UNIVERSIDAD CATOLICA DE SANTA MARIA

FACULTAD DE CIENCIAS FARMACEUTICAS BIOQUIMICAS Y BIOTECNOLOGICAS

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA BIOTECNOLOGICA
ENZIMOLOGIA
TECNICAS DE DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
DOCENTE: PAZ ALIAGA IVAN
ALUMNO: MOLER VALENCIA ROBERTO
VI SEMESTRE
 TCNICAS DE DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

OBJETIVOS
Diferenciar los diferentes mtodos existentes para la determinacin de
la actividad enzimtica (continuo, discontinuo)
Describir las tcnicas para determinar la actividad enzimtica y ponerlas
en practica
Diferenciar las tcnicas ms adecuadas para la determinacin de
enzimtica de una enzima y saber explicarla

MATERIALES Y METODOS
-Tubos de ensayo
-Bao maria
-Beakers
-Plancha
-Pastilla magntica

REACTIVOS
-Buffer fosfato 0,05 M
-Urea 0,3 M
-Ureasa
-EDTA 0,05 mM
-Reactivo de NESSLER
-Agua destilada
EQUIPOS
-Agitador magntico
-Bao mara
-Potencimetro
-Voltmetro
-Fotocolormetro

METODOS
1) Determinacin de la actividad enzimtica de ureasa utilizando tcnica
qumica discontinua
En un tubo de ensayo coloque 2,4 ml de buffer fosfato 0,05M pH 7,4 adicione
0,4 ml de solucin de urea 0,3M, mezcle bien y retire una alcuota de 0,2 ml a
otro tubo de ensayo. Pre-incube el tubo madre por 5 minutos como mnimo a
38C.Sin retirar el tubo del bao mara, adicione 0,3 ml de una solucin de
ureasa que contiene 5,0 mg de la enzima por ml., disuelta en buffer fosfato
0,05M pH 7,4 EDTA 0,05mM. Mezcle bien y vuelva a incubar (ese instante
constituye el tiempo cero).
Retire muestras de 0,2 ml cada 3 minutos (unas 5 muestras) y realice con ellas
(as como con la primera alcuota) una determinacin de amonio de acuerdo al
siguiente esquema: Prepare 6 tubos de ensayo previamente, conteniendo cada
uno de ellos 4,3 ml de agua destilada y 0,5 ml de reactivo de Nessler.
Enumrelos. Recepcione en estos tubos los 0,2 ml que vaya retirando de la
muestra de incubacin. Mezcle bien y deje en reposo a temperatura ambiente
por 10 minutos.Cumplido el reposo, lea sus absorbancias en el
espectrofotmetro a una de 420nm o en el fotocolormetro usando filtro azul.
El tubo blanco lo constituye la primera alcuota
2) Determinacin de la actividad enzimtica de ureasa tcnica electroqumica
continua
En un beaker de 50 ml, coloque 30 ml de solucin de urea 0,03M Ponga el
recipiente sobre un agitador magntico e introduzca en l, el electrodo de un
conductmetro, teniendo la precaucin de que no choque con el imn giratorio.
Asimismo, introduzca en el recipiente el electrodo de un pH metro; fije ambos
electrodos con soportes universales. Verifique que el imn del agitador no
golpee a ninguno de los dos electrodos y que el nivel del lquido dentro del
beaker sea suficiente para una correcta medicin de la conductividad y del pH;
si no es as, puede agregar un poco de agua destilada.
Adicione en forma rpida y en plena agitacin, 10 mg de ureasa (pulverizada
previamente en un mortero); ese instante viene a ser el tiempo cero, determine
en este, el pH y la conductancia. Se trabaja a temperatura ambiente. A partir del
tiempo cero, mida pH y conductancia cada 30 segundos por unos 8 minutos.

RESULTADOS
Experimento 1
Tabla 1. absorbancia por tiempo de incubacin
N de tubo Blanco 1 2 3 4 5 6
Tiempo de - 3 min. 6 min. 9min. 14min. 19 min. 24min.
incubacin
Absorbancia 0,26 0,45 0,46 0,415 0,443 0,303

EXPERIMENTO 2
Tabla 2. conductancia y ph por tiempo de incubacin
 Tiempo de Conductancia ( pH
incubacin ( en Siemens)
segundos)
0 308 6,89
30 323 7,32
60 348 8,12
90 357 8,26
120 376 8,47
150 385 8,60
180 401 8,69
210 416 8,76
240 435 8,81
270 443 8,85
300 447 8,89
330 472 8,92
360 487 8,94
390 501 8,96
420 513 8,98
450 518 9,00
480 542 9,01

DISCUSION Y CONCLUSIONES
Las Funciones de las enzimas, se entrelazan y se pliegan una o ms cadenas
polipeptdicas, que aportan un pequeo grupo de aminocidos para formar el
sitio activo, o lugar donde se adhiere el sustrato, y donde se realiza la reaccin.
Una enzima y un sustrato no llegan a adherirse si sus formas no encajan con
exactitud. Este hecho asegura que la enzima no participa en reacciones
equivocadas.
Dentro de los Factores que incluyen las reacciones enzimticas tenemos:
Cambios en el pH, Cambios en la temperatura, Presencia de cofactores, Las
concentraciones del sustrato y de los productos finales, Activacin, Costes,
Disponibilidad
BIBLIOGRAFIA