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Protocolos Cruzamentos

Manuteno de Linhagens

Em determinados perodos feita a transferncia de Drosophila de uma garrafa para outra (repique).
Com 2 frascos em mo, um contendo a cultura antiga e as drosfilas e outro contendo o meio de cultura novo (o
frasco com a cultura nova deve estar devidamente "rotulado", contendo informaes sobre o cruzamento e data
de feitio), sobre amortecedores, as rolhas dos respectivos eram afrouxadas, o frasco com o meio de cultura novo j
sem rolha ficava deitado em uma das mos, apontado em direo ao frasco com o meio de cultura antigo, que
seria batido contra o amortecedor, com a finalidade das moscas carem (se afastarem da rolha). Logo em seguida
a rolha era removida e o frasco rapidamente deitado unindo-se as aberturas de ambos os frascos. Ento os frascos
eram posicionados na vertical, sendo que o frasco com a cultura nova ficava embaixo. Eram ento batidos
cuidadosamente para que as moscas da cultura antiga cassem em direo ao frasco com a cultura nova. Logo
aps a ltima pancada mais firme, as rolhas eram colocadas em seus respectivos frascos. O processo para se
eterizar as moscas realizado de modo semelhante, apenas sendo o frasco com a cultura nova substitudo pelo
frasco eterizador.

Eterizao
Tanto para transferncia de frasco quanto para a anlise das moscas, necessrio que estas sejam
eterizadas.
O eterizador um frasco semelhante queles que contm o meio, mas utiliza-se neste tampas plsticas que
possuem dois orifcios tampados com algodo. Num dos algodes colocado ter para anestesiar as moscas
adultas, enquanto o outro mantido seco como passagem de ar.
Para transferir as moscas para o vidro eterizador, primeiro bate-se o frasco que contm as moscas em
uma superfcie no muito rgida, como um pedao de borracha, com a finalidade de que estas no fiquem muito
prximas abertura da garrafa e escapem no momento da retirada da tampa. Deve-se tomar o cuidado de no
bater muito forte para que as moscas no grudem no meio de cultura. Imediatamente aps as batidas, retira-se a
tampa e coloca-se o eterizador invertido (destampado) sobre a garrafa com moscas, de modo que as aberturas
fiquem unidas.
Por apresentarem fototropismo positivo, as moscas iro subir naturalmente para o eterizador. Para
acelerar este processo, pode-se utilizar uma fonte de luz artificial prximo deste. Aps a passagem do nmero de
moscas desejado, separa-se os fracos, tampando-os imediatamente. O primeiro frasco a ser tampado o de baixo,
pois, como j foi dito, as moscas apresentam fototropismo positivo e tendero a sair voando primeiro pela
abertura deste.
As drosfilas devem ser deixadas no eterizador tempo suficiente apenas para que adormeam, cerca de 3
(trs) minutos, pois a exposio prolongada ao ter pode causar sua morte, o que acarreta modificaes
morfolgicas no animal ou dificuldade para a observao de certos caracteres. As moscas anestesiadas devem ser
colocadas sobre papel filtro ou outra superfcie adequada para observao na lupa. Se forem eterizadas muitos
exemplares de uma s vez, necessrio colocar sobre elas um funil invertido contendo algodo com ter vedando
o orifcio de menor dimetro, para que estas no despertem durante a observao.

Cruzamentos e coleta dos dados

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Inicialmente so eterizadas as moscas adultas de um frasco contendo os padr~pes que sero estudados.
Utilizou-se fmeas em fase de pupa para garantir que elas j no estivessem fecundadas, devendo ser escolhidas as
pupas cujas asas estejam visveis, pois isto indica que estas no estavam vazias ou portando indivduos mortos,
sendo estas posicionadas na parede lateral de um frasco contendo o meio de cultura. As demais moscas adultas
eterizadas so descartadas.
Os machos e as fmeas escolhidos sero utilizados para o cruzamento parental. Para identificao dos
frascos, so colocadas informaes sobre a equipe responsvel, o cruzamento feito e a data de incio do
cruzamento, que a de insero dos indivduos.
Depois de 7 a 10 dias, a gerao parental retirada do frasco para que esta no venha a se cruzar com a
gerao F1 (resultado do cruzamento entre os parentais), que estava em estgio larval. importante que se
verifique sob lupa as caractersticas dos pais, para confirmar o tipo de cruzamento realizado.
Os animais observados devem ser descartados. Esse perodo de 7 a 10 dias mantido para os repiques dos
prximos frascos, devido ao fato deste animal apresentar um ciclo de vida de 10 dias. Se este limite de tempo for
ultrapassado, a nova gerao corre o risco de cruzar com a anterior (no caso, a parental) aps desenvolver-se em
adultos.Quando os indivduos da gerao F1 atingiram a maturidade, devem ser repicados para o frasco A.
O repique a mudana das moscas de um frasco para outro sem eteriz-las. Alguns deles podem ser
eterizados e examinados para a verificao de suas caractersticas, sendo posteriormente descartados. Aps o
aparecimento de larvas no frasco A (F2), a gerao F1 repicada para o frasco B.
A partir de ento, conta-se o tempo para o desenvolvimento dos adultos de F2 no frasco A para que estes
possam ter seus fentipos observados e anotados. Da mesma forma, transcorrido o tempo necessrio, feito o
repique do frasco B para o C e, posteriormente, do frasco C para o D, com a anlise da gerao F2 do frasco B e
C. Todos os animais analisados so descartados. Se o nmero de indivduos analisados insuficiente (o ideal de
aproximadamente 350), deve-se proceder anlise dos animais do frasco D. medida que as observaes so
feitas, o resultado do nmero de indivduos deve ser tabulado de acordo com as suas caractersticas individuais.
A observao de cada mosca feita sob lupa e as anotaes so feitas de acordo com suas caractersticas
para as mutaes, individualmente, aps eterizao. Para cada observao, so tabelados: um nmero para o
indivduo, seu sexo, suas caractersticas para cada mutao e o observador responsvel.

Um Cronograma de Atividades
Perodo 1 Execuo do cruzamento parental
Retirada da gerao parental (verificao para confirmao das caractersticas dos
Perodo 2
pais)
Perodo 3 Repique de F1 para o frasco A e observao das caractersticas de F1
Perodo 4 Repique da gerao F1 do frasco A para o frasco B
Repique da gerao F1 do frasco B para o frasco C. Contagem e anlise da gerao
Perodo 5
F2 do frasco A
Repique da gerao F1 do frasco C para o frasco D. Contagem e anlise da gerao
Perodo 6
F2 do frasco B
Retirada da gerao F1 do frasco D (conferir caractersticas). Contagem e anlise
Perodo 7
da gerao F2 do frasco C

Cuidados Especiais
Depois de 7 a 10 dias, necessrio retirar a gerao parental do frasco para que ela no cruze com sua F1, sendo
necessrio para isso o repique.

importante que as datas estipuladas para observao das caractersticas e repicagem sejam respeitadas.
Qualquer falha neste processo pode resultar em retrocruzamentos que mascaram o verdadeiro resultado.

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