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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

Escuela Acadmico Profesional de Microbiologa y Parasitologa

Biotecnologa

PRCTICAS DE LABORATORIO III UNIDAD

ALUMNAS:

Argomedo Alquizar, Elizabeth

Gonzlez Enriquez, Yessenia

Huayn Muoz, Gabriela

Lavado Enco, Alessandra

DOCENTE:

Dr. Heber Robles Castillo

TRUJILLO, 2017
PRCTICA N1
INMOVILIZACIN DE ENZIMAS EN GEL DE AGAR

I. INTRODUCCIN:
En los ltimos aos, la biotecnologa ha experimentado grandes avances y,
paralelamente sus aplicaciones industriales en la obtencin de productos qumicos, en
la industria alimentaria y farmacutica. Los procesos catalizados por enzimas en la
industria son cada da ms numerosos, ya que presentan una serie de ventajas frente
a los catalizadores convencionales no biolgicos (1).
La inmovilizacin de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza a la enzima
en una regin definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su
actividad cataltica y que pueden ser reutilizadas repetidamente. Posteriormente esta
definicin se ha ampliado a aquel proceso por el cual se restringen, completa o
parcialmente, los grados de libertad de movimiento de enzimas, orgnulos, clulas,
etc. por su unin a un soporte (1).
Las ventajas del proceso: a) aumento de la estabilidad b) reutilizacin de los
componentes c) la enzima no permanece en la solucin al finalizar el tratamiento y d)
diseo de reactores adaptables para cada enzima inmovilizada, permitiendo un
reciclado de producto que aumente su pureza. Bsicamente un reactor comprende un
recipiente o tanque con agitacin con las enzimas inmovilizadas, una va de entrada
para sustrato y otra de salida para el producto. Las desventajas a) alteracin de la
enzima respecto de su estado nativo b) heterogeneidad del sistema enzima-soporte
donde pueden existir distintas protenas inmovilizadas c) prdida de actividad d) el
sistema puede ser ms caro que la enzima nativa (2).
Uno de los mtodos de inmovilizacin por retencin fsica, es el atrapamiento, que es
la retencin de la enzima en cavidades interiores de una matriz slida porosa
constituida por prepolmeros entrecruzables o polmeros de tipo poliacrilamida,
colgeno, carraginato o resinas de poliuretano. Una suspensin de la enzima a
inmovilizar se la incluye en una solucin del monmero. Se inicia la polimerizacin
con cambio de temperatura o adicin de reactivo qumico. Los atrapamientos pueden
ser en geles o en fibras, ms resistentes stas ltimas. No hay alteracin estructural de
la enzima, pero hay que vigilar el proceso de polimerizacin (3).
En la presente prctica se llev a cabo la inmovilizacin de enzimas digestivas a travs
del mtodo fsico de atrapamiento en gel de agar, evaluando su efectividad.
La prctica tuvo como objetivo principal, determinar la efectividad de la enzima
inmovilizada, adems de su determinacin cualitativa mediante la presencia de
substrato no transformado (substrato residual).
II. PROCEDIMIENTO:
Se afor el agar con buffer hasta alcanzar un volumen de 250 ml. Se mantuvo en bao
mara a una temperatura entre 37-40C para mantener el sistema en estado lquido y
caliente. Se le agreg la enzima evaluada, en este caso, se emple una enzima
digestiva cuyo nombre comercial es DIGESTASE.
Con la aguja hipodrmica se extrajo 15 ml del medio (agar ms enzima) y se coloc,
gota a gota, en un frasco con aceite vegetal y se observ la formacin de pellets
(enzima inmovilizada). Se agreg 20 ml de agua destilada estril caliente para no
desactivar la enzima. Se dej reposar.
Se decant hasta eliminar el aceite. Se separaron 20 pellets (enzima inmovilizada) en
papel secante para su evaluacin junto con la enzima soluble como se muestra en el
siguiente esquema:

COMPONENTE PROB.ENZ.INMOV PROB.ENZ.SOLUBLE TESTIGO BLANCO

SUBSTRATO 2,5 2,5 2,5 -


BUFFERADO
AGUA 0,5 1,0 1,4 3,0
DESTILADA
Incubar 5 minutos en bao
de agua a 37C

ENZIMA 1,0 0,5 - 1,0


5 10 15
HCl 0.1N 2,5 2,5 2,5 2,5
ENZIMA - - 0,1 -
SOL. YODADA 0,5 0,5 0,5 0,5

III. RESULTADOS:

ENZIMA ENZIMA SOLUBLE TESTIGO


INMOVILIZADA
LONG. DE ONDA 0,790 nm 0,131 nm 0,812 nm
EQUIVALENTE 0,022 0,681 0,812
HIDROLIZADO

EFECTIVIDAD 3,23%
Tabla n1. Determinacin de la efectividad de la enzima inmovilizada
Fig. 1. Determinacin cualitativa de la efectividad enzimtica de la enzima
inmovilizada

IV. COMENTARIO:
La inmovilizacin altera el comportamiento de las enzimas. Generalmente se
incrementa la estabilidad conformacional de las mismas, se aumenta la proteccin
frente a proteasas y se evita la agregacin intermolecular. Se produce una alteracin
del microentorno de la enzima debido a su interaccin con el soporte, haciendo por
ejemplo que enzimas sensibles al oxgeno, como nitrogenasas hidrogenasas, vean
favorecida su actividad cuando estn inmovilizadas, debido a que la fuerza inica que
tiene el entorno disminuye la concentracin efectiva de oxgeno en el medio (4).
En la prctica se evalu la efectividad de enzimas digestivas inmovilizadas en gel de
agar, de la cual se determin un 3,23% de efectividad. En la determinacin cualitativa,
se utiliz como substrato al almidn y para su deteccin se utiliz solucin yodada, a
partir de estos principios, se observ que el tubo con enzima inmovilizada present
almidn, lo cual indica que no hubo actividad enzimtica. Esto se explica partiendo
de que las enzimas pueden perder total o parcialmente la actividad por interacciones
con el soporte, por impedimento del paso del sustrato al sitio activo, por interaccin
con grupos cargados del soporte o por cambios conformacionales que den formas
inactivas. Otros cambios que afectan la actividad enzimtica, aumentndola o
disminuyndola, son producidos por efectos de difusin del sustrato al sitio activo
(por insolubilidad del soporte en el medio de reaccin, por impedimentos estricos o
por efectos electrostticos entre el sustrato y el soporte) y por efectos en el
microentorno enzima-soporte (4).
V. CONCLUSIONES:
Se logr determinar la efectividad de la enzima inmovilizada, siendo esta de 3,23%;
adems se determin cualitativamente la actividad enzimtica mediante la presencia
de substrato no transformado (substrato residual).
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS:

(1) Arroyo, M. Inmovilizacin de enzimas. Fundamentos, mtodos y aplicaciones.


Ars Pharmaceutica. 1998, 39(2): 23 39.

(2) Snchez Ramrez J, Martnez - Hernndez JL, Segura - Ceniceros EP, Canteras
- Esquivel JC. Inmovilizacin de enzimas lignocelulolticas en nanopartculas
magnticas. Quim. Nova. 2014; 37(3): 504 - 512.

(3) Snchez Montero JM. Inmovilizacin de enzimas. Rev. Qumica orgnica y


Farmacutica. 2012; 25(2): 127 134.

(4) Huerta SO. Biotecnologa de enzimas: Inmovilizacin. Rev. Biotecnologa


Mdica UAM. 2009; 15(3): 45 67.