2.

MATERIAIS E MTODOS

2.1. Reagentes
o-nitrofenol---galactosideo (o-npg) Fluka Biochemika
Alginato de sdio de algas castanhas Fluka Biochemika
Carbonato de sdio (Na2CO3) Merck
Cloreto de clcio (CaCl2) dihidratado Merck
Di-hidrogeno fosfato de potssio (KH2PO4) Merck
Hidrogeno fosfato de potssio (K2HPO4) Merck
cido clordrico (HCl), 37 % Merck
Tris(hidroximetil)aminometano ((HOCH2)3CNH2) Merck
o-nitrofenol (o-np) Fluka Biochemika
cido slfrico (H2SO4) 95-97% Merck
Reagente de Bradford Coomassie G-250 BIO-RAD Protein Assay
cido dinitrosalicilico (Reagente DNS) Merck
Glucose monoidratada Merck
Reagente glucose oxidase/peroxidase Sigma-Aldrich
Reagente o-Dianisidina Sigma-Aldrich
Soluo padro de glucose Sigma-Aldrich
Leite UHT Gordo MIMOSA adquirido no Hipermercado
Continente do Seixal
Leite UHT Meio Gordo MIMOSA adquirido no Hipermercado
Continente do Seixal
Leite UHT Magro MIMOSA adquirido no Hipermercado
MATERIAIS E MTODOS

Continente do Seixal

2.2. Enzimas
Lactozym 2600 L Sigma-Aldrich

23
 imibond galactosidase SPRIN

2.3. Equipamento
Espectrofotmetro HITACHI U2000 UV-VIS de feixe duplo e com
uma gama de comprimento de onda que se situa entre os 220 e
os 850 nm.
Fotmetro Eppendorf, BioPhotometer
Bomba-seringa automtica da New Era Pump Systems, Inc.
Banho de gua termostatizado com agitao Julabo SW 21
Agitador orbital termostatizado Aralab Agitorb 160E
Potencimetro Metrohm 744
Placa de aquecimento com agitao Arex
Balana analtica Mettler AE 200
Microcentrifuga Heraeus Biofuge Pico
Vortex Retsch Mixer
Seringa de 10 mL PIC Indolor
Agulha Terumo Neolus de 0,6 mm
Microfiltros para agulhas
Micropipeta P1000, P200 e P100
Macropipeta Transferpettor de 10 mL
Pipeta de vidro de 20 mL
Pipeta de vidro de 1 mL
Eppendorfs de 1 mL e de 1,5 mL
Microplaca NuclonTM Delta Surface
Cuvete de plstico Eppendorf
MATERIAIS E MTODOS

Cuvete de plstico
Cuvete de vidro
Falcon de 10 mL

24
 Frascos de 7 mL
Frascos de 50 mL
Tubos de ensaio de vidro
Eppendorfs de 1,5 mL

2.4. Preparao de solues

Preparao de Soluo Tampo de Fosfato de Potssio 0,1 M, pH 6,8: Preparar

25 mL de soluo aquosa de K2HPO4 a (1 M) e 25 mL de soluo aquosa de
KH2PO4 (1 M); numa placa com agitao, colocar um copo de vidro de
500 mL com uma barra magntica no interior e misturar, no copo de vidro,
24,85 mL da soluo aquosa de K2HPO4 (1 M) com 25 mL da soluo aquosa de
KH2PO4 (1 M); acrescentar 400 mL de gua destilada, sempre com agitao, e
confirmar o pH da soluo com o potencimetro devidamente calibrado. Passar
a soluo para um balo de 500 mL e perfazer o volume com gua destilada. A
soluo dever ser guardada em refrigerao (2 a 5C).

Preparao de Soluo Tampo de Fosfato de Potssio 20 mM, pH 6,8: Retirar

20 mL da soluo tampo de fosfato de potssio 0,1 M, pH 6,8 para um balo de
100 mL e perfazer o volume com gua destilada. A soluo dever ser guardada
em refrigerao (2 a 5C).

Preparao de Soluo Tampo de Tris-HCl 0,1 M, pH 7,0: Preparar 100 mL de

soluo aquosa de (HOCH2)3CNH2 (0,1 M) e 100 mL de soluo aquosa de HCl
(0,1 M). Numa placa com agitao, colocar um copo de vidro de 200 mL com um
MATERIAIS E MTODOS

barra magntica no interior e misturar 100 mL da soluo aquosa de

(HOCH2)3CNH2 (0,1 M) com 93,2 mL da soluo aquosa de HCl
(0,1 M), sempre com agitao; confirmar o pH da soluo com o potencimetro

25
devidamente calibrado. Colocar a soluo num balo de 200 mL, perfazer o
volume do balo com gua destilada e armazenar em refrigerao (2 a 5C).

Preparao de Soluo de Carbonato de Sdio 1 M: Pesar 10,6 g de carbonato

de sdio para um de 100 mL. Adicionar um pouco de gua destilada at a
dissoluo do composto e depois perfazer o volume com gua destilada.
Armazenar a soluo em refrigerao (2 a 5C).

Preparao de Soluo Cloreto de Clcio a 1%: Pesar 1 g de cloreto de clcio

para um balo de 100 mL. Adicionar um pouco de gua destilada at a
dissoluo do composto e perfazer o volume com gua destilada. Armazenar a
soluo em refrigerao (2 a 5C).

Preparao de Soluo de Alginato de Sdio a 2%: Pesar 0,2 g de alginato de

sdio directamente para o copo de vidro e adicionar 10 mL de gua destilada.
Colocar a soluo a aquecer em banho-maria e com agitao, at completa
dissoluo do composto verificar a temperatura do banho-maria com
termmetro de modo a que no ultrapasse os 70C. Aps dissoluo do
composto, desligar o aquecimento mas manter a agitao at que a soluo seja
utilizada.

Preparao da enzima imibond galactosidase SPRIN para utilizao em

ensaios: Colocar a quantidade de enzima a utilizar dentro de um copo de vidro,
retirar com a ajuda de uma seringa com filtro a soluo de glicerol onde a
enzima se encontra armazenada. Proceder a trs lavagens com o volume de
MATERIAIS E MTODOS

soluo tampo de fosfato de potssio a 20 mM, 6,8 necessrio, sendo que 1g

de preparao enzimtica necessita 4 mL de soluo tampo em cada lavagem.
Retirar a soluo tampo no final de cada lavagem com a seringa com filtro. A
enzima est pronta para ser utilizada nos diferentes ensaios.

26
Preparao das solues de o-npg: Pesar 0,0075; 0,0151; 0,0226; 0,0301;
0,0376; 0,0452 g de o-npg para bales de vidro de 10 mL e dissolver em soluo
tampo de fosfato de postssio 0,1M, pH 6,8 ou em Tris-HCL 0,1 M, pH 7,0.
Perfazer o volume com soluo tampo de modo a que se obtenham solues
de concentrao 2,5; 5; 7,5; 10; 12,5; 15 mM.

Preparao das solues padro de o-np: Pesar 0,0139 g de o-npg para um

copo de vidro e dissolver em soluo tampo de fosfato de postssio 0,1M, pH
6,8 ou em Tris-HCL 0,1 M, pH 7.0. Transferir a soluo para um balo de 100 mL
e perfazer o volume com soluo tampo correspondente. Retirar os seguintes
volumes de soluo para bales de 10 mL: 0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25; 0,30;
0,35; 0,40; 0,45; 0,50.Perfazer com soluo tampo o volume dos bales e
homogeneizar de modo a obter-se padres de concentrao: 5, 10, 15, 20, 25,
30, 35, 40, 45 e 50 M.

Preparao das solues padro de glucose : Pesar 0,45 g de glucose para um

copo de vidro e dissolver em soluo tampo de fosfato de postssio 0,1M, pH
6,8 e transferir para um balo de 50 mL, prefazendo o volume com a mesma
soluo tampo de modo a que se obtenha uma soluo de glucose de
concentrao 50 mM. Retirar os seguintes volumes da soluo anteriormente
para bales de 10 mL: 0,05; 0,10; 0,15; 0,18; 0,2; 0,25; 0,30; 0,35; 0,38; 0,40.
Perfazer com soluo tampo o volume dos bales e homogeneizar de modo a
obter-se padres de concentrao:0,25; 0,5; 0,75; 0,9; 1; 1,25;1,5;1,75;1,9 e 2
mM.
MATERIAIS E MTODOS

Preparao das solues padro de Lactozym 2600 L para o ensaio de

Bradford: Pipetar 0,1 mL de preparao enzimtica Lactozym 2600 L para um
eppendorf de 1 mL e e adicionar 0,9 mL de soluo tampo de fosfato de
postssio 0,1M, pH 6,8. Retirar os volumes da soluo me de 2, 5, 10, 15, 20,

27
25, 30, 40, 50 e 60 L eppendorfs de 1 mL e adicionar volumes de soluo
tampo de 998, 995, 990, 985, 980, 975, 970, 960, 950, 940 L,
respectivamente, a cada eppendorf, de modo a obter solues padro de
concentrao 0,230; 0,575; 1,150; 1,725; 2,300; 2,875, 3,450; 4,600; 5,750;
6,900 g/mL. Homogeneizar no vortex.

Preparao das diluies de Lactozym 2600 L utilizadas paras os ensaios com

enzima livre: Retirar os seguintes volumes da preparao enzimtica: 0,02; 0,01;
0,008; 0,005; 0,004; para bales de vidro de 10 mL e perfazer o volume com
soluo tampo fosfato de postssio 0,1M, pH 6,8. e homogeneizar de modo a
se obter solues de concentrao 2,300; 1,150; 0,920; 0,575; 0,460 mg/mL.

Preparao de Soluo de cido Sulfrico 12N: Pipetar 16 mL de soluo de

cido sulfrico 95-97 % para um balo de vidro com gua desionizada. Esta
operao tem que ser realizada na hote. Adicionar gua desionizada,
lentamente atravs de uma pipeta de plstico at perfazer o volume do balo, e
homogeneizar.

Preparao do reagente de ensaio para a quantificao da glucose: Transferir o

contedo da cpsula contendo o reagente glucose oxidase/peroxidase
fornecido no Kit de Ensaio Glucose Oxidase Sigma-Aldrich para um frasco
mbar e adicionar 39,2 mL de gua desionizada, homogeneizando. Reconstituir
os 5 mg de reagente o-dianisidina, fornecidos no Kit de Ensaio Glucose Oxidase
Sigma-Aldrich, com 1 mL de gua desionizada, invertendo vrias vezes at total
dissoluo do seu contedo. Adicionar 0,8 mL de reagente o-dianisidina
MATERIAIS E MTODOS

reconstitudo anteriormente ao frasco mbar onde se encontra o reagente

glucose oxidase/peroxidase, homogeneizando. A soluo estvel por um ms
e dever ser armazenada entre 2 e 8 C.

28
 2.5. Mtodos analticos

2.5.1. Ensaio para a quantificao de acares redutores: Mtodo DNS

Um dos mtodos empregados na quantificao de acares redutores o

mtodo do DNS. um mtodo rpido e prtico na determinao de acares
redutores, e tem grande aplicabilidade industrial. Como exemplo de
aplicao temos: controle de qualidade na caracterizao das matrias-
primas para fins de processamento, e verificao se determinado produto
est dentro dos parmetros e padres exigidos pela legislao; indstria
aucareira, no acompanhamento do processo de fermentao, que permite
verificar as taxas de consumo de acar pelo microorganismo.
A determinao de acares redutores pelo mtodo do DNS baseia-se na
reduo, em meio alcalino, do 3,5-dinitrosalicilico (de colorao amarela). O
produto formado, 3-amino 5-nitrosalicilato, estvel e apresenta colorao
laranja-avermelhado (3-amino-5-nitro-salicilato) e mxima absoro da luz
visvel no comprimento de onda de 535 nm (34).

Figura 5 Reduo do reagente 3,5-dinitrosalicilico (35)

2.5.1.1. Tcnica
MATERIAIS E MTODOS

Em cada poo da microplaca NuclonTM Delta Surface colocar 250 L de

amostra ou de soluo padro de glucose e adicionar 250 L de cido
dinitrosalcilico. Tapar a microplaca e colocar em banho de gua a 100C

29
durante cinco minutos. A absorvncia das amostras foi medida a 563 nm, numa
cuvete Eppendorf num fotmetro Eppendorf, BioPhotometer.

Curva de calibrao
Para a realizao da curva de calibrao foram utilizadas solues padro de
glucose com concentraes entre 0,25 e 2 mM.

0,6

0,5
y = 0,2605x - 0,0438
Absorvncia563 nm

0,4 R = 0,9969

0,3

0,2

0,1

0
0 0,25 0,5 0,75 1 1,25 1,5 1,75 2 2,25
Concentrao de glucose (mM)

Grfico 1. Curva de calibrao da glucose (Mtodo DNS)

2.5.2. Mtodo de Bradford para determinao da protena

O ensaio de Bradford engloba vrias preparaes do corante Coomassie azul

brilhante usado com o objectivo de quantificar protenas, e foi descrito pela
primeira vez por Bradford (1976).
No mtodo de Bradford, o analito colocado em contacto com uma soluo
do corante Coomassie G-250 azul brilhante e permitida a sua incubao por
MATERIAIS E MTODOS

um curto perodo de tempo. O corante ir-se- ligar aos aminocidos bsicos ou

aromticos. Em consequncia da ligao protena uma alterao
metacromtica, para uma cor avermelhada, de 465 para 595 nm observada
devido estabilizao da forma aninica do corante. A maioria do sinal

30
observado deve-se interaco com os resduos de arginina. A absorvncia
lida espectrofotometricamente e, atravs da aplicao de uma curva de
calibrao e da Lei de Lambert-Beer, a concentrao de protena pode ser
calculada a partir da absorvncia (35).
As vantagens do ensaio de Bradford incluem a fcil execuo, a elevada
sensibilidade e o baixo custo dos reagentes (36).
O ensaio de Bradford sensvel a interferncias de vrios reagentes, onde
esto includas a maioria dos detergentes inicos e no-inicos, hidratos de
carbono, sais e protenas glicosiladas (35).

2.5.2.1. Tcnica
Em cada poo da microplaca NuclonTM Delta Surface colocar 100 L de
amostra ou de soluo padro e adicionar 25 L de reagente Bradford. A
absorvncia das amostras foi medida a 595 nm, numa cuvete Eppendorf num
fotmetro Eppendorf, BioPhotometer entre 2 a 5 minutos aps o incio da
reaco.

Curva de calibrao
Para a realizao da curva de calibrao foram utilizadas solues padro de
enzima (Lactozym 2600 L) com concentraes entre 0,2 e 6,9 g/mL. MATERIAIS E MTODOS

31
 2,50

y = 0,3109x + 0,1761
2,00 R = 0,9943
Absorvncia 595 nm

1,50

1,00

0,50

0,00
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00
Concentrao de Lactozym (ug/mL)

Grfico 2. Curva de calibrao de protena (Mtodo Bradford)

2.5.3. Doseamento da hidrlise enzimtica de o-npg: mtodo colorimtrico

Medidas de absoro da radiao ultravioleta e visvel tm uma vasta

aplicao na determinao quantitativa numa grande variedade de espcies
orgnicas e inorgnicas. Esta tcnica baseia-se na medida da transmitncia T ou
absorvncia A de solues contidas em clulas transparentes, tendo um
caminho ptico de b em centmetros. Deste modo a concentrao c de um
analito absorvente est relacionada linearmente absorvncia, conforme
representado pela equao e explicado pela lei de Lambert-Beer.
MATERIAIS E MTODOS

Equao 1. Lei de Lambert-Beer

32
 Apesar da lei de Lambert-Beer possuir algumas limitaes, existem poucas
excepes para a generalizao de que a absorvncia est relacionada
linearmente com o caminho ptico. No entanto, desvios de proporcionalidade
entre a absorvncia medida e a concentrao quando b constante, so
encontrados frequentemente. Outros desvios ocorrem em consequncia do
modo como as medidas de absorvncia so feitas ou em resultado de mudanas
qumicas associadas com variaes de concentrao. Estas duas ltimas so
conhecidas, respectivamente, como desvios instrumentais e desvios qumicos.
A lei de Lambert-Beer bem sucedida ao descrever o comportamento da
absoro de meios contendo concentraes de analito relativamente baixas. Em
altas concentraes (> 0.01M) a distncia mdia entre as molculas
responsveis pela absoro diminui a ponto de cada molcula afectar a
distribuio de carga das molculas vizinhas. Esta interaco poder alterar a
capacidade das molculas de absorver um determinado comprimento de onda
da radiao. Como extenso da interaco depende da concentrao, a
ocorrncia deste fenmeno causa um desvio da relao linear entre a
absorvncia e a concentrao.
Desvios da lei de Lambert-Beer tambm aparecem porque (coeficiente
molar de extino) depende do ndice de refraco do meio. Ou seja, se as
variaes de concentrao causam alteraes significativas no ndice de
refraco n de uma soluo, desvios da lei de Beer so observados (36).
Neste estudo, a actividade enzimtica foi medida usando o-nitrofenol--
-galactosideo (o-npg) como substrato. Os produtos da hidrlise deste substrato
so a galactose e o-nitrofenol e o mecanismo enzimtico semelhante ao da
hidrlise da lactose (24,27). A reaco foi parada pela adio de carbonato de
MATERIAIS E MTODOS

sdio que para alm de alterar o pH do meio para 11, desnaturando a enzima,
tambm faz exacerbar a cor amarela do o-nitrofenol (13,7). Esta cor medida
por espectrofotometria de absoro molecular no comprimento de onda de 410

33
nm contra um branco. Para isso, foi utilizado um espectrofotmetro HITACHI
U2000 UV-VIS.

Figura 6. Reaco de hidrlise do o-npg pela -galactosidase (37)

O espectrofotmetro utilizado tem feixe duplo e uma gama de

comprimento de onda que se situa entre os 220 e os 850 nm e opera com uma
lmpada de deutrio.

2.5.3.1. Curva de calibrao de o-np

Para a realizao da curva de calibrao foram retirados 500 L de solues
padro de o-np com concentraes entre 5 e 50 M para eppendorfs contendo
500 L de carbonato de sdio. Os eppendorfs foram mantidos em gelo at
leitura dos valores de absorvncia a 410 nm.
0,18
0,16
0,14
Absorvncia410 nm

0,12
0,10
0,08
0,06
0,04
MATERIAIS E MTODOS

0,02
0,00
0 10 20 30 40 50 60
y = 0,0017x + 0,0671 Concentrao de o-np (uM)
R = 0,9831

Grfico 3. Curva de Calibrao de o-np

34
 2.5.4. Kit Glucose-Oxidase Sigma-Aldrich para determinao da glucose

Este ensaio tem como objectivo a quantificao da glucose atravs de

mtodos enzimticos em alimentos e outros materiais. Devido alta
especificidade e sensibilidade das enzimas, ensaios quantitativos podem ser
realizados em materiais em bruto com pouca ou mesmo nenhuma
preparao. No entanto, as amostras podero ter que ser diludas em gua
desionizada e filtradas ou desproteinizadas se for necessrio para clarificar a
soluo. Amostras carbonatadas ou fermentadas necessitam ser
desgaseificadas.
Neste ensaio, a glucose existente na amostra oxidada a cido glucnico
e a perxido de hidrognio pela enzima glucose oxidase. O perxido de
hidrognio reage com a o-dianisidina na presena da enzima peroxidase e
forma um produto de cor castanha. A o-dianisidina oxidada reage depois com
o cido sulfrico e forma um produto mais estvel e de cor rosa. A
intensidade da cor do produto final depois medida a 540 nm e
proporcional concentrao de glucose existente na amostra.

Glucose
Oxidase
-Glucose + H2O + O2 cido -Gluconico + H2O2

Reduzido Peroxidase Oxidado

H2O2 + o-Dianisidina o-Dianisidina
(sem cor) (castanho)
MATERIAIS E MTODOS

H2SO4
o-Dianisidina Oxidado o-Dianisidina Oxidado
(castanho) (cor-de-rosa)

Figura 7. Esquema da reaco de determinao da glucose pelo teste da glucose/oxidase (38)

35
2.5.4.1. Tcnica

Foram colocados volumes de leite UHT magro, meio gordo e gordo

MIMOSA e das preparaes enzimticas, nas propores indicadas na tabela 4.,
em tubos falcon de 50 mL, a 20 C e 37 C e a 200 rpm no agitador orbital Aralab
Agitorb 160E. Foram retiradas alquotas de 500 L de todas as amostras para
eppendorfs de 1 mL aos 0, 30, 60, 90, 120, 150 e 180 minutos, e colocados em
gelo. No final do ensaio, as amostras e a soluo padro de glucose fornecida
com o kit de ensaio foram transferidas para tubos de ensaio de vidro e
colocadas em banho de gua a 99 C durante 5 minutos. As amostras foram
arrefecidas temperatura ambiente e foi adicionado, a cada tubo e com um
intervalo de 30 segundos entre tubos, 1 mL de reagente de ensaio. As amostras
foram colocadas em banho de gua a 37 C durante 30 minutos. Aps decorrido
este perodo de tempo, os tubos de ensaio contendo as amostras foram
retirados do banho e foi colocado 1 mL de cido slfrico 12 N em cada tubo,
com um intervalo de 30 segundos entre tubos, para parar a reaco. Foi
colocado 1,5 mL de cada amostra em eppendorfs de 1,5 mL e centrifugadas a
10000 rpm durante 5 minutos numa microcentrifuga Heraeus Biofuge Pico
Foram lidas as absorvncias a 540 nm, num espectrofotmetro Hitachi
U2000 UV-VIS em cuvetes de vidro.

Tabela 4. Quantidades de leite e de preparaes enzimticas utilizadas nos ensaios.

Preparao enzimtica
SPRIN
Esferas de Alginato
Quantidade de preparao
Volume de leite (mL)
enzimtica
5 50 mg
5 2,5 mL
MATERIAIS E MTODOS

Lactozym 2600 L 9,5 0,5 mL

A quantificao da glucose na amostra depois realizada atravs da

aplicao da equao seguinte:

36
 Equao 2. Quantificao da glucose de acordo com o teste glucose/oxidase

2.6. Mtodos experimentais

2.6.1. Imobilizao

Apesar da muitas indstrias ainda utilizarem a enzima livre para a hidrlise da

lactose, a imobilizao da -galactosidase uma rea que tem vindo a ganhar
importncia devido aos seus potenciais benefcios. A utilizao de tecnologia de
imobilizao de importncia significativa do ponto de vista econmico pois
torna possvel a reutilizao enzimtica e o uso das enzimas em processos
contnuos. Pode, tambm, ajudar a melhorar a estabilidade enzimtica.
A utilizao de -galactosidase imobilizadas tem sido, intensivamente,
empregue na hidrlise de leite e de soro de queijo.
Como foi referido anteriormente, existem vrias tcnicas de imobilizao e
vrios suportes onde a imobilizao pode ser realizada. A escolha da tcnica de
imobilizao e do suporte depende da enzima e do objectivo do estudo.
Neste estudo, a tcnica de imobilizao utilizada foi a de encapsulamento, e
o suporte escolhido foi o alginato de clcio.
MATERIAIS E MTODOS

O alginato , de longe, o polmero mais utilizado para tcnicas de

imobilizao e microencapsulao. O alginato um extracto de uma alga
marinha composta por cadeias de cido -L-glucornico e de cido --
manurnico, alternados. O seu uso em alimentos considerado seguro (39). Os

37
suportes em alginato so, geralmente, conseguidos, atravs do cross-linking do
grupo carboxil do -L-glucornico com a soluo contendo um catio tal como o
cloreto de clcio, cloreto de brio ou poli(L-lisina). Matrizes de alginato em cross
link com Ca2+ so, contudo, instveis em ambientes fisiolgicos ou em solues
tampo comuns com grandes concentraes de ies fosfato ou citrato pois
podem extrair o Ca2+ do alginato e liquefazer o sistema (31).

2.6.1.1 Tcnica
Adicionou-se a 10 mL de soluo aquosa de alginato de sdio (2%)
Lactozym 2600L Sigma-Aldrich de 150, 250, 350 e 500 L e deixou-se 10
minutos numa placa de agitao. Aps decorrido este perodo de tempo,
colocou-se a soluo mistura de polmero e enzima numa seringa de 5 mL com
uma agulha de 0,6 mm seringa da bomba-seringa automtica da New Era Pump
Systems, Inc. e gotejou-se com um caudal 900 L por minuto para a soluo de
extruso de cloreto de clcio a 1%, que se encontrava numa tina com gelo, na
placa com agitao. No final da extruso, as esferas foram deixadas 5 minutos
na soluo de Cloreto de Clcio ainda em gelo, com agitao, para consolidao
das mesmas. Decorrido este perodo de tempo, as esferas foram retiradas da
soluo de extruso e lavadas duas vezes com 20 mL de soluo tampo. As
esferas ficaram armazenadas no frigorfico (2 a 5C) em soluo tampo de Tris-
HCl, durante 24 horas antes de serem utilizadas em ensaio.
Cada esfera possua um volume 10 L e um dimetro de 2 mm.
MATERIAIS E MTODOS

38
Figura 8. Esferas de alginato de clcio (2%)

2.6.2. Avaliao da Influncia da Concentrao de Enzima

Para avaliar a influncia da concentrao de enzima foram realizados

ensaios a 37 C, utilizando-se uma soluo de substrato de concentrao 15
mM de o-npg em soluo tampo de fosfato de potssio, pH 6,8 a 0,1 M para
os ensaios com Lactozym 2600L Sigma-Aldrich e para os ensaios com
imibond galactosidase SPRIN e uma soluo de o-npg da mesma
concentrao mas realizada em soluo tampo de Tris-HCl, pH 7,0 a 0,1M
para os ensaios com a enzima imobilizada em alginato de clcio.

2.6.2.1. Tcnica
Com Lactozym 2600L Sigma-Aldrich: Colocou-se 9,5 mL de soluo de
substrato em tubos falcon de 10 mL com 0,5 mL de enzima com
concentraes de 2,300; 1,150; 0,920; 0,575; 0,460 mg/mL, em banho de
gua Julabo SW 21 termostatizado e com agitao de 80 rpm. Foram
retiradas alquotas de 500 L para eppendorfs de 1 mL contendo 500 L
MATERIAIS E MTODOS

de soluo de carbonato de sdio a 1 M, aos 0, 15, 30, 45, 60, 90, 120,
150, 180 minutos. Os eppendorfs foram mantidos em gelo at leitura
dos valores de absorvncia a 410 nm.

39
 Com SPRIN imibond galactosidase: Colocou-se 5 mL de soluo de
substrato em frascos de 7 mL com 20, 30, 40, 50 e 60 mg de enzima, no
agitador orbital Aralab Agitorb 160E com agitao de 200 rpm. Foram
retiradas alquotas de 500 L para eppendorfs de 1 mL contendo 500 L
de soluo de carbonato de sdio a 1 M, aos 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180
minutos. Os eppendorfs foram mantidos em gelo at leitura dos valores
de absorvncia a 410 nm.

Com esferas de alginato de clcio (2%) contendo Lactozym 2600L

imobilizada: Colocou-se 5 mL de soluo de substrato em frascos de 50
mL com 2,5 mL de esferas de alginato com concentraes de enzima de
17,25; 28,75; 40,25; 57,5 g/mL no agitador orbital Aralab Agitorb 160E
com agitao de 200 rpm. Foram retiradas alquotas de 500 L para
eppendorfs de 1 mL contendo 500 L de soluo de carbonato de sdio a
1 M, aos 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180 minutos. Os eppendorfs foram
mantidos em gelo at leitura dos valores de absorvncia a 410 nm.

2.6.3. Avaliao da Influncia da Concentrao de Substrato

Para avaliar a influncia da concentrao de substrato foram realizados

ensaios a 37 C, utilizando-se concentraes das preparaes enzimticas
fixas. Foram utilizadas solues de substrato de concentraes 2,5; 5; 7,5; 10
e 15 mM em soluo tampo de fosfato de potssio, pH 6,8 a 0,1 M para os
ensaios com Lactozym 2600L Sigma-Aldrich e para os ensaios com imibond
MATERIAIS E MTODOS

galactosidase SPRIN e solues de o-npg das mesmas concentraes mas

realizada em soluo tampo de Tris-HCl, pH 7,0 a 0,1M para os ensaios com
a enzima imobilizada em alginato de clcio.

40
2.6.3.1. Tcnica
Com Lactozym 2600L Sigma-Aldrich: Colocaram-se 9,5 mL de cada
soluo de substrato em tubos falcon de 10 mL com 0,5 mL de enzima
com concentrao de 0,920 mg/mL, em banho de gua Julabo SW 21
termostatizado e com agitao de 80 rpm. Foram retiradas alquotas de
500 L para eppendorfs de 1 mL contendo 500 L de soluo de
carbonato de sdio a 1 M aos 0, 5, 10, 15,20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55,
60, 90, 120, 150, 180 minutos. Os eppendorfs foram mantidos em gelo
at leitura dos valores de absorvncia a 410 nm.

Com imibond galactosidase SPRIN: Colocaram-se 5 mL de cada

soluo de substrato em frascos de 7 mL com 50 mg de enzima, no
agitador orbital Aralab Agitorb 160E com agitao de 200 rpm. Foram
retiradas alquotas de 500 L para eppendorfs de 1 mL contendo 500 L
de soluo de carbonato de sdio a 1M aos 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180
minutos. Os eppendorfs foram mantidos em gelo at leitura dos valores
de absorvncia a 410 nm.

Com esferas de alginato de clcio (2%) contendo Lactozym 2600L

imobilizada: Colocaram-se 5 mL de cada soluo de substrato em frascos
de 50 mL com 2,5 mL de esferas de alginato com uma concentrao de
enzima de 40,25 g/mL no agitador orbital Aralab Agitorb 160E com
agitao de 200 RPM. Foram retiradas alquotas de 500 L para
eppendorfs de 1 mL contendo 500 L de soluo de carbonato de sdio a
1 M, aos 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180 minutos. Os eppendorfs foram
MATERIAIS E MTODOS

mantidos em gelo at leitura dos valores de absorvncia a 410 nm.

41
2.6.4. Estudo do Efeito da Temperatura

Para estudar o efeito da temperatura sobre a reaco de hidrlise

enzimtica do o-npg foram realizados ensaios a vrias temperaturas
mantendo com uma concentrao fixa de cada enzima e uma concentrao
fixa de substrato, o-npg, de 15 mM em soluo tampo de fosfato de
potassio, pH 6,8 a 0,1 M para os ensaios com Lactozym 2600L Sigma-Aldrich
e para os ensaios com imibond galactosidase SPRINe soluo de o-npg da
mesma concentrao mas realizada em soluo tampo de Tris-HCl, pH 7,0 a
0,1 M para os ensaios com a enzima imobilizada em alginato de clcio.

2.6.4.1. Tcnica
Com Lactozym 2600L Sigma-Aldrich: Colocou-se 9,5 mL de soluo de
substrato em tubos falcon de 10 mL com 0,5 mL de enzima com
concentrao de 0,920 mg/mL, em banho de gua Julabo SW 21
termostatizado a 15, 20, 30, 37, 50, 60 . Foram retiradas alquotas de
500 L para eppendorfs de 1 mL contendo 500 L de soluo de
carbonato de sdio a 1 M, aos 0, 5, 10, 15,20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55,
60, 90, 120, 150, 180 minutos. Os eppendorfs foram mantidos em gelo
at leitura dos valores de absorvncia a 410 nm.

Com imibond galactosidase SPRIN: Colocou-se 5 mL de soluo de

substrato em frascos de 7 mL com 50 mg de enzima, no agitador orbital
Aralab Agitorb 160E com agitao de 200 rpm, a temperaturas de 20, 30,
37, 50, 60 C. Foram retiradas alquotas de 500 L para eppendorfs de 1
MATERIAIS E MTODOS

mL contendo 500 L de soluo de carbonato de sdio a 1 M, aos 0, 30,

60, 90, 120, 150, 180 minutos. Os eppendorfs foram mantidos em gelo
at leitura dos valores de absorvncia a 410 nm.

42
 Com esferas de alginato de clcio (2%) contendo Lactozym 2600L
imobilizada: Colocaram-se 5 mL de cada soluo de substrato em frascos
de 50 mL com 2,5 mL de esferas de alginato com concentrao de enzima
de 40,25 g/mL no agitador orbital ABALAB Agitorb 160E com agitao
de 200 rpm, a temperaturas de 20, 30, 37 e 50 C. Foram retiradas
alquotas de 500 L para eppendorfs de 1 mL contendo 500 L de soluo
de carbonato de sdio a 1 M, aos 0, 30, 60, 90, 120, 150, 180 minutos. Os
eppendorfs foram mantidos em gelo at leitura dos valores de
absorvncia a 410 nm.

2.6.5. Ensaios de Reutilizao

Com as preparaes de enzima imobilizadas, imibond galactosidase SPRIN e

esferas de alginato contendo Lactozym 2600L imobilizada foram realizados
ensaios de reutilizao com o objectivo de avaliar a hidrlise enzimtica do o-
npg em contnuo. Nestes ensaios, foi utilizada uma soluo de o-npg de 15 mM
em soluo tampo de fosfato de potssio, pH 6,8 a 0,1 M para os ensaios com
imibond galactosidase SPRIN e soluo de o-npg da mesma concentrao mas
realizada em soluo tampo de Tris-HCl, pH 7,0 a 0,1 M para os ensaios com a
enzima imobilizada em alginato de clcio.

2.6.5.1. Tcnica
Com imibond galactosidase SPRIN: Colocou-se 5 mL de soluo de
substrato em frascos de 7 mL com 50 mg de enzima no agitador orbital a
37 C, com agitao de 200 rpm. Foram retiradas alquotas de 500 L
MATERIAIS E MTODOS

para eppendorfs de 1 mL contendo 500 L de soluo de carbonato de

sdio a 1M ao final de 0, 30 e 60 minutos de ensaio. Os eppendorfs foram
mantidos em gelo at leitura dos valores de absorvncia a 410 nm. Aos

43
 60 minutos a soluo de substrato era substituda por uma nova soluo
de igual concentrao.

Com esferas de alginato de clcio (2%) contendo Lactozym 2600L

imobilizada: Colocou-se 5 mL de solues de substrato frascos de 50 mL
com 2,5 mL de esferas de Alginato com a concentrao de enzima de
40,25 g/mL , no agitador orbital a temperaturas de 37 C, com agitao
de 200 RPM. Foram retiradas alquotas de 500 L para eppendorfs de 1
mL contendo 500 L de soluo de carbonato de sdio a 1M ao final de 0,
30, 60, 90, 120, 150 e 180 minutos de ensaio. Os eppendorfs foram
mantidos em gelo at leitura dos valores de absorvncia a 410 nm. A
cada 180 minutos de ensaio a soluo de substrato era substituda por
outra de igual concentrao.

2.6.6. Ensaios de bioconverso da lactose em leite

2.6.6.1. Tcnica

Foram colocados 5 mL de leite UHT meio-gordo MIMOSA em frascos de 7

mL com as concentraes de enzima imibond galactosidase SPRIN indicadas
na tabela 5, s temperaturas indicadas na tabela 5 a 200 rpm no agitador
orbital. Foram retiradas alquotas de 500 L de todas as amostras para
eppendorfs de 1 mL aos nos tempos indicados na tabela 5, e colocados em gelo.
No final do ensaio, as amostras e a soluo padro de glucose fornecida com o
kit de ensaio foram transferidas para tubos de ensaio de vidro e colocadas em
MATERIAIS E MTODOS

banho de gua a 99 C durante 5 minutos. As amostras foram arrefecidas

temperatura ambiente e foi adicionado, a cada tubo e com um intervalo de 30
segundos entre tubos, 1 mL de reagente de ensaio. As amostras foram
colocadas em banho de gua a 37 C durante 30 minutos. Aps decorrido este

44
perodo de tempo, os tubos de ensaio contendo as amostras foram retirados do
banho e foi colocado 1 mL de cido slfrico 12 N em cada tubo, com um
intervalo de 30 segundos entre tubos, para parar a reaco. Foi colocado 1,5 mL
de cada amostra em eppendorfs de 1,5 mL e centrifugadas a 10000 rpm durante
5 minutos numa microcentrifuga Heraeus Biofuge Pico
Foram lidas as absorvncias a 540 nm, num espectrofotmetro Hitachi
U2000 UV-VIS em cuvetes de vidro.

2.6.6.2. Delineamento experimental para modelao da bioconverso da lactose

A influncia da concentrao da enzima imibond galactosidase SPRIN,

da temperatura e do tempo de reaco na bioconverso da lactose em leite
meio-gordo foi avaliada utilizando um delineamento experimental baseado no
mtodo das superfcies de resposta, designado por RSM (Response Surface
Methodology). Esta modelao permite testar vrias variveis em simultneo,
com um nmero reduzido de ensaios, e diminuir o tempo e os custos da
experimentao.
A metodologia das superfcies de resposta (RSM) consiste num conjunto
de mtodos matemticos e estatsticos que utilizam os dados quantitativos,
obtidos a partir de condies experimentais apropriadas, na determinao e
resoluo de equaes multivariadas, na modelao do fenmeno em causa e
no estabelecimento de combinaes entre vrios factores experimentais
(variveis) que na globalidade vo originar a resposta ptima. As equaes
podem ser representadas graficamente de forma a originar a superfcie de
resposta de trs formas diferentes: (i) descrever como as variveis afectam a
MATERIAIS E MTODOS

resposta; (ii) determinar como as variveis se interrelacionam e (iii) descrever o

efeito combinado de todas as variveis na resposta (40).
As principais etapas a considerar na aplicao da Metodologia das
Superfcies de Resposta, incluem (40): (i) escolha das variveis mais

45
importantes, (e.g. concentrao de enzima, concentrao substrato, tempo,
temperatura); (ii) definio da respectiva gama de trabalho (com base nas
informaes obtidas em ensaios preliminares); (iii) determinao dos ensaios a
realizar atravs de um delineamento experimental adequado; (iv) anlise e
interpretao dos resultados.
Um dos mtodos mais utilizados na metodologia das superfcies de
resposta com a finalidade de se ajustar a uma resposta de superfcie de segunda
ordem o delineamento central compsito rotativo (CCRD -Central Composite
Rotatable Desgn). Este, tem como base p variveis e baseia-se na escolha de 3
conjuntos de pontos experimentais. O primeiro conjunto com 2 p pontos
representa os vrtices de um cubo centrado na origem do sistema codificado de
referncia apresentando esses pontos um nmero de cdigo de + 1 ou 1. O
segundo conjunto toma a forma de uma estrela de 2p pontos nos eixos do
p/4
sistema de referncia a uma distncia de 2 da origem. O terceiro conjunto
constitudo pelos pontos da origem (pontos centrais) (41).
A anlise dos resultados experimentais permite o desenvolvimento de
curvas de regresso que descrevem matematicamente o sistema e permitem
retirar concluses relativamente ao seu comportamento.
As equaes polinomiais podem gerar as chamadas respostas de
superfcie que permitem visualizar o grau de dependncia, a interaco entre as
variveis e nalguns casos identificar as condies reaccionais ptimas (41).
Para a modelao da bioconverso da lactose no leite pela enzima
imibond galactosidase SPRIN, pela metodologia das superfcies de resposta foi
utilizado o delineamento central compsito rotativo, testando em simultneo as
variveis: concentrao de biocatalisador, tempo e temperatura. O
MATERIAIS E MTODOS

delineamento experimental foi efectuado com recurso ao software

StatisticaTM (verso 9 da Statsoft, USA) que seleccionou os valores das trs
variveis em estudo (concentrao biocatalisador, temperatura e tempo), a

46
utilizar nos ensaios em leite, com base nos resultados obtidos em solues
modelo (Tabela 5.)

Tabela 5. Valores experimentais das duas variveis testadas em simultneo e

respectivos nveis codificados por aplicao do CCRD.

Nveis imibond Tempo Temperatura

codificados galactosidase (min) (C)
SPRIN (mg/mL)
(-1,-1, -1) 4,00 15,00 23,00

(-1,-1, 1) 4,00 15,00 37,00

(-1, 1, -1) 4,00 45,00 23,00

(-1, 1, 1) 4,00 45,00 37,00

(1,-1, -1) 12,00 15,00 23,00

(1,-1, 1) 12,00 15,00 37,00

(1, 1, -1) 12,00 45,00 23,00

(1, 1, 1) 12,00 45,00 37,00

(-1,68, 0, 0) 1,27 30,00 30,00

(1,68, 0, 0) 14,73 30,00 30,00

(0, -1,68, 0) 8,00 4,77 30,00

(0, 1,68, 0) 8,00 55,23 30,00

(0, 0, -1,68) 8,00 30,00 18,23

(0, 0, 1,68) 8,00 30,00 41,77

(0, 0, 0) 8,00 30,00 30,00

MATERIAIS E MTODOS

(0, 0, 0) 8,00 30,00 30,00

47