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U N I V E R S I D A D D E SUCRE:
F A C U L T A D DE E D U C A C I N Y C I E N C I A S
D E P A R T A M E N T O DE B O L O G A Y Q U M C A
LABGa4TORfQ:D B O Q U M I C A
PROT^ESOI^: R A B O N L 0 2 A D A D E V I A

PRCTICA mm

ACTIVIDAD ENZMJICA Y FACXQRS QUE LE AFECTAN

1, RfARCO TERICO : - - - " r

t.1. Defincfn .
Las- reacciones bioqumicas- se realizan con- gran, rapidez por intermedio de catalizadores naturales
sfenommados snz/mss, Ei alio grado de especificidad y ia gran eficiencia de las enzimas hace que mediante
reacGionessecusnciales definidas se efectan transformaciones de compusstos Qignicos. Las enzimas estn
aniversamente presentes en los organismos vivos, y (a existencia de reacciones metablicas comunes a todas
3S, culas xeeja Ja .espedficidad'de las enzimas responsables

Hast3 1926, todos los estudip? qye m realizaron sopre as ^nzimas iban dirigidos al conocimiento de sus
efectos; osea, las enzimias se caracterizaban de acuerdo con las reacciones qumicas que catalizaban. Debido
.3 su .capacidad de .cristalizacin, jas .enzimas ban sido iambla invassgadas desde .punto de vlsa
reracionadocon ta qumica de las pnDtenas.. Desde Juego,, e avance de ios conocimientos, actuales sobre la
qumica de tas protenas y sus procesos metablicos ha venido del estudio de la naturaleza y mecanismos de
de i'as enzimas.

Una- parte importante det estudio- de tas clulas-vivas- est hoy d^dedicado a las erhzimas, puesto que todas las-
funciones fisiolgicas, por ejemplo, la contraccin muscular, la transmisin nerv^iosa y la excrecin renal, as
com.o la misnia vida e-sta inexQrable.m.e.rit9 llnadas a Ja actjvi^ad.de las .8,nzl.mas. Un proceso complejo, tal
<x>m0- a eontraccn muscular, que requiere la utilizacin de energja, puede distribuirse dentro de una serie de
{^acciones catalizadas por enzimas. Muchas de estas reacciones han sido ahora estudiadas "in vitro" mediante
.sstgmas .aislacos .ttizando .enzimas p,ucgs cristalizadas.

1.2. Naturaleza general de as enzimas

-5 til c,Q.nslcie-rar las propiedades generaJas de las enzim-as-.

Todas las enzimas son protenas

Se desconocen catlisis biolgicas de naturaleza no proteica. Las catlisis no proteicas incrementan la
.velocidad de las isacciones qumicas, y .unas po.oas ,altera-h las veiocidades en un rango sLmllar a! ejercid.o por
)s enzimas, pero estos casos no se han encontrado en los seres vivos. l.as enzimas presentan tamaos
considerablemente vanabes, habindose descrito que el peso molecular de unas cuantas es tan pequeo como
10'*. Qerieralmente son jns grandes, .pscilado .su p,eso .molecular ,8nt.re .1.5 x lO" y 10. Corno todas Jas
protenasV las ervzimas-son lbiles- y pierden: su- actividad si se desnaturalizan-.

%J.2. Las ^nzin??,s . ^ ^ ^ r g o J yelpcidad d s ia xsaccis quniisa, psr.o no ,SJS .consiimer. .duraats .&!
proceso,
t a eficiencia de as enzimas es extremadamente alta; una molcula de enzima puede catalizar la
feasfQrm.3C.in,(l8 una a 10 isoiculas .ds sustrato p.or irJnuo.

1.2.3. Las ertifnTas presentan uii alfo grado de specrficdacf para s a sustrato
Algunas enzimas catalizan una reaccin con solamente un conjunto simple de reactantes. As la fumarasa
ESafza la lrierGG^".'^rsin.deKfum3F^^^^
 2

OH CO2
\ "
-OaC-CHa-C-GOa" CH=CH + H2O
/
H -O2C
L-Maiao Fumarao

Ni ei ivialeato, que es el esiereoismero en cis del fumarato, ni el D-maiato son sustratos. Otras- enzimas
presentan un rango ms amplio de especificidad. Por ejemplo, cada enzima proteoltica hjdroliza enlaces
pep.dicos, pero es .especfica pa.ra enlaces formados por aminocidos con diferentes g.rupos R. E.stas enzimas
muestran tambin una estricta estefeospeGifieidad-, al igual qbe la-fumarasa, y catalizan la hidrlisis de enlaces-
peptdicos fonmados solamente por L y no por D-am,inocidos. Las enzimas tambin son especficas para el tipo
ts reacciones que catalizan, as Ha fum.a.rasa cataliza ia hid.'-atacin o deshidratacin de sus sustratos; l3.s
enzirnas proteoliticas- catalizar? una reaccin hidroltica- y no catalizan otras posibles reacciones- de sus
sustr3'tos; por ejemplo, reacciones de oxido-reduccin o descarboxilacin. Sin embargo, algunas enzimas tienen
un .'ango ms amplio de especificidad, as muchas 8nzim=.3s prot80iiG.3s tambin catalizan .hidr-sis de steres .
Gtioteres.

1.2.4. La catlisis enzlmfca i.nyoiue.ra la formacin ds un complejo intermedio entre la enzi.rna y su

sustrato o sustratos

Ls inequvoc-a demo-Stracin de la form,3c.in de com.plejos snzima-sust.F-ato co.m>o i.nte.rnnediarios en las

reacciones- catalizadas por. eE>zimas fue ei mayor avance de la bioqumica.-Varios: investigadores.sugirieron su
existencia, pero quiz ninguno ms elocuente e incisivo que Emil Fischer en 1890, cuyos experimentos con
glueocidas-as indicaron que e.s.as snzim.as sonalam-ente esereoaspecficas respecto a sus susratos. El sugiri
una especificidad simiar en fa estructura de las enzimas, la cual podra solamente explicarse si reaccionasen.la
enzima y.el sustrato. .Su-s hlpte-sis han ..sido a.mp!3msn.t8 ci.adas.

Los estudios de todos los estudios posteriores han estado de acuerdo con la formacin de un complejo enzima-
sustrato como intermediario de fa accin enzimtica; dichos estudios han incluido anlisis cinticos,
snodlficacin quniica mediante reactivos aspecfIxQs ds grupos R, inijibicin de !a sn2}sra por compuestos
especficos- que interaccionan con el centro activo, determinacin de las caractersticas espectrales de las
bandas de absorcin cuando la enzima acta sobre su sustrato y cristalografa con rayos X de las enzimas que
se. yma M ,(^jmpst0p .estructurales .semeianteis , ..ss suraips.

1.2.5. La regin de una enzima tjue interaccion especficamente con el sustrato se denomina centro
sctivo
La conformacin e- .una e.nzima es ta! que ciertos grupos R dei. .8.-gn!j.e].eto popepdico -ss .8r!cuenL':an en
yuxt^posicih formando una estructura altamente especfica que constituye el centro activo. La organizacin
espacial de las estructuras dei centro activo detenminara no solamente qu compuestos pueden encajar
esereosspscfjoamene en i ! , sino tambin ias,caractersticas 4 9 JS acontecirrenos posteriores qu8 conducen
a ta conversin ]del sustrato en producto. La unin del sustrato al centro activo puede ocurrir mediante la
foonacin de enlaces especficos no covalentes, incluyendo enlaces hidrofbicos, interacciones electrostticas y
pusn.es de hidrge.no. y.na ysz unido a este .sitio, el -sustrato se .aproxim.a a dete.nminados grupos especficos de
la enzima, tos cuales desestabilizan cooperativamente ciertas uniones del sustrato, hacindolas ms reactivas
fju.rnicamsnte. Muc-ias yec-es se fo.Tna un .enlace c^iyalenie transito-ric entre ei su-strao y la enzlm,3.

1.2.6> Las enzimas disminuyen la energa de activacin requerida por una reaccin qumica
Un conjunto de molculas tienen, a temperatura constante, una energa cintica que se distribuye entre las
lismas como lo puede .mo-s.r.af .una curva parabUcs.. A .uria tempe-ratur-a Ti, si conjusito .d.s m^lcuias tiene una
energa insuficiente para dar lugar a una reaccin qumica especfica, pero s la temperatura se eleva a T2, ia
distribucin de la energa da lugar a.cambios como se podran mostrar en un.grfica. A la tennperaura T2 ^ay
gngrrtfa suficiente .na.ra Ir!.crefr!en-3r ,8i n.m.ero ds c-oLi-sion^s .entre las m.olculas, lo que da Jugar a la ra-accin
QrTTGa Por annf Guando grnperaura paga de Ti a J-.., s! incremento de ig yeiociaad .de la rsaGcin .ss &}
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resuido de un incremento en el nmero de molculas activadas, o sea, aquella fraccin que posee la energa
de activacin requerida.

1.2.7. Algunas enzimas ayudan en iareguiacin de las velocidades de Feaccin

Los organismos vivos generalmente no influencian la velocidad de sus reacciones metablicas miediante
cami5!0-s de temperatura, ai pueden sabrevlvir a tem.peraturas altas. Por tanto, son necs-sarias las reacciones
catalizadas para que un procesa se realice con-
suficiente rapidez a la temperatura de un organismo. Sin embargo, si las reacciones biolgicas importantes
tuvis-ssn !uar .sin Gat-Usi-s, no p-odra ejsrc-erse ningn control -sobre sus velocidades. Si e! organism.o pierde el
control de la velocidad de sus reacciones qumicas, se pierde el mantenimiento de su estructura y funcin
norma!-y muere.

Hay numerosos mecanismos reguladores del metabolismo, algunos de ellos operan a nivel de la misma enzima.
Las sustancias que incrementan o decrecen la velocidad de las reacciones catalizadas actuando directamente
sobre una enzima se denominan efectores. Ellos ejercen su accin alterando la esiructu.ra ds la enzim-a de
frirra^qtre-sfo afecte a'a-vefoadatfderlaTeccin.

I.2.S. La amiiasa sa^va^

La amiiasa. salival acta sobre ios enlaces glicosdicos a-1,4. de polisacridos como la- amopectina. y ei
glicgeno. La hidrlisis es catalizada por el ion cloruro (C7 y oros hafijros. Los productos finales son fen su,gran
m.ayona ?,-malto.sa y pocas cantidades de giuco-sa y m.altotriasa. S puede considerar que ios enj.acss a-1,6 y
a-1,4 de la maltosa no son afectados apreciabiemente. La amiiasa al igual que la mayora de las enzimas se
ver afectada por c3,mbfos en el pH.

2. OBJETiVOS-
2.1. Determinar la actividad Peroxidasa del Hgado y de la. papa
2.2. Detennina!- los factores que afectan la actividad Pero.xida.sa ds hgado y de papa
2.3. Dstsnrnlnar laaclyiriad y los factores que afsfptanJa actiyidad gliccsidasa s la amiiasa saya!

3. MATEFUAUESXBEACTiyOS
3.1. iVTATERALES
Tubos de ensayo y gra.cii!a,.
Termmetro
Mo.rts.ro de porcelana
Beaker
Reloj*
Hielo*
Hgado fresco*
Papa frssca*

3.2rREeTiVOS
Agua oxigenada'
NaOHa20%'
Reactivo d Ben'dict
Solucin de almidn al 1 %
Solucin ds Hl ai 30%

NOTA: Los maeriales marcados con * debe traerlos el es-udiane.

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4. MTODO

4.1. A C C I N DE LAS PEROXDASAS D E L T G A D G Y DE LA PAPA

4.1.1. Tome dos tuijos de ensaya y agregue 2 nrrt de agija oxigenada a cada uno.. Tmete la'temperatura.
Antela.
4.1.2. .Ai tubo #1 .agregele u.n ped-azo ds hg-ado fresco, cuando vea cambio, m,slsiatsm.psr.3tura, Obse.r^^'e
durante' 5 minutos y repita ta temperatura.
4.1.3. Ai tubo #2 adicione a misma cantidad de hgado pero triturado en e! mortero. Tome ia temperatura-al
.momento ds rsaccionar. Observe 5 m.inuos. nots l-as obss.rvaciones. Sanue conclusiones.
4.1.4. Tome dos tubos de ensayo: Al tubo #1 colquele un pedazo de hgado frescO: Al #2 la misma cantidad
de hgado pero triturado. Introdzcalos en un bao de mara hin/iendo durante 5 minutos. SqueJos y
agre-gue a cad-a uno 2 m.i ds agua o.xigsnada.
4.1 Repita el procedimiento anterior utilizando agua- fra (pedazos de hielo).- Observe. Saque conclusiones.-
-4.1.6. Tome un tubo de ensayo^ colquele en su interior hgado triturado. Agregele 2 mi de solucin de
NaOH al 20%. Obsen/8 por 5 minutos, luego agrgusls 1 mJ ds agua o.xigsnada,
4,1.7. Repita-todos-los pasos anteriores-(1.2-,3.4i5,6) utilizando papa en trozos y-rallada-en-vez de hgado.

4.2.1. Tome 4tub0s.de ensayo, agregue, a. cada, uno 2 mJ.de.saliva

4.2.2. Al tubo #1 agregele 1 mide solucin de almidn al 1 % , deje en reposo a tsmiperatura ambiente por 5
minutos. Haga la prusba ds Bsnsdlct.
4.2.3. _ Al tubo.. #2..agregele 2. mi de. solucin. d,e. HCl. ai 3.0.%.. Observe durante. 2.minutos, hag.a. la prueba, d.e
Benedic
4.2.4. Al tubo #3 calisnts ha-sta hsn/ir, agregue 1 .mi ds .solucin ds aim-idn. Qbssn/e 5 .minutos, H-aga la
prueba de Benedict
4.2.5. En el tubo #4 agregele 1 m! de almidn y unas gotas de Benedict
.(Ds-spu-s ds agrsgar Bsnsdict sn cada caso caliente y obsep/e).

5 ; "PREQNTAS
.5,1, En cul ds los tubos dslaprim.er.a-pars seobser/aron bu.rbuj.as?
5.2, Qu gassefonn en la primera-parte?
5.3, Cul tubo present mayor reaccin? Por qu?
5.4, Qu pape! ds-ssmpsa.s!.hgadO-y-la-p3pa.en-lar8ac~oln?
5.5,-Cmo ata-et..agua;OxigQn.a.da?-
5.6, Haga un listado d enzimas que Ud, conozca con sus sustratos.
5.7-. Qu infiuencia-tubo.ia-tsmperatLira, HCl, NaOH-sobrs ta accin-cataltica?
5.8:. Se libera Calor en laS: reacciones enziniticas? Por qu?

6. BiBLIOQRAFA
6.1, ALEMANY, y . YFONT, S. PrcficaB,ds.Bi0quimica. d . Alhambra, Espaa, 1933.
6.2, AMARS, R, Y OTRO; Prcticas-de Bioqumica. Universidad de Antroquia Idiciones; MedellOi 1995
6.3, PLUMiVIER, D,T. Introduccin a la Bioqumica Prctica, McGraw Hill, Bogot, 1981
6.4, WH!TE, .A. Y OTROS. Principios ds Bioqumica. 6^. Ed, N4cG.r.3y>'JHi}!d8 .Mxico, 1985