSPCA/
UFAW joint working group on refinement. D.B. Mortom, M. Jennings, A. Beckwell, R. Ewbank, C.
Godfrey, B. Holgayte, I. Inglis, R. James, C. Page, I. Sharman, R. Verschoyle, L. Westall and A.B.
Wilson. Laboratory Animals 35, 1-41, 2001.
3. Working with the Laboratory Mouse. American Association for Laboratory Animal Science.
http://www.aalas.org
4. http://labanimals.stanford.edu/Guidelines
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A. Tcnicas de obtencin de muestras

1. A Extraccin de sangre de vena mandibular

B. Tcnicas de inoculacin de muestras

Tcnica n1.A Extraccin de sangre de Vena Mandibular

Tcnica n2.A Extraccin de sangre de Seno Retro-orbital

1. Una vez anestesiado el ratn y comprobado que se ha alcanzado el plano quirrgico,

Tcnica n 3. A Biopsia de cola

Anestesia: En funcin de la edad y seccin de cola que se quiera obtener.

1. La longitud mxima a cortar es de 5 mm. De este fragmento se obtienen unos 50 g de

Tcnica n4. A Marcaje por muescas en orejas

- Las decenas se marcan en la oreja izquierda del ratn siguiendo la misma

Tcnica n 5. A Perfusin in vivo

Anestesia: Requerida. Ketamina / Xilacina (150mg/kg : 10mg/kg), Avertina, Pentobarbital etc

hasta alcanzar la aorta clampando la aguja a este nivel segn se ve en el esquema

6. Realizar una incisin en la aurcula derecha para permitir el escape de la circulacin de

Tcnica n 1. B Inoculacin Subcutnea (SC o SQ)

Tcnica n 2. B Inoculacin Intraperitoneal (IP)

1. Con el ratn correctamente inmovilizado (evitando cualquier movimiento durante el

Tcnica n 3. B Inoculacin Intramuscular (IM)

Tcnica n 4. B Inyeccin Intradrmica (ID)

Anestesia: No requerida, pero facilita el procedimiento.

1. La aguja debe ser mantenida casi paralela a la superficie de la piel y avanzar

Tcnica n 5. B Inoculacin Intravenosa (IV)

1. Antes de realizar la inyeccin es conveniente inducir la vasodilatacin de la vena para

3. Si aparece sangre al aspirar, la colocacin de la aguja ser la adecuada. De todas formas

Tcnica n 6. B Inoculacin en Almohadillas Plantares

Anestesia: Puede ser requerida si la inoculacin la realiza una nica persona.

Tabla I. Volmenes de extraccin de sangre.

Tabla I.A. Volmenes de extraccin referidos a Vc (volumen circulante)

Extraccin nica Extracciones mltiples

Perodo de % Vc extrado Perodo de

7.5 % 1 semana 7.5 % 1 semana

Vc: Volumen circulante

Tabla I.B. Volmenes de extraccin referidos a Vt (Volumen total)

Vt: Volumen total: aprox. 6% del peso (en ml)

Tabla II. Volmenes de inoculacin.

Rutas y volmenes de administracin

Va oral > Va intravenosa > Va intraperitoneal > Va intramuscular > Va subcutnea Va

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