Cromatografia lquida

de alta eficincia
O que cromatografia lquida?

A cromatografia fundamenta-se na migrao

diferencial dos componentes de uma mistura, o que ocorre devido
a diferentes interaes entre duas fases imiscveis, sendo uma
fase fixa que tem uma grande rea superficial chamada fase
estacionria, e a outra um fluido que se move atravs da fase
estacionria sendo chamada de fase mvel. Na cromatografia
lquida a fase mvel lquida! (LANAS, 1993; DEGANI; CASS;
VIEIRA, 1998).
 Principio da cromatografia lquida

AMOSTRA SOLVENTE

Coluna
Ao da
contendo fase
gravidade!
estacionria.

Tempo
Tipos de cromatografia lquida:

CROMATOGRAFIA LQUIDA

PLANAR COLUNA

CCD CP HPLC CONVENCIONAL

ADOSRO PARTIO INICA EXCLUSO

Primeiro, o que HPLC?
HPLC uma abreviao do nome em ingls : High Performance (Pressure)
Liquid Cromatography.

Historia da HPLC:
- Dcada de 60 : O comeo da HPLC como High pressure LC!
- Dcada de 70 : Com a melhora do material da coluna e da
instrumentao, HPLC passa a ser High Performance LC!
- Dcada de 80: A partir dessa dcada houve um boom do HPLC
- 2006- Evoluo da tcnica: UPLC, RRLC, UFLC...
Vantagens da HPLC
FE utilizada inmeras vezes.

Versatilidade: nico requisito a solubilidade na FM.

Tempo reduzido de anlise.

Alta resoluo.

Anlise qualitativa: tR , espectro de absoro no UV (DAD), MS.

Anlise quantitativa: desvios menores do que 5%.

Boa detectabilidade:

Absoro de UV-Vis de comprimento de onda varivel 10-10 g;

Fluorescncia: 10-12 g;

Automatizao
Limitaes da HPLC
Alto custo do instrumento

Alto custo de manuteno

Alto custo de operao

Falta de detector universal sensvel

ndice de refrao: baixa detectabilidade (10-6 g), pouco estvel.

Espectrmetro de massas: ~US$ 150.000,00

Necessidade de experincia no seu manuseio

Como um HPLC comercial?
Reservatrios dos
solventes e
sistema de
degaseificao.

Bomba.

Injetor.

Coluna.

Detector.
Instrumentao para HPLC
Instrumentao para HPLC
Reservatrio para a fase mvel

Filtro do reservatrio :
Captar a fase mvel e evitar que partculas suspensas na FM obstruam
os capilares ou contaminem a bomba.

Filtros de 10 a 40 um

Limpeza peridica!!
 Caractersticas da fase mvel
Ser de alto grau de pureza ou fcil purificao

Dissolver a amostra sem decompor seus componentes

No decompor ou dissolver a fase estacionria

Ter baixa viscosidade

Compatvel com o tipo de detector

Polaridade adequada para permitir a separao dos componentes da amostra.

Degaseificao da FM:

Garanti a reprodutibilidade da vazo

Estabilidade da linha base.

Mtodos de degaseificao

Ultrassom: Muito lento, pouco eficiente, requer agitao, em geral o

pior mtodo quando usado sozinho

Vcuo + ultrassom: Rpido, eficiente, refazer a cada 12 hrs.

Purga com Hlio: Contnuo, hlio razoavelmente caro, leva a

aumento de vazamentos, maior custo operacional .

Degaseificador on-line: Contnuo, remove o ar logo antes de entrar

na bomba, investimento alto inicial (melhor opo a longo prazo)
Instrumentao para HPLC
Sistema de bombeamento
Tm por finalidade enviar um fluxo constante e reprodutvel de FM para o
sistema cromatogrfico

REQUISITOS:

Ser de material inerte

Presses de at 6000 psi (~400 atm)

Vazo contnua, sem pulsos (ou, se pulsando, com amortecedor de pulsos)

Vazes de 0,1 a 10 ml/min (aplicaes analticas)

Controle de vazo e reprodutibilidade melhor que 1 %

Sistema de bombeamento

Tipos de bombas:

Pneumtica

Deslocamento

Recproca
Bomba pneumtica

Vantagens:

Baixo custo

Livre de pulsaes

Desvantagens:

Baixa presso (at 2000 psi)

Baixo volume

No permite gradiente

Vazo depende da presso de retorno e viscosidade da fase mvel

 Bomba de deslocamento

Vantagens:

Vazo independe da presso de retorno e viscosidade da fase mvel

Livre de pulsaes

Desvantagens:

Baixo volume

No permite gradiente
 Bomba recproca
Vantagens:

Presso elevada (at 10 000 psi)

Pequeno volume interno (35 a 400 L)

Permite gradiente

Desvantagem:

Fluxo pulsado

Alto custo
Sistema de bombeamento
Isocrtico :
+ A composio da fase mvel permanece constante ao longo da
anlise.
+ Capaz de separa um nmero limitado de analitos.

Gradiente
+ A composio da fase mvel varia durante a anlise.
+ Sistema aplicado com a polaridade dos compostos presentes
na amostra , muito diferente.
+ Separao de amostras complexas.
 Separao isocrtica e por gradiente

A eluio isocrtica feita com um nico solvente (ou mistura de

solventes). Se um solvente no propiciar uma eluio suficientemente
rpida de todos os componentes, ento pode ser utilizada uma eluio
por gradiente.
Com base nas eluies isocrticas foi elaborado o gradiente a seguir.
Instrumentao para HPLC
 Sistema de Injeo
INJEO MANUAL
- As amostras so introduzidas com seringas.
- Aps virar a ala, a amostra carregada pela fase mvel at o incio
da coluna.

AMOSTRADOR AUTOMTICO
- As amostras so postas em um frasco localizado
dentro do amostrador.
- O amostrador automtico :
1- Mede o volume correto para injeo.
2- Injeta a amostra.
3 Prepara o injetor para uma prxima amostra
Sistema de Injeo
Injetor Rheodyne Diagrama de fluxo
Bomba

Coluna

LOAD Bomba

Coluna
 Sobrecarga de Volume da amostra
Para aproveitar de todos os pratos que uma
colina possui, no se deve injetar um volume
maior que 1% do volume da coluna vazia.
(L)=(raio)2(comprimento)(0,01)
Instrumentao para HPLC
Coluna
Geralmente em ao inox ( mais popular, maior presso)
+ Coluna de vidro reforado (at 600 psi, utilizada para biomoleculas)
+ PEEK polmero ( biocompatvel e quimicamente inerte com a maioria
dos solventes)
+ Preo: > US$ 200.00
Tipos de colunas
+ Analticas : dimetro interno (i.d) 1,0-4,6 mm, comprimento 15 - 250
mm.
+ Preparativas: i.d 4,6 mm, comprimento 50 -250 mm.

A escolha de uma coluna apropriada o ponto crtico para o sucesso

da anlise.
 Pr-coluna

Localizada entre o injetor e a coluna

Colunas de 2 a 5 cm, i.d igual ao da coluna.

Mesma FE da coluna de separao.

Protege a coluna

Custo reduzido

Pr-coluna!
Coluna
Fase estacionria.
+ As colunas so recheadas com partculas porosas com dimetro
de 1,8 5 m.

+ Estas partculas porosas na coluna tm geralmente uma fase ligada

quimicamente sobre a sua superfcie, que interage com os componentes da
amostra para separ-los um do outro.
Condicionamento da Coluna

Necessrio para que haja um perfeito equilbrio

da FM e da FE.

Coluna nova: 4- 8 horas

Coluna parada h alguns dias: 2 horas
Coluna de uso dirio: 15 minutos.
Lembre-se: a coluna deve ser
guardada em solvente orgnico.
LC com fase quimicamente ligada
Sntese da FE.
Modos de HPLC

HPLC

Adsoro Partio Inica Excluso

Tipos de cromatografia lquida:
Adsoro:
O mecanismo de separao: competio entre molculas da
amostra e da fase mvel em ocupar os stios ativos da fase estacionria,
slido. (Slica)
Fase estacionria (polar) afetada com frequncia pela
reteno de molculas de alta polaridade como lcoois, gua.

Partio: (CLL ou CFL)

CLL: O mecanismo de separao: baseia-se nas diferentes
solubilidades que apresentam os componentes da amostra na fase
mvel e na fase estacionria.(slica purificada)
O maior inconveniente desta tcnica a solubilidade da fase
estacionria na fase mvel.
CFL: A fase estacionria est imobilizada por meio de ligaes
qumicas. (Normal ou Reversa)
Fase normal x Fase reversa
Fase normal:
fase estacionria polar;

fase mvel apolar (n-alcanos, clorofrmio, acetato de etila);

solutos neutros;

polaridade soluto t. reteno;

mecanismo reteno: adsoro

Fase reversa:
fase estacionria apolar;

fase mvel polar (tampes, gua, metanol, acetonitrila, THF);

solutos apolares, no-inicos;

polaridade f. mvel t. reteno;

mecanismo reteno: interaes apolares com radicais da coluna.

Fase Normal
Si-OH + R3SiCl Si-O-Si-(CH3)2R + HCl

OH Ciano (-C2H4CN)

Si R= Diol (-C3H6OCH2CHOHCH2OH)
silanol livre
Amina (C3H6NH2)
 CROMATOGRAFIA DE FASE
NORMAL
Polaridade do soluto: Nos trabalhos pioneiros usou-se
a > b > c fases altamente polares, como
Polaridade da fase mvel

gua e trietilenoglicol
adsorvidos sobre slica ou
alumina e solventes apolares,
c b a
como hexano ou ter
isoproplico, eram usados como
tempo fase mvel; por razes histricas,
este tipo de cromatografia
chamado de fase normal

c b a
tempo
Em fase normal, o componente menos polar elui primeiro, devido a sua
maior solubilidade na fase mvel; aumentando a polaridade da fase mvel tem
o efeito de diminuir o tempo de eluio
Fase reversa
 CROMATOGRAFIA DE FASE
REVERSA
Polaridade do soluto: a > b > c
Na cromatografia de fase reversa, a
Polaridade da fase mvel

fase estacionria apolar, um

hidrocarboneto por exemplo (C18), e a
fase mvel relativamente polar
a b c (gua, metanol, acetonitrila, etc)

tempo

a b c
tempo
Em fase reversa, o componente mais polar elui primeiro, devido a sua maior
solubilidade na fase mvel; aumentando-se a polaridade da fase mvel aumenta-se
o tempo de eluio
Efeito do comprimento da cadeia na
reteno.
Tipos de cromatografia lquida:
Inica:
A fase estacionria , normalmente, uma resina de poliestireno e
divinilbenzeno, a qual so ligados grupos inicos, como por exemplo,
-SO-3 trocadores fortes de ction
-CO-2 trocadores fracos de ction
-NR+3 trocadores fortes de nions
-NH2R+ trocadores fracos de nions

Os grupos inicos tm um contra-on (com carga oposta) que pode

ser deslocado pelos ons da fase mvel de carga similar a ele.

Excluso:
A separao efetuada de acordo com o tamanho efetivo das
molculas.
A coluna recheada com matria inerte cujos poros tm tamanho
controlado. Onde, as molculas menores penetram a maioria dos poros.
Instrumentao para HPLC
 Caractersticas de um detector

Sensibilidade e seletividade adequada

Ampla faixa linear

Baixo volume interno

Resposta Rpida

Boa estabilidade e reprodutibilidade

No destruir a amostra
 Caractersticas de um detector

Baixo volume interno

O volume do detector a regio do fluxo cromatogrfico ao qual o detector
responde.
Grande volume alargamento dos picos registrados.

Resposta Rpida

O sistema de deteco deve idealmente apresentar um sinal que represente

um exato instante de uma poro do caminho (volume do detector).

Detector lento picos deformados (baixo e largo) e com cauda longa.

 Caractersticas de um detector
Boa estabilidade e reprodutibilidade

Alta confiabilidade e facilidade de uso

No destruir a amostra para:

Permite coletar o eluato

Utilizar um segundo tipo de detector

 Detector por espectrofotometria UV-
visvel
Um feixe de luz ultravioleta dirigido atravs de uma clula de fluxo e um sensor
mede a luz que passa atravs da clula.

Quando um composto que absorve a energia da luz elui da coluna, ocorrer uma
alterao na quantidade de energia que incide sobre o sensor.

Essa alterao da quantidade de energia amplificada e dirigida para um

sistema de registro de dados.

Como resposta, um espectro de UV obtido, o que pode ajudar na identificao

de alguns compostos.
Detector por espectrofotometria UV-
visvel
Detector por espectrofotometria
UV-visvel
Detector por arranjo de diodos
Detector por arranjo de diodos
 Detector por espectrofotometria UV-
visvel

Princpio de operao Absorvncia de luz na faixa UV-visvel

tipo Seletivo, depende de propriedades do
composto
Min. quanti. detectvel 10-9
(g/mL)
Sensib. a temperatura Baixa
Sensib. a vazo da f. mvel No
til com gradientes Sim
Aplicabilidade Compostos que absorvem no selecionado
Detector por fluorescncia
Em comparao com detectores de UV-Vis, os detectores de
fluorescncia oferecem uma maior sensibilidade e seletividade, que
permite quantificar e identificar compostos e impurezas em matrizes
complexas em nveis extremamente baixos.

Os detectores de fluorescncia detectam apenas substncias que

apresentam fluorescncia.
Detector por fluorescncia
 Detector por fluorescncia

Excitao com luz produz emisso

Princpio de operao
fluorescente
tipo Altamente seletivo
Min. quanti. detetvel (g/mL) 10-9 (excitao a laser: 10-12)
Sensib. a temperatura Baixa
Sensib. a vazo da f. mvel No
til com gradientes Sim
Aplicabilidade Compostos ou derivados que fluorescem
Detector por ndice de refrao
A capacidade de um composto ou solvente para desviar a luz, fornece uma
maneira de detect-lo.

O IR uma medida da capacidade de uma molcula em desviar a luz em

uma fase lquida.

A quantidade de deflexo proporcional concentrao.

O detector IR considerado universal porm, pouco sensvel e sofre com a

variao da temperatura.
Detector por ndice de refrao
 Detector por ndice de refrao

Princpio de operao Mudana no ndice de refrao da fase mvel

Universal, depende de propriedade da f.

tipo
mvel
Min. quanti. detetvel (g/mL) 10-7
Sensib. a temperatura alta
Sensib. a vazo da f. mvel No
til com gradientes No
Aplicabilidade Geral
 Detector eletroqumico

Princpio de operao Oxidao ou reduo em potencial fixo

Seletivo, depende de propriedades do

tipo
composto
Min. quanti. detetvel (g/mL) 10-12
Sensib. a temperatura Mdia
Sensib. a vazo da f. mvel Sim
til com gradientes No
Aplicabilidade Espcies que oxidam ou reduzem
Detector por condutividade eltrica
 Detector por condutividade eltrica

Condutividade eltrica devida a presena de

Princpio de operao
ons
Seletivo, depende de propriedades do
tipo
composto
Min. quanti. detetvel (g/mL) 10-8
Sensib. a temperatura Mdia
Sensib. a vazo da f. mvel Sim
til com gradientes No
Aplicabilidade Solues aquosas com compostos inicos
E aqui termina a aula,
!!!!!
 Referncias bibliogrficas

http://hplc.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book/index.html

SKOOG, D. A., HOLLER, F. J., NIEMAN, T. A.

Princpios de anlise instrumental. 5. Ed., 2002.

COLLINS, C. H., BRAGA, G. L., BONATO, P. S.

Introduo a mtodos cromatogrficos.
WESTON, A., BROWN, P. R. HPLC and CE - principles
and practice. 1997.
 POLARIDADE DO SOLUTO
ESCOPO DA
CROMATOGRAFIA A
insolvel em gua solvel em gua
LQUIDO
no-polar inico
espcies MM>104: cromatografia polar no-inico
por excluso
102
espcies inicas de baixa MM: ADSORO PARTIO TROCA
cromatografia por troca inica INICA
fase fase
espcies pequenas e polares, 103 reversa normal
mas no-inicas: mtodos de massa molecular
partio (srie homloga)
espcies no-polares: 104
cromatografia por adsoro permeao
em gel
(ismeros estruturais,
hidrocarbonetos alifticos) 105 EXCLUSO

filtrao
em gel
106
aplicaes
Figura 28-1 Skoog p642 vp
 HPLC x GC
Comparao entre as caractersticas de GC e HPLC
Fator GC HPLC
voltil e termicamente
Requisito p/ amostra solvel na fase mvel
estvel
Tipos de amostra gases, lquido e slidos lquidos e slidos
Quantidade mnima
10-12 g (ECD) 10-9 g (UV)
detectvel
minutos at poucas minutos at muitas
Tempo de anlise
horas horas
Pratos tericos por
2.000-300.000 500-25.000
coluna
Capacidade analtica at 200 componentes at 50 componentes
Tempo de treinamento
cerca de 3 meses pelo menos 6 meses
do operador
 (a) (b)

(c) (d)