EL EMPLEO DE LA DERIVADA EN LA ESPEC1ROSCOPIA

. UL1RAVIOLETA-VISIBLK

Nadia R. Gamboa Fuentes

SEPARATA

Revista de Qumica. Vol. V. N 2. Diciembre de 1991

 Revista de Qumica. Vol. V. N 2. Diciembre de 1991

EL EMPLEO DE LA DERIVADA EN LA ESPEClROSCOPIA

UL lRA VIOLET A- VISIBLE

Nadia R. Gamboa Fuentes'

Desde fines de 1930 hasta la actualidad, los espectrofotmetros han

progresado desde simples colormetros hasta equipos computarizados con
brazos robots que colocan automticamente las muestras en ausencia temporal
de un operador. Grandes pasos se han dado desde la aparicin del primer equi-
po comercial en 1939. Estos avances no son slo tecnolgicos sino de trata-
miento de datos. Una de las herramientas matemticas empleadas en espec-
troscopa ultravioleta-visible (UV-Vis), fotometra de llama, espectroscopa
infrarroja y de fluorescencia, es la derivacin. El fundamento terico de esta
tcnica fue expuesto en 1953, pero fue puesta en prctica dos dcadas despus.
En los prrafos siguientes no se explicar el principio de la espectroscopa UV -
Vis, ya que existen numerosos textos que lo hacen; en cambio, se comentar
el empleo de la derivacin en la misma ..

Un espectro UV -Vis puede representarse por una funcin matemtica.

Cualquier funcin matemtica puede ser derivada respecto a una de sus
variables. Luego, una de estas funciones (que representa un espectro UV -Vis)
puede ser derivada una, dos o ms veces con respecto a la longitud de onda
o frecuencia. Se obtiene as la derivada de primer, segundo, tercer, ... , de orden
n. El instrumento hace el clculo electrnicamente trabajando en intervalos no
muy grandes de longitud de onda para analizar mejor la informacin que pro-

PUCP, Departamento de Ciencias, Seccin Qumica

179
porciona el espectro no derivado. El resultado: crecimiento de la seal, mayor
informacin. La desventaja: aumenta considerablemente el ruido de fondo.

Esta tcnica funciona como una especie de filtro. Resuelve las bandas
traslapadas (hombros) y facilita la interpretacin de las caractersticas del
espectro. Reduce la interferencia del ruido de fondo (background) y resuelve
las anchas bandas obtenidas en los espectros UV-Vis. Se emplea para solu-
cionar problemas de inters bioqumico, clnico, ecolgico y farmacutico.
Algunos usos son:

a) Determinacin cuantitativa en muestras turbias.

b) Colorimetra de muestras de aguas de desage turbias.
e) Mejoramiento de la resolucin de un espectro de absorcin.
d) Mediciones en los extremos de una banda.
e) Determinacin de bandas traslapadas originadas por componentes secun-
darios reduciendo el efecto de fondo (background).
1) Medicin en sistemas de dos o ms componentes.
g) Determinacin de trazas de compuestos aromticos en hidrocarburos
saturados.
h) Espectros de gases.
i) Determinacin precisa de la longitud de onda mxima Amax.

GENERALIDADES

Un espectro derivado es la representacin grfica de los cocientes

diferenciales sobre un rango de longitudes de onda de inters:

dn A para la n-sima derivada

dAn

donde A : absorbancia
A : longitud de onda

En la Figura 1 aparecen las curvas correspondientes a una banda

Gaussiana que simula una absorcin y sus derivadas hasta de cuarto orden.
Esta sera la representacin para una banda hipottica correspondiente a un
compuesto puro. Asimismo, se puede construir las curvas hipotticas que
representaran a una mezcla de dos (Figura 2) o tres componentes (Figura 3).
El efecto de dispersin (scattering) que se presenta en muestras turbias, puede
entenderse analizando la Figura 4.

180
 La primera derivada de cualquier curva toma el valor de cero para los
mximos y mnimos. En la Figura 1 se aprecia claramente el valor de cero
para el mximo en 30. En la Figura 4 se observa tres curvas denotadas por
A, B Y C. A es la banda de absorcin de un compuesto hipottico cuyo Amax
se ubica en 400 nm. B es la curva de background debido al efecto scattering.
Pero el instrumento graficara la curva e que es una funcin compuesta
resultado de la adicin de las curvas A y B. La funcin e
no tiene mximo
ni mnimo y no toma el valor de cero en ningun punto de su primera derivada.
Adems, las formas de las curvas de la primera derivada de A y son muy e
similares.

En la curva de la segunda derivada para slo un compuesto, se obtiene

un mnimo en un valor de longitud de onda que coincide con el valor de la
absorcin en el espectro (Figura 1). Para una curva compuesta, estos puntos
casi coinciden con el mximo de las bandas de los componentes puros tal como
se observa en las Figuras 2 y 3.

Las formas de las curvas para las derivadas de orden superior se van
complicando (Figura 3). Un ejemplo experimental aparece en la Figura 5 donde
aparecen las bandas de absorcin traslapadas del espectro de un filtro de
neodimio.

I I I r r I

Fig. 1 Primera a cuarta derivada de Fig. 2 Primera y segunda derivada

una banda Gaussiana, altura 1.2 y de dos bandas Gaussianas traslapa-
FWHM (ancho de la banda a la das, altura 1.2 y FWHM 12, centra-
mitad de la altura de la absor- da en 25 y 34*.
cin) 12*.
* Figura tomada de la referencia 1

181
r==

0. 23 '-l0 60

Fig. 3 Primera a cuarta derivada de Fig. 4 Simulacin de una banda de

una composicin de tres bandas
Gaussianas, cada una con FWHM
de 12. Las bandas estn centradas en
25,32.5 Y42 con alturas de 1.2 y 0.6
respectivamente* .
absorbancia con efecto de scattering
y su primera y segunda derivada. A
es la banda Gaussiana de altura 1.9
y FWHM 40 centrada en 400; B es
el efecto scattering y e = A + B*.
2 e- DERIVADA

MODO 3

~z
y

50Qnm 5S0nm 500nm 550nm

Fig. 5 Efecto y segunda deri vada de

un filtro de neodimio**.

** Figura tomada de referencia 5.

* Figura tomada de referencia 1

182
 VENTAJAS DE LA DERIVADA

Las curvas de las derivadas de un espectro son afectadas por dos factores:

a) Resolucin:

La Figura 2 muestra que las derivadas de una curva espectroscpica

pueden ser tiles para resolver bandas que son muy cercanas. La resolucin
se incrementa conforme aumenta el orden de la derivada. La magnitud exacta
de esta mejora depende del orden de la derivada, de la forma de la banda y
de la relacin entre el ancho de la banda y su altura. En la Figura 3 se muestra
dos curvas Gaussianas que tienen las mismas alturas y anchos . Ambas son
resueltas por la segunda y cuarta derivadas ya que su separacin dividida entre
su ancho a la mitad del mximo (FWHM) es 0.85, 0.63 y 0.52 respectivamen-
te.

b) Discriminacin:

Las formas agudas en los grficos se incrementan conforme aumenta el

orden de la derivada. En la Figura 4 se puede ver que el efecto del background
(B) sobre el pico (A) en la curva C disminuye notablemente en la primera y
segunda derivadas.

Clculo de la derivada

Cuando se calcula derivadas de un espectro debe mantenerse un compro-

miso entre la fidelidad con la cual se obtiene la derivada y la relacin S/N
(seal/ruido). El ruido, aunque sea pequeo, tiene caractersticas muy agudas
que afectan al espectro. La disminucin en S/N puede ser evitada pro mediando
los clculos de las derivadas sobre una regin de longitud de onda que sea
grande comparada con la estructura del ruido. Sin embargo, conforme se
incrementa el rango de longitudes de onda, la derivada se distorsiona ms. Se
puede apreciar mejor estos efectos haciendo algunos clculos. Si se asume que
el espectro de absorbancia es derivado slo una vez en Al:

A( Al + ~ A/2) - A(AI - ~ ')J2)

~A

183
y la segunda derivada es:

A(I.} + !J. A) - 2A(AI) + A(AI - !J. A)

(!J. A)2

y as sucesivamente. El valor de la n-sima derivada en cualquier punto

involucra valores de absorbancia sobre un rango de longitudes de onda de n!J.A;
su efecto en la forma de la derivada calculada y sobre S/N deben ser consi-
derados.

RAZON SEAL-RUIDO

Para poder determinar la influencia de !J. A sobre S/N de un espectro

derivado, debe considerarse separadamente su influencia sobre la seal y sobre
el ruido. La seal en DI en alguna longitud de onda Al usando un particular
!J. A es

donde la aproximacin involucra el uso de valores finitos de !J. A. La seal

en D2 es

S2(A1, !J. A) = SI(Al + !J. Af2, !J. A) -

SI(Al - !J. Vi, !J. A) z:

En general,

184
 El ruido en la n-sima derivada es calculado considerando el hecho de
que cuando dos seales son sumadas o restadas, el ruido resultante est dado
por la raz de la suma de los cuadrados de sus niveles individuales de ruido.
Si el espectro de absorbancia tiene un nivel de ruido de No a lo largo de una
banda, el ruido en la primera derivada es:

El nivel de ruido en la segunda derivada est dado por:

N2 = -VN 2
o
+ (2N 01\2 + N o2 =-{6N o

ya que la seal en D2 se obtiene por AO.} + ~ A) - 2A(Al) + A(AI - ~ A).

Usando el mismo razonamiento, N3 =...J 20 No YN4 =...J 70 No. Debe notarse

que este tratamiento no asume correlacin en el ruido entre dos puntos
separados por d A.
}

Se observa que el ruido en la n-sima derivada es independiente de ~A,

pero la relacin S/N aumenta con A A debido a un incremento en la seal.
Este incremento en la seal vara con (~ A)n si n ~ A es pequeo comparado
con el ancho de la seal (y.I), pero aumenta menos rpidamente a mayores M
por el efecto de distorsin.

SELECCION DE ~ A

En general, los ptimos valores de n y ~ A deben ser determinados

experimentalmente para cada aplicacin. Pero, algo debe quedar claro: la
obtencin de una derivada distorsionada no es til. Es mejor aun promediar
sobre un rango de longitud de onda en el orden del ancho de las bandas de
inters (~ A = WIn) para obtener mayor S/N u orden de derivada. Por ejemplo,
un ~ A de W/8 dar valores de DI para una banda Gaussiana dentro del 1%
de la primera derivada exacta y un S/N relativo a la curva de absorbancia de
24%. Pero, un ~ A de W/4 producir una segunda derivada con un valor alto
de S/N y mejores resolucin (Figura 4) Y discriminacin.

185
 APLICACIONES

a) Determinacin cuantitativa en muestras turbias

Es importante la determinacin cuantitativa de sustancias absorbentes

disueltas en presencia de turbidez. En un espectro normal la turbidez produce
generalmente una absorbancia que aumenta continuamente hacia valores de
longitud de onda ms cortos. Esto no causar ningn cambio espectral pro-
nunciado en la primera O segunda derivada. As, cuando sustancias absorbentes
son analizadas en presencia de turbidez, la absorbancia de fondo (background)
causada por esta turbidez puede ser eliminada. La Figura 6 muestra el espectro
de fenal en agua (curva a) as como su primera (la) y segunda derivadas (2a).
En la segunda derivada la posicin de los hombros en el espectro de absorcin
se distinguen por los dos pronunciados mnimos.

Para evaluar cuantitativamente el espectro derivado se emplea la dife-

rencia entre un mximo y un mnimo. Si existen muchas diferencias, se
seleccionan los extremos que muestren la mayor diferencia, por ejemplo, la
diferencia A-B (curva a) o C-D (curva b) en la Figura 7. Precisamente, la
determinacin de fenal en agua de desage fue uno de los primeros ejemplos
del empleo de la derivada en la determinacin cuantitativa de un parmetro
en presencia de turbidez. La Figura 7 demuestra que la evaluacin de la primera
y segunda derivada cumple la ley de Beer-Lambert, y que la turbidez no influye
en la linealidad (curva e),

Las bebidas que contienen quinina tambin contienen extractos de frutas

como el amargo de limn. Esto las hace ligeramente turbias y tambin
contienen sustancias que absorben luz UV. La Figura 8 muestra los espectros
de absorcin y las segundas derivadas de una solucin estndar de quinina
(curvas a), de una muestra de bebida que contiene quinina (curvas b), y de
una muestra que contiene quinina en la misma concentracin que el estndar
(curvas e), El mnimo en la segunda derivada puede atribuirse a la quinina
localizada a la misma longitud de onda (250 nm) para las tres muestras. La
quinina aadida a la muestra de bebida tiene un efecto aditivo.

Las bebidas de cola contienen cafena. Aunque no son turbias, la deter-

minacin espectrscopica directa de la concentracin de cafena en el rango
UV no es posible debido a la coloracin oscura y a la posible presencia de
otras sustancias que absorban en esta zona del espectro. La Figura 9 muestra
la eliminacin de la absorbancia de background no especfica por espectrOS-

186
 Fig. 6 Espectro normal y derivado del fenal
(50ppm) en agua***

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'/'
71) ) o
ppm +eoot
50

a b e

Fig. 7 Fenal en agua de desage: Espectro derivado y li-

nealidad***

*** Figuras tomadas de referencia 3.

187
 -------2~~O~------~-
a b e
Fig.8 Determinacin de quinina por espectroscopa derivada en ci-
do sulfrico 0.05 N*** .

A
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...
i

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a b e
Fig. 9 Determinacin de cafena por espectroscopa derivada***
188
copa derivada. La adicin de una conocida cantidad de cafena a una bebida
de cola muestra el resultado que podra haberse predicho tericamente (curva
e, 270 nm).

Otro ejemplo es la leche cuya turbidez es causada por una emulsin de

grasas. Adems de la deteminacin de grasas y otros ingredientes de la leche,
la determinacin de protenas es importante. Los mtodos convencionales para
la determinacin de las protenas son tediosos y largos. La espectroscopa
derivada ofrece una alternativa menos complicada. En la Figura 10 se ve el
espectro de absorcin y la segunda derivada de leche fresca altamente diluida
(curva b). El pico en 280 nm se puede atribuir al contenido de aminocidos
de las protenas de la leche (curva a). En la misma figura aparece una protena
.modelo. En la Figura 11 se muestran los espectros de absorcin y sus corres-
pondientes segundas derivadas para cinco diluciones de leche. Cuando las
diluciones son mayores de 1:100, las diferencias pico-pico AB son lineales
con la dilucin.

..-!

,~,~, .1
!

,...... ,.. .m
a b

Fig. 10 Espectros de absorcin y segundas derivadas

de un estndar de protena y de leche fresca diluida***

189
 .- .. __ iiII

-t-
. ~
i
I
I
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I
. -,-~-
I
. ~---

a b

Fig. 11 Espectro de absorcin y segunda derivada de varias diluciones

de leche fresca***

b) Mejoramiento de la resolucin de un espectro de absorcin

Se puede mejorar la resolucin en estructuras muy finas de espectros.

En este caso es til la segunda derivada ya que el mximo y mnimo del
espectro normal y de la segunda derivada tienen ms o menos la misma
longitud de onda. La estructura fina del espectro normal es aparentemente
distinta que en la primera derivada. El reconocimiento de la estructura fina
es muy importante para la identificacin, para pruebas de pureza opara control
de calidad. La segunda derivada es, en muchos casos, superior al cociente de
la absorcin en dos longitudes de onda; esto es usado generalmente en bio-
qumica como una prueba de pureza.

e) Medicin en sistemas de dos o ms componentes

Los componentes de una mezcla pueden no ser determinados exactamen-

te por bandas de absorcin definidos, sino que se presentan hombros o

190
pequeos picos en el espectro VV-Vis. Con los mtodos convencionales
dichos picos son evaluados con error. Con la primera o segunda derivada bajo
determinadas condiciones se pueden distinguir los componentes individuales
con un pequeo error. La exactitud de una determinacin en un sistema de
varios componentes depende de:

La relacin de la altura de la banda de interferencia y la de la banda que

se desea determinar.
ii La relacin del ancho a la mitad de la banda de interferencia y de la de
la banda que se desea determinar.
III La distancia entre los mximos de absorcin de ambos componentes
individuales.

En la Figura 6 se analiz la mezcla fenol-agua que presenta dos hombros.

Pero hay otros ejemplos interesantes. Muchas vitaminas muestran un compor-
tamiento tpico de absorcin en la zona VV. La primera y segunda derivadas
pueden usarse para la determinacin cuantitativa de vitaminas en presencia de
otras sustancias absorbentes. La Figura 12 muestra los espectros de absorcin
y sus segundas derivadas de la vitamina B12 (curvas a) y del acetato de
vitamina E (curvas b). La Figura 13 muestra la determinacin cuantitativa del
acetato de vitamina E en presencia de vitamina A. La adicin del estndar puro
al extracto de una gragea (curva e) dio un rendimiento de 97%. En cambio,
con los mtodos convencionales debe realizarse la hidrlisis para obtener la
vitamina E la cual, debido a la autooxidacin de la sustancia, siempre ocasiona
prdidas. Estableciendo las diferencias entre mximos y mnimos se puede
confirmar el rendimiento obtenido (curva e) con el que se obtiene por los
mtodos clsicos.

d) Determinacin de trazas de compuestos aromticos en hidrocarbu-

ros saturados

Los picos de hidrocarburos poliinsaturados tienen un ancho a la mitad

de su altura muy pequeo en el rango VV. La segunda derivada los mejora.
Esto se emplea para la determinacin cuantitativa de los contaminantes
aromticos en hidrocarburos saturados. La Figura 14 muestra la deteccin de
trazas de benceno en ciclohexano.

e) Espectros de gases

Los gases presentan espectros de absorcin de estructura fina y muy

detallada. Ocurre una reduccin de las influencias intermoleculares (ausencia
191
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Fig. 12 Espectros de absorcin y segundas deri-
vadas de vitaminas***

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Fig. 13 Determinacin del acetato de vitamina E en

presencia de vitamina A en isopropanol***

192
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Fig. 14 Espectros y segun- Fig. 15 Espectros normal, primera y

da derivada de benceno (10 segunda derivadas de yodo gaseoso***
ppm) en ciclohexano***
de solvente) y el incremento de los efectos rotacionales y vibracionales. Se
puede resolver esta estructura fina con la derivada. Se muestra ejemplos en
las .Figuras 15 - 17

f) Determinacin precisa de la longitud de onda mxima Arnax

Mientras que en un espectro de absorcin, en especial con bandas anchas,

la posicin de Amax puede ser determinada slo aproximadamente, con la
primera derivada la posicin del mximo es determinada exactamente por la
interseccin de la curva con cero.

La lista de empleos y de ejemplos importantes es realmente larga. Lo

que es comn en todos los casos es que puede disiparse cualquier duda que
existiese sobre un valor de longitud de onda mxima para un compuesto o para
el diseo de una tcnica de anlisis en el caso de soluciones de composicin
compleja. En el futuro se detallar y profundizar-ms en el empleo de la de-
rivada en espectruscopa UV -Vis.

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I
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Fig. 16 Espectro normal y segunda de-

rivada de dixido de azufre;**

194 .
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-T -

250 260

Fig. 17 Espectro normal, primera y segunda derivadas de benceno ga-

seoso***

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Spectrophotometry, Reprint Perkin-Elmer.

195