Electroforesis Capilar (CE).

Bases de Electroforesis Capilar.

1
Qu es la Electroforesis?

Es el movimiento de una
molcula cargada debido a
-
un campo elctrico externo,
es decir, si se coloca una +
muestra inica y le es
+
aplicado un potencial, sta
tender a dirigirse hacia el
polo opuesto a su propia
carga.

Movimiento de una molcula cargada

debido a un campo elctrico externo.

2
 qE = fv
Fuerza de Fuerza de
aceleracin friccin
q
v= E E
q = carga del ion
f
E = campo elctrico
f = coeficiente de friccin La movilidad electrofortica es la
v = velocidad del ion constante de proporcionalidad entre la
velocidad del in y la fuerza del
campo elctrico.
5

Separacin dentro de tubos capilares.

3
 Un poco de Historia
Es una tcnica relativamente
nueva, el primer instrumento
comercial apareci en los aos
80s.

La EC experiment desde su
aparicin un crecimiento muy
importante, situndose rpidamente
para el anlisis de una gran
variedad de muestras, compitiendo
en la mayora de ellas con las
tcnicas de mayor tradicin
analtica como HPLC y CG. 7

Principales Caractersticas de
CE.
Se desarrolla en un capilar de slice fundida
(i.d. 25-150 m).

Opera en medio acuoso (aunque actualmente se

est desarrollando en solventes orgnicos
polares [NACE]).

4
Principales Caractersticas de
CE.

Se requieren volmenes muy pequeos de

muestra (1-50 nL inyectados).

A travs del capilar son aplicados altos voltajes

(10 a 30 kV) y campos elctricos (100 a 1000 V
cm-1)

Principales Caractersticas de
CE.
La alta resistencia del capilar limita la
generacin de corriente y el calentamiento
interno.

Presenta alta eficiencia (N>105 a 106) y tiempos

de anlisis cortos.

Tiene numerosas modalidades y un amplio

rango de aplicacin.
10

5
Principales Caractersticas de
CE.
El desarrollo del mtodo es muy simple.

Instrumentacin automatizada.

La deteccin se puede llevar a cabo de 2

formas:
On-capillary.
Decoupled detection cell.

11

Instrumentacin.

6
 13

Principio de CE.

14

7
Mtodos de Inyeccin de Muestra.

Inyeccin Hidrodinmica.
15

Mtodos de Inyeccin de Muestra.

Inyeccin Electrocintica.
16

8
Mtodos de Inyeccin de Muestra.

Inyeccin por Vaco.

17

Mtodos de Inyeccin de Muestra.

Inyeccin por Sifoneo.

18

9
 Cmo detecto las especies?
19

Flujo
Electroosmtico
(EOF)

20

10
 Superficie de Slice fundida
cargada negativamente.
21

Los cationes hidratados se acumulan

cerca de la superficie.
22

11
El flujo va en direccin hacia el ctodo
cuando se aplica el campo elctrico.
23

EOF
EOF

24

12
Flujo electroosmtico Flujo parablico
Caractersticas:

CE GC, HPLC

Menor ancho de banda Mayor ancho de banda 25

Caractersticas:

La velocidad del EOF es mayor a

la movilidad de cualquier especie,
independientemente de su carga.

26

13
Separacin por Electroforesis Capilar

27

Electroferograma
Seal

Tiempo de migracin (min)

28

14
Modos de Operacin de EC.

Modo de Operacin Bases de la Separacin.

Electroforesis Capilar de Solucin Libre/relacin

Zona (CZE) masa carga.
(FS/ capilares fundidos)
Cromatografa Micelar Hidrofbicas/ interacciones
Electrocintica (MEKC) inicas con
micelas/retardacin.
Electroforesis Capilar en Tamao y Carga
Gel (CEG)

30

15
 Modo de Operacin Bases de la Separacin.

Electroforesis de Enfoque Punto Isoelctrico.

Isoelctrico (IEF)

Isotacoforesis (ITP) Movimientos Frontera

Electrocromatografa Interaccin con fases

Capilar (CEC) slidas/retardacin.

31

Electroforesis Capilar de Zona

s M
m dif igra
r ma
e EC ere ci
nci n p
F o le d ad o
si m p ec r
arg
a.

32

16
 Mecanismo de Separacin por
Electroforesis Capilar de Zona

Desarrollada en capilares de slice descubiertos y

permanentemente o dinmicamente en capilares
cubiertos.
33

Cromatografa Micelar Electrocintica.

CE + Crom. = MECK

Caracterstica: separa especies neutras

s
vo
acti C
so CM
en
d e t e su
n d
d ici rriba N
N

A or a
p N N

N
N

34
CMC=concentracin micelar crtica

17
 Electroforesis Capilar en Gel

Basada en la Separacin
Electroforesis en Gel basada en el
convencional. tamao.

Capilar relleno con Algunas protenas y ADN

polmero, acta como tienen masa/carga similares
tamiz molecular. deben separarse por CGE.

35

Electroforesis de Enfoque Isoelctrico

Separacin Generacin
basada en el de un gradiente
Punto Isoelctrico. de pH

36

18
Electroforesis de Enfoque Isoelctrico

Separacin Generacin
basada en el de un gradiente
Punto Isoelctrico. de pH

pH
37

Electroforesis de Enfoque Isoelctrico

Separacin Generacin
basada en el de un gradiente
Punto Isoelctrico. de pH

pH
38

19
Electroforesis de Enfoque Isoelctrico

Separacin Generacin
basada en el de un gradiente
Punto Isoelctrico. de pH

pH
39

Electroforesis de Enfoque Isoelctrico

Separacin Generacin
basada en el de un gradiente
Punto Isoelctrico. de pH

pH
40

20
Electroforesis de Enfoque Isoelctrico

Separacin Generacin
basada en el de un gradiente
Punto Isoelctrico. de pH

41

Instrumentacin.

21
 Electrolitos

Reservorios Fuente de poder

Muestras

Capilar Sistema de deteccin

43

Detector
Control
150 mV
PC
Capilar O FF
ON

+ -
ON

OFF

Muestra
Electrolito Electrolito Fuente
de poder
44

22
 Capilares

Composicin (Slice).
Dimetro interno (25-75 m).
Longitud (30-75 cm).
Modificados.
Control temperatura.

45

Detectores

UV-VIS Fluorescencia
Diseo especial Fcil adaptacin
Deteccin Universal Alta sensibilidad
Amplio intervalo Derivatizacin
DAD

46

23
 Detectores

Espectrometra Masas

Problema de interfase (electro-spray)

Caracterizacin absoluta
Verstil

47

Aplicaciones.

24
 Separaciones quirales

Biociencia

Medioambiente

Alimentos

Industria

49

Separaciones Quirales.
Gran importancia en Farmacia y Alimentos

Tradicionalmente se realizan por HPLC y GC

D,L aminocidos

Frmacos

Ismeros

50

25
 Biociencia
Gran cantidad de aplicaciones.
Pptidos y protenas (caracterizacin, secuenciacin, pI,
etc.)

cidos nucleicos y pruebas de pureza

Drogas, frmacos y metabolitos (tabletas, inyectables,

etc.)

Forense (LSD, morfina, cocana, plvora, etc.)

51

Medioambiente

Variedad de anlisis medioambientales:

Aguas (ros, lagos, lluvia, potable, residuales, etc.)

Suelos (cultivos, lixiviados, suelos varios)

Ejemplos de aplicaciones: cidos orgnicos, colorantes,

sustancias hmicas, pesticidas, iones inorgnicos,
aminas, tensoactivos, cidos aromticos, etc.

52

26
Alimentos
Muestras analizadas:
Aguas
Frutas
Bebidas refrescantes
Bebidas alcohlicas
Leche y productos lcteos
Pescados y mariscos
Carnes
Hortalizas y vegetales
Cereales
Y ms... 53

Alimentos
Sustancias estudiadas:
Iones inorgnicos (sodio, potasio, calcio, magnesio,
cloruros, fosfatos, citratos, etc.).
cidos orgnicos (maleato, citrato, acetato, lactato,
ascrbico, etc.)
Otros compuestos Orgnicos (cafena, histaminas,
pesticidas, azcares, edulcorantes artificiales, etc.)
Protenas (Suero de leche, queso, preparados
protenicos, etc.)
54

27
 Industria

Diversas reas de aplicacin: materia prima, control

de calidad, aguas residuales, etc.
Caracterizacin de polmeros

Compuestos sintticos

Contaminantes

Se incluyen las aplicaciones anteriores

55

50.0

OTC
45.0
pKa 3

R1 R2 CH3 R3 N(CH3)2
40.0 T DT
H
OH pKa 1

NH2
35.0
OH
OH O OH O O
pKa 4 pKa 2
30.0
Abs (mU.A.)

25.0

20.0 (Orina dopada)

15.0 Nombre comn R1 R2 R3

10.0
(Estndar) Tetraciclina -H -OH -H
Oxitetraciclina -H -OH -H
5.0 (Orina)
Doxitetraciclina -Cl -H -OH
0.0
6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5
Tiempo (min)

56

28