UNIVERSIDAD POLITCNICA DE MADRID

ESCUELA TCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRNOMOS

Departamento de Tecnologa de los Alimentos

SELECCIN DE LEVADURAS AUTCTONAS PARA LA

ELABORACIN DE VINOS TINTOS PARA BODEGAS Y

VIEDOS DE TRUJILLO S.L.

ELENA ABAD ARRANZ

Junio 2006

1
I. INTRODUCCIN
I.1. CRITERIOS BSICOS DE SELECCIN.3
I.1.1. Poder fermentativo..4
I.1.2. Acidez voltil....8
I.1.3. Cintica fermentativa.11
I.2. CRITERIOS ESPECFICOS DE SELECCIN PARA VINIFICACIN EN
TINTOS15
I.2.1. Resistencia al estrs fermentativo en presencia de etanol..16
I.2.2. Formacin de pigmentos estables derivados de metabolitos de levaduras.
Vitisinas20
I.2.2.1. Las vitisinas24
I.2.3. Los cidos orgnicos28
I.2.3.1. Produccin de cido mlico29
I.2.4. Produccin de glicerina34
I.2.5. Autolisis de las levaduras. Liberacin de polisacridos de pared38
I.2.6. Efecto de la temperatura.40
I.2.6.1. Influencia sobre las levaduras.40
I.2.6.2. Influencia sobre la velocidad de fermentacin..43
I.2.6.3. Fermentaciones a baja temperatura..44
I.3. BIBLIOGRAFA..45
I.4. OBJETIVOS51
II. MATERIALES Y MTODOS
II.1. PRESELECCIN REALIZADA 52
II.1.1. Obtencin de las cepas de levadura...............52
II.1.2. Seleccin de las cepas objeto de estudio...53
II.2.PREPARACIN DE LA COLECCIN DE LEVADURAS..55
II.3.PODER FERMENTATIVO..56
II.4.CINTICA FERMENTATIVA..57
II.5.ACIDEZ VOLTIL58
II.6. PRODUCCIN DE CIDO MLICO...59
II.7.DETERMINACIN DE GLICERINA.61
II.8. RESISTENCIA AL ETANOL.65
II.9.DETERMINACIN DE AZCARES RESIDUALES. GLUCOSA Y FRUCTOSA..67
II.10.LIBERACIN DE POLISACRIDOS.70

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II.11. PODER FERMENTATIVO A BAJA TEMPERATURA73
II.12. CINTICA FERMENTATIVA DE FERMENTACIONES A BAJA
TEMPERATURA.75
II.13. ACIDEZ VOLTIL DE MOSTOS FERMENTADOS BAJA TEMPERATURA75
II.14. BIBLIOGRAFA.76

III. RESULTADOS Y DISCUSIN.

III.1. PRESELECCIN REALIZADA...78
III.1.1. Nomenclatura empleada...78
III.1.2. Primera seleccin: Poder fermentativo y cinticas...78
III.1.3. Segunda seleccin: Poder fermentativo y cinticas en presencia de cido
decanoico.81
III.1.4. Tercera seleccin: Poder fermentativo, cinticas y acidez voltil a diferentes
temperaturas84
III.2. NOMENCLATURA DE LAS CEPAS SELECCIONADAS88
III.3. PODER FERMENTATIVO DE LAS CEPAS SELECCIONADAS..89
III.4. CINTICAS DE LAS CEPAS SELECCIONADAS..90
III.5. ACIDEZ VOLTIL..92
III.6. PRODUCCIN DE CIDO MLICO..93
III.7. PRODUCCIN DE GLICERINA.95
III.8. IDENTIFICACIN Y CONTENIDO DE ANTOCIANOS...90
III.9. RESISTENCIA AL ETANOL.100
III.10. AZCARES RESIDUALES. GLUCOSA Y FRUCTOSA.106
III.11. LIBERACIN DE POLISACRIDOS.106
III.12. CONCLUSIONES.....109
III.13. BIBLIOGRAFA.....110

ANEXO I. Resultados y cromatogramas de antocianos111

ANEXO II. Resultados y cromatogramas de polisacridos...112

3
I. INTRODUCCIN

4
I. INTRODUCCIN

I.1. CRITERIOS BSICOS DE SELECCIN

La necesidad de asegurar la fermentacin alcohlica as como la tipicidad de los

vinos, particularmente en grandes elaboraciones, ha requerido el uso de cultivos
iniciadores, cada vez ms estudiados por sus propiedades fisiolgicas y funcionales.

Mediante la seleccin de levaduras se pretende un mayor control tecnolgico del

proceso fermentativo, de forma que la cepa a utilizar resulte la ms adecuada en
cada caso.

De acuerdo con la experiencia adquirida, tres son los criterios bsicos y necesarios a
la hora de preseleccionar una cepa; un elevado poder fermentativo, que deje los
vinos con concentraciones de azcares residuales mnimas o totalmente secos, una
acidez voltil baja y una correcta cintica fermentativa. El estudio de cada uno de
ellos, se basa en la determinacin de diversos factores, recogidos en la Tabla I.1.

Tabla I.1. Criterios de seleccin bsicos

Criterios bsicos de seleccin

o Produccin y tolerancia al alcohol

Elevado poder fermentativo
o Ausencia de problemas de acabado

Acidez voltil baja o Produccin de cido actico y acetato de etilo

o Rpido arranque y acabado

o Duracin de la fermentacin
Correcta cintica fermentativa
o Regularidad fermentativa

o Resistencia al estrs fermentativo

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Estos tres criterios de seleccin de levaduras son comunes para cualquier tipo de
elaboracin, salvo el caso de vinificaciones especiales, donde se aplicarn criterios
ms especficos. En la Figura I.1. aparecen descritos segn la importancia relativa
de cada uno de ellos, seguidos de otros criterios tambin de gran importancia como
son la resistencia al SO2 y la ausencia de defectos olfativos.

Figura I.1. Criterios bsicos de seleccin de levaduras

Posteriormente, la seleccin deber proseguir en funcin de su aplicacin

tecnolgica.

I.1.1. Poder fermentativo

Se entiende por poder fermentativo o poder alcoholgeno la capacidad que tienen las
levaduras para producir vinos de elevado grado alcohlico, por tanto, corresponde al
mximo porcentaje de etanol que una levadura es capaz de producir al fermentar un
mosto estril con exceso de azcares, graduacin Baum igual o superior a 12 B
(212 g/L de azcar).

El alcohol etlico o etanol, de frmula CH3 - CH2OH, representa del 7 al 16% del
volumen del vino y an ms para los especiales, elaborados con agregados de
alcohol. En los vinos de mesa, esta proporcin ejerce gran influencia sobre la calidad,
la conservacin y el valor comercial. En general, cuanto ms alcoholizado est el

6
vino ms cuerpo tiene y ms rico es su extracto. La proporcin de alcohol del vino
est relacionado directamente con el estado de madurez de la uva; los grados altos
se alcanzan slo en ciertos aos favorables, en determinadas condiciones de cultivo
y de exposicin, pero sin duda tambin influyen de forma notable las levaduras que
llevarn a cabo la fermentacin del mosto.

Cuando la riqueza del mosto lo permite, se pueden alcanzar vinos de hasta un 16%
v/v de etanol, aunque estos volmenes no son muy frecuentes, encontrndose
adems limitado por la resistencia de las levaduras alcohlicas a este compuesto.

La cantidad de 17 gramos de azcar por litro de mosto es un valor aproximado de lo

que se necesita para obtener 1 de alcohol y refleja un trmino medio, relativo al
conjunto de una fermentacin normal y completa. Se debe procurar llegar a este
rendimiento en alcohol y mejorarlo en lo posible y en funcin del vino a obtener.

Es frecuente que los mostos como sustratos fermentativos presenten

concentraciones azucaradas superiores a 200 g/L y 250 g/L lo que equivale a que las
levaduras tienen que terminar la fermentacin con contenidos en alcohol de 12 a
14,5% v/v. El final de la fermentacin resulta muy complicado, no slo por la
ausencia de micronutrientes esenciales para el funcionamiento de las rutas
metablicas principales de la levadura sino tambin por la acumulacin en el medio
de metabolitos txicos.

Normalmente, en vinos tintos se busca una gran maduracin sacarimtrica para

mejorar la calidad organolptica y conseguir un grado alcohlico que garantice la
estabilidad del vino en la barrica durante la crianza. Esto conlleva finales de
fermentacin con altos contenidos en etanol txicos para la levadura, por ello, el
criterio prioritario desde los inicios de la utilizacin de levaduras seleccionadas, ha
sido que la cepa tenga un elevado poder alcoholgeno.

La liberacin del CO2 fermentativo genera un medio muy reductor. Adems, la

reduccin de los niveles de oxgeno a medida que transcurre la fermentacin
inhabilita a la levadura para biosintetizar cidos grasos insaturados, acumulndose
los saturados en la membrana. Como consecuencia la membrana se vuelve cada vez

7
ms rgida, imposibilitando los mecanismos de transporte as como el intercambio de
nutrientes y otros metabolitos con el medio. Por otro lado, el medio es especialmente
txico para la levadura por los elevados contenidos de etanol.

El deterioro en la organizacin y en la permeabilidad, la prdida de cofactores y

coenzimas, la desnaturalizacin de las protenas y enzimas glicolticas, inhibicin de
transportadores, inhibicin del flujo de protones y entrada pasiva de los mismos son
algunos de los daos provocados por las altas concentraciones de etanol en la
membrana plasmtica y las membranas de los orgnulos citoplasmticos (Surez,
1997). La Figura I.2. muestra un detalle de la estructura de la pared y la membrana
celular en Saccharomyces cerevisiae.

Figura I.2. Estructura de la membrana plasmtica y pared celular en Saccharomyces cerevisiae

8
La forma ms sencilla para la determinacin del poder fermentativo de una cepa de
levadura es el seguimiento gravimtrico de la fermentacin de un mosto estril e
inoculado con una cepa de levadura a estudiar, en un microvinificador sellado con
vlvula Mller. La Figura I.3. muestra su montaje experimental. De esta forma,
paralelamente se puede estudiar la cintica fermentativa.

Figura I.3. Montaje experimental de un microvinificador para la determinacin del poder fermentativo.

La fermentacin vnica consiste en la transformacin de la glucosa y fructosa del

mosto de uva el etanol y CO2 como productos mayoritarios del metabolismo de
Saccharomyces (Figura I.4) mediante la ruta glicoltica. En una fermentacin modelo
el 95% de los azcares es transformado en etanol y CO2, el 1% en material celular y
el 4% restante en otros metabolitos secundarios.

9
Figura I.4. Metabolismo glicoltico de los azcares por Saccharomyces cerevisiae y sistemas enzimticos implicados.

Por tanto, el poder fermentativo, como primer criterio, permite elegir despus de
realizada la prueba, solamente aquellas cepas que superen la graduacin alcohlica
previamente establecida y reducir as ampliamente el nmero de cepas en estudio.

I.1.2. Acidez voltil

La definicin correcta de la acidez voltil fue suministrada por Fonzs-Diacon y

Jaulmes (1930): La acidez voltil es el conjunto de cidos grasos de la serie actica
que se hallan en el vino. Se excluyen los cidos lctico y succnico, el cido
carbnico y el anhdrido sulfuroso libre y combinado. La definicin de los textos
vigentes en la actualidad es muy semejante a la precedente, la acidez voltil est

10
constituida por la parte de los cidos grasos pertenecientes a la serie actica que se
hallan en los vinos en estado libre o salificado.

El principal cido voltil en fermentados vnicos es el cido actico. A

concentraciones elevadas posee un perfil organolptico desagradable y por ello, es
empleado como parmetro de calidad a la hora de valorar un vino.

El lmite a la hora de seleccionar cepas de levadura en funcin de la acidez voltil es

de 0,5 g/L, aunque frecuentemente y en funcin de los valores obtenidos, se reduce
a 0,3 g/L como valor mximo.

Su presencia vara sensiblemente en funcin de la especie de levadura que lleve a

cabo la fermentacin, existiendo una notable variabilidad intraespecfica en la
especie Saccharomyces cerevisiae.

La legislacin establece como contenido mximo 1 g/L aunque en realidad esta

cantidad resulta elevada, razn por la que la mayora de los Consejos Reguladores
de las distintas Denominaciones de Origen disminuyen este valor a 0,7 g/L.

Se han sugerido las siguientes reacciones enzimticas en levaduras como

responsables de la formacin de cido actico:

Formacin reversible a partir de Acetil-CoA y acetil adenilato mediante la

enzima Acetil-CoA sintetasa.

Rotura del citrato mediante la enzima citrato liasa.

Produccin a partir de piruvato mediante la enzima piruvato deshidrogenasa,

(Figura I.5.).

Formacin reversible a partir de acetil fosfato mediante la enzima acetil kinasa

y oxidacin del acetaldehdo por la enzima acetaldehdo deshidrogenasa.

11
 Figura I.5. Rutas biosintticas de formacin de cido actico en Saccharomyces.

La mayor parte de los cidos voltiles se forman en los primeros estadios de la

fermentacin por descarboxilacin oxidativa del cido pirvico o de forma simultnea
a la biosntesis de cido frmico. Pasa por un mximo, generalmente cuando la mitad
del azcar ha fermentado disminuyendo el valor hacia el final del proceso.

Son normales producciones de acidez voltil de hasta 500 mg/L. al finalizar la

fermentacin, siendo el actico el cido mayoritario. En la seleccin de levaduras
para vinificacin se deben buscar producciones inferiores a 300 mg/L. La produccin
de actico durante la fermentacin depende de la cepa utilizada, la temperatura y la
composicin del mosto, de forma que desequilibrios nutricionales del mismo o la
coexistencia de levaduras y bacterias durante la fermentacin y etapas post-
fermentativas pueden causar una formacin en exceso de este cido.

Las bacterias que provocan la fermentacin malolctica forman una pequea

cantidad de cidos voltiles. Estos proceden de la descomposicin del cido ctrico,
que sucede al mismo tiempo que la del cido mlico, aunque, eventualmente,
tambin de la fermentacin lctica de pequeas cantidades de azcares,
especialmente pentosas. Una acidez voltil de 0,30 a 0,40 g/L puede, por este hecho
considerarse inevitable en los vinos terminados y no significa necesariamente que
stos presenten un principio de alteracin. Por encima de estas cifras se pude
sospechar de la intervencin de bacterias patgenas y el ataque de ciertos

12
elementos constitutivos del vino: azcares reductores, glicerina, cido tartrico, o
tambin el desarrollo de bacterias acticas o acetobacterias capaces de oxidar el
alcohol, las primeras son anaerobias facultativas o microaerfilas y se multiplican en
la masa de vino formando cido lctico. En la superficie de los vinos que se
mantienen en contacto con el aire pueden desarrollarse bacterias acticas que se
oxidan, por un fenmeno de respiracin, una proporcin a veces importante de
alcohol, transformndolo en cido actico.

Por otra parte, la presencia de levaduras salvajes procedentes de la uva entre las
que se encuentran Sps. Hansenula, Sps. Kloeckera, Sps. Rhodotorula, Sps.
Debariomyces, Sps. Hanseniaspora y Sps. Cndida pueden alterar los valores
esperados de acidez voltil.

Se observa por tanto, que la acidez voltil de un vino ofrece datos sobre su estado de
salud, sobre la importancia de las alteraciones sufridas, indica cual fue el pasado del
vino; es la marca que deja una enfermedad, una vinificacin irregular o una
conservacin defectuosa y permite adems prever las dificultades de conservacin
de ese vino.

I.1.3. Cintica fermentativa

La cintica fermentativa es la velocidad de metabolizacin de azcares con

respecto al tiempo. En enologa, es frecuente valorarla como variacin de la densidad
o como prdida de CO2 con respecto al tiempo. Permite el seguimiento de la
evolucin de la fermentacin y la deteccin de comportamientos anormales. Varios
son los criterios a tener en cuenta para determinar la correcta cintica fermentativa
de una levadura:

Rpido arranque de la fermentacin: Garantiza la estabilidad de la materia

prima y disminuye las posibilidades de ataques bacterianos u oxidaciones.

Regularidad fermentativa y curva termodinmica de cada cepa de levadura:

Una cintica progresiva garantiza la ausencia de explosiones calricas. Esto

13
 evitar elevaciones excesivas de temperatura que puedan provocar mala
calidad del vino e incluso paradas fermentativas. Adems permitir reducir la
necesidad de refrigeracin.

Ausencia de problemas de acabado: Garantiza que la cepa pueda terminar

correctamente la fermentacin sin que en el vino permanezcan azcares
residuales.

Duracin total del proceso.

Respuesta al estrs fermentativo, causado por la produccin de etanol y CO2,

ausencia de micronutrientes, esteroles de membrana y cidos grasos
saturados.

Las curvas termodinmicas de las cepas en estudio nos muestran a distintos niveles
o diferentes gradientes de concentracin azucarada, amplias variaciones en el
tiempo en que tienen lugar los mximos consumos y, por tanto, la produccin de los
mximos calricos. Resultan curvas del tipo representado en la Figura I.6., cuya
altura de cresta y extensin de la base vara mucho de una cepa a otra.

Figura I.6. Diferentes cinticas fermentativas. a) Correcta, b) Rpida, c) Con problemas de acabado, d) Con problemas de
arranque.

14
La curva puede ser dividida en tres fases:

La fase de latencia, que se corresponde con el periodo de saturacin del

medio en CO2. Su duracin es ante todo funcin de la temperatura y
generalmente no supera las 24 horas.

La segunda fase dura hasta el final del crecimiento celular. Durante su

transcurso, pasan sucesivamente por un mximo la velocidad especfica de
liberacin de CO2 y la velocidad mxima de liberacin de CO2. La velocidad
especfica mxima se corresponde con la actividad mxima de las clulas; se
alcanza muy pronto, aunque se haya producido menos de 5 g/L de CO2, lo
que se corresponde con un consumo de azcar inferior a 10 g/L. En este
momento, el nmero de clulas es inferior al tercio de la poblacin final. La
actividad de cada clula disminuye durante la casi totalidad de la
fermentacin.

Sin embargo, la velocidad mxima, que es proporcional a la actividad

fermentativa del conjunto del cultivo es alcanzada un poco ms tarde, en
momentos diferentes segn las fermentaciones, pero siempre antes del final
del crecimiento celular y siempre durante el primer tercio de la fermentacin.
Su valor es interesante por tres aspectos:

Permite detectar los mostos con carencia de nitrgeno (Bely et al.,

1990), puesto que existe cierta relacin entre ste y la velocidad
mxima de produccin de CO2.
Est ligada a la liberacin de calor mxima y, por tanto, a la necesidad
mxima de frigoras, necesarias para regular la temperatura.
Permite estimar la velocidad de la fermentacin (Bely et al., 1990).

Durante la tercera fase (fase estacionaria), las levaduras ya no son

proliferantes. Su nmero es constante, aunque en las cubas de gran tamao
su concentracin en el medio puede llegar a ser heterognea al final del
cultivo, a causa de fenmenos de decantacin. Durante toda esta fase, la
actividad de las levaduras contina disminuyendo progresivamente, a pesar de

15
 que, en la mayora de los casos, se conserva una fuerte tasa de viabilidad.
Varios fenmenos estn implicados en esta cada de actividad de la levadura,
siendo el principal el agotamiento de nutrientes nitrogenados asimilables en el
medio. Este elemento, no slo interviene a nivel de crecimiento de la levadura
sino tambin sobre la cintica de transporte de los azcares por las levaduras
a lo lago de la fermentacin. Esta velocidad de transporte es a menudo la
etapa limitante de la cintica fermentativa (Busturia y Lagunas, 1986; Salmon
et al., 1993). Al final de la fermentacin, cuando los azcares residuales estn
ya en pequeas concentraciones, la velocidad cae y despus se anula. Esta
cada puede ser brutal o muy progresiva (caso de fermentaciones largas). La
cintica final es sobre todo funcin del nmero de levaduras viables.

La velocidad de fermentacin, la regularidad en la actividad fermentativa, duracin

total, y contenido en etanol conseguido, deber valorarse en idnticas condiciones
experimentales en cuanto a composicin qumica del sustrato, recipiente de
microvinificacin, volumen de aire en su interior, oxgeno disuelto en mosto y
potencial redox, as como la temperatura de incubacin, tratando de seguir la
actividad metablica de las levaduras en cada momento.

16
I.2. CRITERIOS ESPECFICOS DE SELECCIN PARA VINIFICACIN EN TINTOS

La elaboracin de vinos tintos jvenes y destinados al envejecimiento tiene

requerimientos especiales con respecto a otros tipos de vinificacin. La seleccin de
levaduras es una herramienta adecuada para la seleccin de cepas de
Saccharomyces con aptitudes diferenciales que se ajusten a estos requerimientos.
La Tabla I.2. resume algunos de los parmetros que se han tenido en cuenta para
esta seleccin y que han sido estudiados en este trabajo.

Tabla I.2. Criterios especficos de seleccin de levaduras para vinificacin en tintos.

Criterios especficos de seleccin de levaduras

o Formacin de pigmentos estables derivados de

Color
metabolitos de levaduras. Vitisinas

o Produccin de glicerina
Estructura
o Liberacin de polisacridos de pared

o Produccin/ degradacin de cido mlico

Otros o Resistencia al estrs fermentativo

o Poder fermentativo a baja temperatura

17
I.2.1. Resistencia al estrs fermentativo en presencia de etanol.

El incremento de la concentracin de etanol a medida que transcurre la fermentacin

supone un obstculo para el correcto crecimiento microbiolgico. Una parada
fermentativa por esta razn supondra la presencia de azcares residuales en el vino
y por tanto los efectos negativos que esto conlleva. Pero la cantidad de alcohol que
bloquea la fermentacin depende de numerosos factores como son la cepa de
levadura, la temperatura o la aireacin.

El etanol ejerce una inhibicin no competitiva en multitud de funciones. El efecto del

etanol est tan generalizado en el caso de las levaduras que resulta difcil determinar
fisiolgicamente cal es el proceso cuya inhibicin acta como limitante del
crecimiento y la fermentacin, localizndose a veces en algn punto clave de la
glicolisis y en otras en el transporte de glucosa o alguna otra molcula orgnica que
va a ser catabolizada enzimticamente en el interior de la clula, Jimnez (1986).

El primer efecto inhibidor (a partir de 12% v/v) es la imposibilidad de crecimiento y/o

gemacin, as como la reduccin de la viabilidad, mientras que la capacidad para
seguir fermentando resiste niveles mayores de este compuesto (hasta 15 % v/v).

Segn describe Bartra (1995) los efectos inhibidores del etanol en Saccharomyces
cerevisiae provocan en la clula ciertos cambios perceptibles.

La disminucin ms o menos acentuada de la multiplicacin celular, de la viabilidad

y de la actividad fermentativa resulta el efecto ms relevante a simple vista. Dicha
disminucin se cifra para una concentracin de 12% de etanol, en una inhibicin de
la multiplicacin del 99% y del 75% de la fermentacin.

El uso de cuentaglbulos (Figura I.7.) es una de las tcnicas ms empleadas para el

recuento de clulas (Tratados de microbiologa; Policard y otros,1957). De esta
forma, se puede cuantificar el efecto del etanol a distintas concentraciones sobre la
multiplicacin celular de las levaduras. La cmara de Thoma est compuesta por un
portaobjetos cuya superficie posee tres planos. La superficie central, de espesor
inferior a las partes laterales crea una cmara de 0,1 mm de espesor. En el centro

18
est grabado un cuadriculado de 1 mm2, siendo el volumen del lquido
correspondiente de 0,00025 mm3.

Figura I.7. Cmara cuentaglbulos

para recuento de clulas

Las Figuras I.8. y I.9. muestran la diferencia en cuanto a crecimiento celular que se
produce en ausencia o presencia de etanol respectivamente.

Figura I.8. Clulas de levadura en ausencia de Figura I.9. Clulas de levadura con una
etanol. Aumento 10X concentracin d 6% de etanol. Aumento 40X

A nivel celular, las membranas plasmticas y las membranas de los orgnulos

citoplasmticos resultan ser las estructuras ms sensibles. El etanol afecta a la
permeabilidad de la membrana celular disminuyendo su selectividad, de forma que
las levaduras en un medio con alta concentracin alcohlica pierden propiedades
funcionales y no pueden retener cofactores y coenzimas. (Alexandre et al., 1994 a;
Leao y Van Uden, 1980, 1984).

19
El etanol parece sobre todo acelerar el influjo pasivo de protones del mosto hacia el
interior de la clula (Juroszek et al., 1987;), tal y como indica la Figura I.10. Para
mantener el pH intracitoplasmtico prximo a la neutralidad, la Saccharomyces
cerevisiae debe activar su ATPasa membranar (bomba de protones), actividad
consumidora de energa y en s misma sensible al etanol (Rosa y Sa-orreia,1991).

Figura I.10. Efecto del etanol sobre la fluidez de la membrana plsmica y su permeabilidad a los protones

Al mismo tiempo, la actividad ATPasa de la membrana plasmtica est tambin

implicada en numerosos sistemas de transporte (excrecin de protones generados
por el metabolismo, entrada de sustratos nitrogenados, excrecin de cidos
orgnicos Figura I.11.).

El aumento de la permeabilidad membranar puede, por tanto, tener mltiples

consecuencias y conducir a una fuerte reduccin de la viabilidad celular.

20
 Figura I.11. Papel de la ATPasa de la membrana plasmtica en el transporte de nutrientes y regulacin del pH intracelular.
Transporte de amonio (A) y de aminocidos (B) en Saccharomyces cerevisiae

Ciertas actividades enzimticas de la va glicoltica tambin se ven alteradas por la

presencia de etanol a altas concentraciones (10%), concretamente la hexoquinasa
pero tambin la glicerol 3-fosfato deshidrogenasa, enzima clave en la produccin de
glicerol.

Aunque es conocido que el etanol influye en la fermentacin perturbando la

permeabilidad de la membrana citoplasmtica y disminuyendo su selectividad
(Alexandre et al., 1994), existen pocos datos sobre las posibles modificaciones que
se producen en la composicin de la misma. Diversos autores han observado
variaciones en las concentraciones relativas de ciertos fosfolpidos (Thomas y Rose,
1979; Beavan et al., 1982; Ghareib et al., 1988), disminucin del ndice de saturacin
de los cidos grasos (Sajbidor y Grego, 1992), y una bajada en el contenido global de
esteroles (Walter-Caprioglio et al., 1990). Por ltimo se ha observado la sntesis
especfica de diversas protenas de estrs en respuesta al etanol (Piper et al., 1994)

La prdida de fluidez, estructura y permeabilidad de la membrana puede mitigarse

mediante la incorporacin, por parte de las levaduras, de cidos grasos insaturados
que pueden proceder tanto de las mitocondrias como de otros orgnulos ricos en
membranas. Adems, una adicin de oxgeno al final de la fase de crecimiento puede
permitir a la clula reforzar sus potenciales de resistencia frente al etanol, puesto que

21
interviene en la sntesis de los esteroles y de los cidos grasos insaturados,
constituyentes esenciales de la membrana plasmtica (Andrasen y Stier,1953, 1954).

Se ha observado una estrecha relacin entre la temperatura y la concentracin de

etanol: La toxicidad por etanol aumenta a medida que lo hace la temperatura y por
ello aquellas levaduras ms tolerantes al etanol tambin lo son a mayores
temperaturas. Por otro lado la presencia simultnea de etanol y otros compuestos
como glucosa, cidos orgnicos producidos en la fermentacin pueden tambin
aumentar esa toxicidad. Es por ello que, generalmente, es menor el efecto inhibitorio
del etanol aadido que el efecto de aquel que se produce durante la fermentacin
(Novak, y col.,1981).

I.2.2. Formacin de pigmentos estables derivados de metabolitos de levaduras.

Vitisinas.

En la actualidad, un importante criterio de calidad de los vinos es el color y por ello, el

estudio de los contenidos de antocianos es cada vez ms relevante.

Normalmente estos compuestos se encuentran nicamente en el hollejo de la uva y

en las tres cuatro primeras capas celulares del hipodermo. Pero, en algunos casos,
estos pigmentos son tambin encontrados en el seno de la pulpa, como ocurre en
las cepas tintoreras (Ej. Vitis vinifera var. Alicante bouschet, var. Gamay fraux). A
nivel subcelular, su presencia en la vacuola, donde pueden estar incluidas en los
orgnulos especializados definidos como antocianoplastos, est hoy demostrada
(Pecket y Small, 1980). Su contenido aumenta desde el envero hasta el final de la
maduracin.

Durante la maduracin de la uva se produce una notable acumulacin de pigmentos

fenlicos que confieren a la uva tinta su valor tecnolgico. Se trata de productos
secundarios del catabolismo de los azcares en los que las vas de biosntesis estn
presentes y activas en parte ya al inicio del desarrollo de la uva.

22
Segn se observa en la Figura I.12., los compuestos fenlicos que derivan de una
unidad simple de un solo ciclo bencnico, son originados en la condensacin de la
eritrosa-4-fosfato, intermediaria del ciclo de las petosas. Esta va de biosntesis,
conocida bajo el nombre de va del cido shikmico, conduce a los cidos benzoicos
y cinmicos. Por otro lado, la condensacin de tres molculas de acetil-coenzima A,
que derivan de las reacciones del ciclo de Krebs, conduce tambin a la formacin de
un ciclo bencnico. La condensacin de este segundo ciclo sobre el cido cinmico
de lugar a un conjunto de molculas, los flavonoides, que poseen ciclos bencnicos
unidos por una cadena carbonada de tres tomos de carbono que a menudo se
encuentran bajo la forma de un heterociclo oxigenado. Diferentes transformaciones,
explican la presencia en la uva de numerosas sustancias de esta familia entre, las
que se encuentran las antocianinas.

La aparicin de las antocianinas est ligada a la acumulacin de azcares en la uva,

pero no se ha podido establecer ninguna relacin directa y diversos parmetros como
la luz permiten aumentar la velocidad de su acumulacin sin afectar el nivel de
azcares en el hollejo (Wicks y Kliewer, 1983).

Los antocianos se sintetizan como otros flavonoides mediante la ruta biosinttica de

los fenilpropanoides (Figura I.13.). La biosntesis de antocianos se ha estudiado
exhaustivamente en varias especies de plantas y hay abundante informacin
disponible de las distintas reacciones que suceden. Se necesitan dos tipos de genes
para la biosntesis de antocianos, los genes estructurales que codifican enzimas que
directamente participan en la sntesis de antocianos y otros flavonoides, y los genes
reguladores que controlan la transcripcin de los genes estructurales. Las distintas
ramas de las rutas biosintticas estn altamente reguladas.

23
 Hexosa

Glicolisis Va de las pentosas fosfato

Fosfoenolpiruvato

3x Piruvato Eritrosa-4-P
Ciclizacin

3x Acetil CoA 5-deshidroshikimato Galato

Protocatecato
3 CO2
Fosfoenolpiruvato NH3

3x Malonil-CoA Prefenato

Tirosina Fenilalanina
3x CO2, 3x CoA-SH

NH3

p-Cumarato-CoA p-Cumarato Cinamato

Chalcona Cafeato, ferulato

Flavones, flavonoles, antocianidinas

Flavones, flavonoles, Flavonoles-3

Taninos prociandicos

Figura I.12. Vas de biosntesis de los compuestos fenlicos (Conn,1986)

24
Figura I.13. Ruta biosinttica de antocianos en Vitis vinifera L.

25
I.2.2.1. Las vitisinas

Las vitisinas son un tipo de pigmentos derivados de los antocianos que se forman en
los vinos tintos durante la fermentacin de los mostos. Entre sus caractersticas ms
destacables se encuentran:

Elevada resistencia a la decoloracin por SO2, utilizado en enologa por sus

propiedades microbicidas y antioxidantes.
Escasa modificacin de la intensidad de color con variaciones importantes de
pH.
Gran resistencia a la oxidacin.

Se encuentran en los vinos generalmente en cantidades inferiores a 10 mg/L, incluso

en algunos vinos no llegan a detectarse. Es por ello, por lo que su descubrimiento ha
estado ligado al desarrollo de tcnicas analticas tales como la cromatografa de
lquidos y espectrometra de masas. (HPLC/ESI-MS).

Se originan por condensacin entre los antocianos procedente de variedades de uva

tinta (Vitis vinifera L.) y ciertos metabolitos excretados por las levaduras al medio
durante la fermentacin alcohlica (acetaldehdo y cido pirvico).

Las vitisinas se pueden formar a partir de cualquier antociano de la uva, habindose

detectado vitisinas formadas por todos los antocianidn-3-O-glucsidos, y del mismo
modo vitisinas formadas a partir de los derivados acilados (acetilados y p-
cumarilados).

No obstante, al ser el malvidn 3-O-glucsido el antociano ms importante

cuantitativamente en Vitis Vinfera L., las vitisinas se forman mayoritariamente a partir
de l. La vitisina A es el resultado de la condensacin de este antociano con cido
pirvico y la vitisina B con acetaldehdo (Figura I.14.).

26
Figura I.14. Formacin y estructura molecular de las vitisinas mayoritarias a partir del antociano malvidn-3-O-glucsido y del
cido pirvico y el acetaldehdo durante la fermentacin en vinos tintos.

Los derivados acilados mayoritarios en Vitis vinifera L. son el malvidn-3-O-(6-O-p-

cumaril)-glucsido y el malvidn-3-O-(6-O-acetil)-glucsido y son las molculas
precursoras de las p-cumarilvitisinas y acetilvitisinas A y B. (Figuras I.15. y I.16.).

27
 OCH3

OH

+
OH O
OCH3
HO H
H
O OH
O OH O
OH H
CH2 O CH CH CH OH
H

Malvidn-3-O-(6-O-p-cumaril)-glucsido
Origen: H HOOC Origen:
-Levaduras -Levaduras
-Bacterias O O -Encabezados
-Microoxigenacin
H3C H3C -Levaduras de velo

cido pirvico Acetaldehido

OCH3 OCH3

OH OH

+
OH O OH +
O
OCH3 OCH3
HO H HO H
H H
O OH O
OH OH
O O OH
O O
O H O
CH2 O CH CH CH OH H
H CH2 O CH CH CH OH
H
COOH

p-CUMARILVITISINA A p-CUMARILVITISINA B
Malvidn-3-O-(6-O-p-cumaril)-glucsido-cido pirvico Malvidn-3-O-(6-O-p-cumaril)-glucsido-aducto vinlico

Figura I.15. Formacin y estructura molecular de las p-cumarilvitisinas a partir del antociano malvidn-3-O-(6-O-p-cumaril)-

glucsido y del cido pirvico y el acetaldehdo durante la fermentacin en vinos tintos.

Las formas heteroaromticas que aparecen en la figura en la Figura I.14. para las
vitisinas A y B tambin se pueden establecer para las acetilvitisinas y
p-cumarilvitisinas. Esta estructura molecular que presentan las vitisinas diferente de
la de sus antocianos precursores, condiciona sus propiedades mejorando su
estabilidad, impidiendo su decoloracin por SO2, evitando la prdida de intensidad
colorante a pH elevado y aumentando su resistencia a la oxidacin.

28
 OCH3

OH

+
OH O
OCH3
HO H
H
O OH
O OH O
OH H
CH2 O CH CH3
H

Malvidn-3-O-(6-O-acetil)-glucsido

Origen: H HOOC Origen:

-Levaduras -Levaduras
-Bacterias O O -Encabezados
-Microoxigenacin
H3C H3C -Levaduras de velo

cido pirvico Acetaldehido

OCH3 OCH3

OH OH

+
OH O OH +
O
OCH3
OCH3
HO H
H HO H
O H
OH O
O OH O OH
O H O OH O
CH2 O CH CH3 O H
H CH2 O CH CH3
H
COOH

ACETILVITISINA A ACETILVITISINA B
Malvidn-3-O-(6-O-acetil)-glucsido-cido pirvico Malvidn-3-O-(6-O-acetil)-glucsido-aducto vinlico

Figura I.16. Formacin y estructura molecular de las acetilvitisinas a partir del antociano malvidn-3-O-(6-O-acetil)-glucsido y

del cido pirvico y el acetaldehdo durante la fermentacin en vinos tintos.

La maceracin de la uva para la extraccin del color sucede de forma simultnea a la

fermentacin. Las levaduras del gnero Saccharomyces spp. degradan los azcares
por va fermentativa transformndolos en etanol. Durante este complejo proceso se
producen varios metabolitos intermedios que son en parte excretados al exterior
celular. Entre estos metabolitos se encuentran el cido pirvico y el acetaldehdo,
muy importantes en la formacin de vitisinas.

Por tanto, la seleccin de cepas de Saccharomyces con elevadas producciones de

cido pirvico y acetaldehdo permite maximizar el contenido de vitisinas A y B en los
vinos por ellas fermentados, mejorando notablemente su color (Morata et al., 2003).

29
I.2.3. Los cidos orgnicos

Parte de los cidos orgnicos del vino se originan en los procesos biosintticos de la
vid y otra importante fraccin se forma como consecuencia del metabolismo
microbiano de levaduras y bacterias que intervienen en la fermentacin alcohlica del
mosto y procesos biolgicos posteriores durante el envejecimiento.

La concentracin de cada uno de ellos en el vino depende de varios factores como

son el tipo de mosto, la actividad microbiana de la cepa de levadura o las condiciones
en las que se lleva a cabo la fermentacin alcohlica (Ramn-Portugal et al., 1999).
La Tabla I.3. recoge los principales cidos orgnicos del vino junto con sus
propiedades fsico-qumicas.

Tabla I.3. Principales cidos orgnicos del vino

Los cidos orgnicos, al ser los principales responsables de la acidez total del vino,
tienen una demostrada contribucin a las caractersticas organolpticas finales del
vino, as como a la estabilidad biolgica y fsico-qumica posterior del mismo (Tabla
I.4.).

30
 Tabla I.4. Aportaciones enolgicas de los cidos orgnicos ms importantes

cido Importancia enolgica

o Caractersticas de fruta madura, sabores frescos y agradables.

Tartrico
o Precipitacin en forma de sales, consecuencia de la accin
conjunta de alcohol y fro.

o Tpico de la manzana. Notas speras poco agradables.

Mlico
o Mayor tolerancia en blancos.

o Sensaciones agradables, frutales, aromticas y muy vivas.

Ctrico

o Suavidad, en detrimento de los aromas primarios de la uva.

Lctico

o Sensaciones saladas y amargas muy sutiles y por ello apreciadas

Succnico
en vinos de calidad.

Adems, resultan de gran importancia para las levaduras porque pueden ser
utilizados como fuente de carbono, contribuir al potencial osmtico intracelular y al
equilibrio de cargas, as como intervenir en el control del pH intracelular (Jennings,
1995).

.
I.2.3.1. Produccin de cido mlico

Entre los numerosos cidos orgnicos presentes en el vino no todos tienen la misma
importancia y regularidad. Entre ellos, el cido mlico es uno de los cidos

31
mayoritarios. Su contenido en el vino oscila entre unos valores mnimos y mximos
de 0,16 y 5,20 g/L respectivamente.

El sabor cido que se percibe en un vino viene condicionado por la abundancia de

protones, es decir por la acidez real o pH y por ello, unos niveles adecuados de
cido mlico, entre otros cidos, resulta esencial.

Existen especies concretas de los gneros Schizosaccharomyces,

Zygosaccharomyces y Saccharomyces que presentan una notable capacidad para
metabolizar el cido mlico, pudiendo conducir hasta la desaparicin total del mismo.
Por el contrario, en otros casos, el cido mlico puede acumularse parcialmente en el
vino como producto secundario de la fermentacin alcohlica de las levaduras
vnicas.

Por tanto el papel de las levaduras sobre el metabolismo del cido mlico podra
dividirse en dos:

Productoras Incrementan la cantidad de cido mlico

Degradadoras Facilitan la Fermentacin malolctica

El cido mlico es un producto muy activo del metabolismo de las uvas, siendo sus
precursores los azcares. La produccin de cido mlico en la uva puede deberse a
vas catablicas, como son la glucolisis y la va de las pentosas, o la -carboxilacin
del fosfoenolpiruvato (Ribreau-Gayon et al., 2000).

A diferencia de lo que ocurre con el cido tartrico, el contenido de cido mlico en

las bayas disminuye durante el periodo de maduracin debido a fenmenos de
migracin y combustin, dependiendo activamente de las condiciones
metereolgicas, de la cosecha y de la variedad de vinfera. As, en las zonas de
climas clidos las uvas contienen poco cido mlico en el momento de la vendimia
(Boulton et al., 1996).

32
La presencia de L (-) mlico es bien conocida, sin embargo, diversos estudios han
puesto de manifiesto la presencia del ismero D en pequeas cantidades (Chretien y
col., 1993). En general, su contenido es superior en vinos tintos, probablemente por
su presencia en las partes slidas de la uva.

Se presupone que las bacterias lcticas atacan fundamentalmente al L(-), pero las
levaduras s pueden degradar el ismero D ligeramente durante la fermentacin
alcohlica, aunque en ningn caso se superan los 100 mg/L.

Por otro lado, la concentracin total de mlico en el vino puede verse incrementada si
se acumula algo de mlico como metabolito intermedio de las levaduras, en la ruta
metablica que conduce finalmente a la produccin de cido succnico (Figura I.17.).

Esta biosntesis de cido mlico como producto secundario de la fermentacin

alcohlica puede repercutir favorablemente en el pH, composicin qumica y
caracteres sensoriales en algunos tipos de vinos.

El destino del cido mlico de origen fermentativo puede ser el mismo que el del
constitutivo del mosto, es decir, permanecer en el vino, o ser posteriormente
metabolizado por bacterias lcticas.

33
 COOH COOH
CO2 NADH2 NAD+
COOH
CO CHOH
CO
CH2 CH2
CH3
COOH COOH

AC. PIRVICO AC. OXALACTICO AC. MLICO

COOH H2O
NADH2 NAD+
CH2 HOOC CH

CH2 HOOC CH

COOH

AC. SUCCNICO AC. FUMRICO

Figura I.17. Formacin de cido mlico como producto secundario de la fermentacin alcohlica

Sin embargo, para muchos vinos la eliminacin por va biolgica del cido mlico o al
menos su disminucin en concentracin supone un paso obligado.
La desacidificacin biolgica por levaduras, junto con la fermentacin malolctica
bacteriana constituyen las dos vas ms conocidas.

La fermentacin maloalcohlica puede ser considerada como una verdadera

fermentacin que conduce a la transformacin de este cido en cido pirvico, que
seguir posteriormente los estadios finales de la fermentacin alcohlica,
incrementndose por tanto el grado alcohlico (Figura I.18.).

34
 COOH
NADH2 NAD+ NADH2 NAD+
COOH O
CHOH
CO H CH2OH
CO
CH2
CH3 CH3
CH3
COOH CO2 CO2

AC. MLICO AC. PIRVICO ACETALDEHDO ETANOL

Figura I.18. Bioqumica de la fermentacin maloalcohlica

Mediante la fermentacin malolctica (J.F. Cavin, C. Divies, J. Guzzo) el cido mlico

es transformado en lctico. La importancia de esa fermentacin es conocida desde
1922 con los trabajos de Ferr con los grandes vinos de Borgoa.

En la mayora de los casos esta fermentacin es buscada por dos razones

importantes:

La transformacin bacteriana del cido mlico en cido lctico produce una

desedificacin conveniente en el vino y le confiere ligereza; tambin refuerza
el color de los vinos tintos.
La desaparicin del cido mlico asegura en el vino la estabilidad biolgica
frente a las bacterias lcticas.
A veces, la fermentacin malolctica no es deseada en algunos vinos blancos
para mantener cierta acidez y conservar sus aromas, los del fruto y los de la
fermentacin alcohlica.

Por ello, es importante seleccionar cepas que mantengan unos niveles adecuados
de este cido en el vino, evitando desequilibrios organolpticos y el riesgo de
inestabilidad biolgica.

35
I.2.4. Produccin de glicerina.

Determinados metabolitos producidos por las levaduras como los polialcoholes y

otros elementos estructurales procedentes de la pared celular como polisacridos y
manoprotenas son aportados por la clula de levadura al vino durante la
fermentacin.

Estos metabolitos y polmeros estructurales tienen un efecto positivo sobre el vino

final aportando suavidad, dulzor, densidad en boca e integracin.

La glicerina es el segundo componente fermentativo cuantitativamente ms

importante del vino despus del etanol. Por no tratarse de un compuesto voltil, no
tiene un impacto directo en las caractersticas aromticas del vino, sin embargo
presenta otras cualidades sensoriales, aporta sabor ligeramente dulce y debido a su
naturaleza viscosa contribuye a la suavidad, consistencia y cuerpo de los vinos.

Muchos son los factores que influyen en los contenidos finales de glicerol:

Variedad de vinfera.
Composicin nitrogenada.
Grado de maduracin (contenido azucarado).
Infeccin por mohos (producen elevados contenidos en glicerol y cidos
urnicos).
Contenidos de SO2
pH del mosto.
Temperatura de fermentacin.
Grado de aireacin.
Cepa utilizada.
Concentracin del inculo.

El glicerol deriva de la degradacin glicoltica de los azcares en las etapas iniciales

de la fermentacin. Aproximadamente un 8% de molculas de azcares del mosto

36
van a ser degradadas mediante fermentacin gliceropirvica, siguiendo la ecuacin
de Neuberg:

GLUCOSA GLICERINA + CIDO PIRVICO

En la Figura I.19. se muestra la ruta de formacin de este compuesto. La

dihidroxiacetona fosfato es reducida a glicerol fosfato mediante la enzima DAP-
reductasa con la consiguiente recuperacin del cofactor oxidado (NAD+). El glicerol
fosfato es entonces desfosforilado rindiendo glicerol.

Figura I.19. Ruta metablica de formacin de glicerol en las etapas iniciales de la fermentacin

37
El NADH2 liberado en la reaccin glicoltica (3-fosfogliceraldehdo cido 3-
fosfoglicrico) se oxida gracias a la reduccin de la cetona, al principio del proceso
fermentativo, cuando la cantidad de acetaldehdo formada es escasa (Figura I.20.).
Esto ocurre justamente al comienzo del desarrollo de las levaduras; la
fosfodihidroxiacetona sirve de aceptora de hidrogeniones, y al mismo tiempo permite
la acumulacin de acetaldehdo, que actuar de molcula efectora desencadenando
la fermentacin alcohlica propiamente dicha. Incluso en la fase tumultuosa se
considera que no hay fermentacin alcohlica pura. Por tanto la fermentacin
alcohlica y la gliceropirvica estn estrechamente relacionadas a lo largo de toda la
vinificacin.

Fructosa-1,6- bifosfato

Dihidroxiacetona fosfato Gliceraldehdo-3-fosfato

Pi
NAD+

NADH + H+

Glicerol-3-fosfato 1,3-Bifosfoglicerato

H2O 2ADP

H3PO4 2ATP

Glicerol Piruvato

Productos secundarios

Figura I.20. Va de la fermentacin gliceropirvica

Por otro lado, el cido pirvico formado en esta fermentacin no encuentra NADH2
disponible para poder reducirse a lctico y es por ello que esta molcula se considera

38
el origen de otros productos secundarios. El vinificador deber privilegiar la
fermentacin alcohlica pura y limitar la gliceropirvica, puesto que la presencia
incrementada de algunos de estos compuestos secundarios resulta perjudicial para la
calidad de los vinos.

Las funciones fisiolgicas de la sntesis de glicerol estn relacionadas con el balance

redox, resistencia osmtica y al estrs oxidativo, reciclado del fosfato inorgnico en el
citosol y metabolismo del nitrgeno. Adems el glicerol 1-3-fosfato, precursor del
glicerol, es un intermediario metablico esencial en la biosntesis de lpidos de
membrana. Durante las fermentaciones vnicas, el principal papel de la sntesis de
glicerol es suministrar a la clula de un soluto con el que compensar el estrs
osmtico y equilibrar el balance redox intracelular para convertir el exceso de NADH
generado durante la formacin de biomasa en NAD+.

El glicerol as formado abandona la clula por difusin pasiva (Gancedo et al., 1968),
interviniendo en este proceso cierta protena especfica (Luyten et al., 1994, 1995).
Pero en el caso de fuertes presiones osmticas la levadura deja de expresar esta
protena acumulando mayores cantidades de etanol en su citoplasma. El exceso de
glicerol se eliminar entonces mediante el fenmeno de difusin simple, sin
necesidad e intervencin de ninguna protena.

Lo normal es que bajo condiciones controladas, las concentraciones de glicerol sean

mayores en vinos tintos que en blancos, oscilando entre los 5 y 8 g/L no obstante la
seleccin de cepas de levadura permite elegir individuos con producciones que
pueden superar en ocasiones lo 10 g/L. El umbral sensorial de deteccin del glicerol
se observa a 5,2 g/L en vinos mientras que un cambio en la viscosidad slo puede
medirse a partir de 25 g/L.

39
I.2.5. Autolisis de las levaduras. Liberacin de polisacridos de pared.

La autodegradacin enzimtica de los constituyentes celulares de las levaduras, ha

sido objeto de numerosos estudios, resultando de ellos mltiples aplicaciones
prcticas durante el proceso de maduracin o afinado de los vinos.

Los productos autolticos de las levaduras pueden condicionar la calidad

organolptica del producto final, mejorando su cuerpo y estructura, estabilizando su
color y aportando nuevos aromas. Por ello, la seleccin de levaduras de fcil autolisis
y con gran liberacin de polisacridos puede representar importantes ventajas
organolpticas en la vinificacin de tintos.

La pared celular es una envoltura exterior de la levadura que aisla al microorganismo

del medio que le rodea. De naturaleza esencialmente polisacrida, se trata de una
capa rgida dotada de cierta elasticidad, que representa entre el 15 y el 25% del peso
seco de la clula. Como se observaba en la Figura I.2., est separada de la
membrana celular por el espacio periplsmico, un espacio difano por el que circulan
enzimas periplsmicas. Se compone de polisacridos y manoprotenas (35%)
entramadas mediante fibras de glucano (-1,3glucanos y -1,6 glucanos, 25% y 4%
respectivamente) y quitina (1-2%).

Las principales funciones fisiolgicas que desempea son:

Proteccin fsica.
Estabilidad osmtica.
Barrera de permeabilidad.
Soporte de enzimas.
Ligado de cationes.
Reconocimiento clula-clula.
Adhesin clula-clula.

40
Por otro lado, la membrana celular es una estructura muy estable y hermtica con
permeabilidad selectiva que controla los intercambios entre la clula viva y el medio
exterior. Como toda membrana biolgica, est constituida principalmente por lpidos y
protenas. Los lpidos son esencialmente fosfolpidos y esteroles, molculas que
cuentan con una parte hidrfoba y otra hidrfila

La muerte celular producida en las ltimas etapas de la fermentacin provoca la lenta

destruccin del entramado polimrico que forman la pared y la membrana celular.
Dicha desnaturalizacin de los sistemas de membrana permite la liberacin de
enzimas hidrolticos y su puesta en contacto con los sustratos.

Consecuentemente, se produce el vaciado del contenido celular y la ruptura de estos

biopolmeros en otros de menor peso molecular. Adems, las numerosas actividades
enzimticas de las levaduras durante este proceso originan la formacin de
numerosos compuestos voltiles de gran inters.

Esta degradacin depende principalmente de una fuerte actividad de -(1-3)-

glucanasas localizadas en la pared (Fleet y Phaff, 1974; Hien y Flett, 1983).
Freyssinet (1988), Charpentier y Freyssinet (1989) propusieron las siguientes etapas
como descripcin del proceso:

Desde el principio de la autolisis, las actividades de una exo y de una endo -

(1-3)-glucanasas liberan una mezcla de polisacridos y de cortas cadenas
oligosacridas. Una parte de estos polisacridos corresponden a las
manoprotenas que estaban verdaderamente unidas al glucano en la pared
intacta.

Ms tarde, la hidrlisis parcial del glucano origina una desestabilizacin de la

estructura parietal, originando la liberacin de manoprotenas de alto peso
molecular no encerrando ms que un pequeo porcentaje de glucosa y
proviniendo en su mayor parte de la zona periplsmica.

41
 Los glucanos parietales continan siendo degradados por las -(1-3)-
glucanasas, todava activas en la pared y presentes igualmente en el medio
extracelular.

Al final de la autolisis las exo -(1-3)-glucanasas solubilizadas en el medio de

autolisis degradan el glucano unido al las manoprotenas, quienes podrn ser
hidrolizadas por -manosidasas y por las proteasas.

El pH ligeramente cido del vino, el grado alcohlico y la liberacin de enzimas

celulares favorecen este fenmeno.

Este proceso es una consecuencia natural en toda fermentacin pero resulta ms

acusado en vinos donde se prolonga la crianza sobre las como en la elaboracin de
vinos espumosos y en los vinos de crianza sobre las. El envejecimiento de los
mismos en contacto con las mismas, provoca un enriquecimiento en distintos
compuestos (nitrogenados, sustancias voltiles, lpidos, y manoprotenas), lo que
supone una mayor suavidad y mejor estructura y cuerpo de los vinos adems de la
liberacin de nutrientes que pueden favorecer la fermentacin malolctica.

I.2.6. Efecto de la temperatura

I.2.6.1. Influencia sobre las levaduras

La temperatura juega un papel esencial en la distribucin ecolgica de las especies

de manera ms intensa que cualquier otro factor fsico. Afecta a todas las especies
de levaduras vnicas tanto en exceso como por defecto.

Todo microorganismo presenta tres temperaturas cardinales que marcan tres

intensidades diferentes en su vitalidad. A la temperatura mnima, el microorganismo
est vivo, pero no desarrolla con normalidad sus funciones de crecimiento y
reproduccin. Sin embargo, a la temperatura ptima el desarrollo de todas las
funciones vitales es mximo. La velocidad de consumo de alimentos es enorme y la

42
velocidad de multiplicacin alcanza valores mximos, coincidiendo con las mejores
concentraciones de nutrientes. Finalmente, la temperatura mxima es aquella en la
que el microorganismo suspende de nuevo su proceso metablico y por tanto deja de
crecer y reproducirse, es decir, queda inactivo pero vivo. Despus de sta, se
alcanza muy rpido la temperatura letal a la que la especie sufre la muerte
instantnea de todas sus clulas vegetativas.

El efecto de la temperatura en el crecimiento de cualquier especie microbiana origina

una curva caracterstica a modo de campana de Gauss con el mximo desplazado a
la derecha, tal como representa la Figura I.21.

El margen o rango entre temperatura mxima y mnima vara mucho entre especies.
Este hecho viene a definir las categoras de los microorganismos en relacin a su
comportamiento frente al factor trmico.

ptimo

Velocidad de
crecimiento

Mnimo Mximo

Temperatura

Figura I.21. Efecto de la temperatura sobre la velocidad de crecimiento de cualquier especie microbiana

Adems, para cada una de las funciones vitales, respiracin, reproduccin y

fermentacin existen distintos valores de temperatura ptima que dependen no slo
de la especie o cepa sino tambin del grado de aireacin, composicin qumica del
mosto y etanol formado.

43
La mayor parte de las especies del gnero Saccharomyces tienen su ptimo de
temperatura en torno a los 20 C. A temperaturas ms bajas, el nico factor limitante
es precisamente la propia temperatura, sin embargo, el etanol formado y la
disminucin de nutrientes son menos influyentes.

Por el contrario, a temperaturas ms elevadas, el etanol entorpece el crecimiento y

desarrollo poblacional de las levaduras resultando un poder fermentativo inferior.
Adems temperaturas demasiados elevadas pueden provocar el desarrollo de
bacterias responsables de las alteraciones del vino, prdida de aromas primarios
procedentes de la uva, embastecimiento del vino y eliminacin de etanol por
evaporacin.

La variacin de la temperatura en un intervalo comprendido entre 4 y 40 C afecta al

funcionamiento de numerosas actividades enzimticas, pero en ausencia de
productos txicos no induce mortalidad celular. Sin embargo, ms all de estos
lmites s se observa una mortalidad inducida por el calor.

Si la temperatura se sita por debajo de los 4 C la acidificacin intracelular que se

produce parece ser el mecanismo subyacente de la induccin de mortalidad
(Cardoso y Leao, 1992), sin embargo cuando la muerte celular es por exceso parece
estar ligada a fenmenos de desnaturalizacin proteica a nivel de la membrana
interna de la mitocondria (Simoes-Mendes et al., 1978)

Diversos estudios han demostrado tambin que la levadura es ms sensible a la

temperatura al comienzo de su desarrollo y resiste mejor al final de la fermentacin.
Por esta razn se aconseja, en vinificacin en tinto, comenzar la fermentacin entre
18 y 20 C y dejar subir progresivamente, alcanzando hasta un mximo de 32 C en
el sombrero y de 25-28 C en el resto del tanque, para favorecer los fenmenos de
maceracin.

44
I.2.6.2. Influencia sobre la velocidad de fermentacin

La influencia de la temperatura sobre el desarrollo de la fermentacin alcohlica es

relativamente compleja.

La experiencia de Cantarelli (1984) sobre los efectos de la temperatura y de otras

variables (pH, azcares, nitrgeno y polifenoles) en la fermentacin del mosto de uva
demuestra que la temperatura condiciona, no slo el rendimiento en alcohol, sino
tambin la produccin de biomasa y la acumulacin de productos secundarios
importantes.

Segn este investigador la temperatura produce sus efectos sobre:

Metabolismo celular: velocidad de reproduccin, actividad glicoltica, y

tolerancia al etanol.
Desarrollo de la propia microflora.
Cesin de sustancias solubles de las partes slidas de la uva.
Acumulacin de aceptores de SO2.
Tensin de vapor y volatilidad de productos aromticos, y en consecuencia,
prdida de los mismos por el CO2 desprendido en el curso de la fermentacin.

Las variaciones producidas por este factor sobre el poder fermentativo no muestran
una relacin lineal. El rendimiento de alcohol es generalmente inferior a temperaturas
elevadas; pudiendo deberse a un mayor arrastre por el dixido de carbono, es decir,
a bajas temperaturas las fermentaciones son ms lentas pero generalmente el grado
alcohlico alcanzado es mayor que a temperaturas elevadas o superiores a los 30-
35 C. (Mller-Thurgau, 1884, descrito por Riberau, Gayon y col.1989).

Por otro lado, a altas temperaturas, la mayora de los productos secundarios de la

fermentacin gliceropirvica se encuentran en concentraciones ms elevadas. Los
cidos grasos, los alcoholes superiores y sus steres son los ms afectados; su
formacin es mxima alrededor de 20 C y disminuyendo luego de forma progresiva.

45
I.2.6.3. Fermentaciones a baja temperatura

Es sabido que las fermentaciones espontneas de los mostos de uva rara vez
arrancan a temperaturas inferiores a 10 C; a temperaturas ligeramente superiores la
velocidad de fermentacin suele ser moderada, creciendo ligeramente con el
aumento de la temperatura.

La velocidad de fermentacin se refiere a la cantidad de alcohol o de CO2 producido

por unidad de tiempo y en general, la velocidad aumenta y la fermentacin se acorta
al incrementarse la temperatura.

Como sealaba Marcilla (1974), los bruscos descensos de la temperatura de

fermentacin pueden ocasionar la paralizacin de la misma y aunque la calidad del
vino no se vea afectada de un modo directo, la reanudacin de la misma ya en medio
alcohlico puede no resultar fcil.

Sin embargo, frente a descensos graduales de la temperatura los inconvenientes son

nulos y las fermentaciones siguen, ms lentas, pero con toda regularidad.

Casi todas las levaduras se habitan muy pronto a producir fermentaciones a baja
temperatura si sta desciende poco a poco, cuando an la levadura conserva su
poder reproductivo.

El hecho de que las fermentaciones sean ms lentas, implica una mayor regularidad
de las mismas, obteniendo vinos ms finos y aromticos y en ocasiones un mayor
grado alcohlico.

Esta posibilidad puede resultar interesante en el proceso tecnolgico de la bodega y

es por ello por lo que ha sido estudiada en este trabajo.

46
I.3. BIBLIOGRAFA

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52
I.4. OBJETIVOS

Seleccin de cepas de levaduras ptimas para la vinificacin en tinto en la

bodega de Trujillo, empleando criterios clsicos de seleccin de levaduras
para vinificacin y especficos para la elaboracin de tintos.

Determinacin de la resistencia al estrs fermentativo de las distintas cepas

de levadura en presencia de concentraciones crecientes de etanol.

Estudio del comportamiento de las cepas en fermentaciones a baja

temperatura con el fin de plantear esta posibilidad en dicha bodega.

53
II. MATERIALES Y MTODOS

54
II. MATERIALES Y MTODOS

II.1. PRESELECCIN REALIZADA

II.1.1. Obtencin de las cepas de levadura

Se trabaj con variedades de uva Garnacha y Shyraz procedentes de la bodega.

El procedimiento seguido fue el indicado a continuacin: (Figura II.1.)

Siembra en placa con agar

Medio YEPD

Variedades de uva:
Shyraz
Garnacha

Sincronizacin de las levaduras

Figura II.1. Proceso esquemtico seguido para la obtencin de las distintas levaduras

Las uvas fueron machacadas en seis Erlenmeyer mediante varilla de vidrio y el

mosto obtenido se dej en contacto con el resto de uva durante 3-4 das a 25 C
para que fermentase. Dos de los Erlenmeyer contenan uva de la variedad Shiraz y
los cuatro restantes Garnacha. Segn la variedad correspondiente fueron
identificados como S1, S2, G1, G2, G3 y G4.

Transcurridos tres das se realiz un banco de diluciones (10-1 hasta 10-7) de cada
muestra. Posteriormente, se hizo una siembra en placas Petri con agar y se dej en
la estufa a 30 C hasta conseguir un crecimiento adecuado de las colonias.

55
Se seleccionaron aquellas placas que presentaban colonias ms diferenciadas con
un nmero entre 30 y 300 y se sembraron, despus de aisladas, en tubos de agar
inclinados.

Tras dejar que se produjera el crecimiento de las levaduras en estufa a 25 C, se

retiraron aquellos tubos que presentaban contaminaciones por mohos o no ofrecan
un crecimiento adecuado.

A los doce das de fermentacin se repiti el mismo procedimiento.

A continuacin, se realizaron tres pases sucesivos para sincronizar las levaduras

disponibles:

Un primer pase de tubo a tubo con medio YEPD (2% glucosa, 2% peptona y
1% extracto de levadura)

Transcurridos tres das a 25 C se realiz un segundo pase de 100 l de

muestra a otro tubo con YEPD.

El tercer pase se produjo de igual forma a los 2 das.

II.1.2. Seleccin de las cepas objeto de estudio

Al cabo de dos das las levaduras presentaban un crecimiento favorable para

poderlas inocular en mosto y aplicar los criterios bsicos de seleccin para obtener
las cepas de levadura objeto de estudio.

Se realizaron diversos ensayos aplicando distintos criterios (Figura II.2.) para reducir
el nmero de cepas hasta llegar a las seis identificadas en la figura mencionada.

56
 1 SELECCIN
30 cepas de
levadura + 7VA
Criterio:
Poder fermentativo y
cinticas

2 SELECCIN
30 cepas de
levadura + 7VA 12 cepas de
Criterio: levadura + 7VA
Resistencia a cidos
grasos

G2T1 G2T4 G2T5

3 SELECCIN
12 cepas de
levadura + 7VA +
Criterios:
7VA
Poder fermentativo, G3(7) S2(4) S2(11)
cinticas y acidez voltil a
distintas temperaturas

Figura II.2. Primeros criterios de seleccin

En primer lugar, se evalo el poder fermentativo de cada una de ellas. Para ello se
emple un mosto de 16 B (303,3 g/L) y 28,5 Brix obtenido mediante mezcla de
mosto fresco, mosto concentrado y agua destilada, para las levaduras conseguidas al
los tres das de fermentacin y mosto 16,2 B (307,5 g/L) y 24,8 Brix para las
obtenidas a los doce das. El procedimiento seguido fue idntico para todas ellas.

La fermentacin se estudi haciendo uso de microvinificadores con 50 ml cada uno

de mosto y 1 ml de levadura, que fueron sellados con vlvula Mller.

Durante 15 das se tomaron los pesos de los distintos viales hasta asegurar que la
fermentacin haba terminado y se escogieron las treinta levaduras que presentaron
un mayor poder fermentativo.

57
A continuacin se evalo la resistencia a cidos grasos. Para ello se determin de
nuevo el poder fermentativo de estas treinta levaduras y se incorpor la levadura
7VA como testigo por su buen comportamiento en vinificacin de tintos. En esta
ocasin el mosto empleado presentaba una densidad de 26,6 Brix y un pH inicial de
3,75, por lo que se acidific mediante la adicin de cido sulfrico al 36% hasta pH
3,45.

A cada vial se adicionaron 100 l de cido decanoico junto con los 50 ml de mosto y
1 ml de levadura correspondiente. Se hizo por triplicado para cada levadura.

Por ltimo se seleccionaron las seis levaduras que, junto con la levadura testigo
(7VA), han sido objeto de estudio en este trabajo. Para ello se evalo de nuevo su
poder fermentativo as como las cinticas fermentativas y se valor la acidez voltil
en cada caso. Se emple mosto de 14,5 B (268 g/L) y un pH de 3,72. Las
fermentaciones, realizadas por triplicado para cada levadura, se llevaron a cabo a
temperaturas constantes de 23 C y 30 C.

II.2. PREPARACIN DE LA COLECCIN DE LEVADURAS

Se emple YEPD-Agar como medio de cultivo. (1% extracto de levadura, 2%

peptona, 2% glucosa, 2% agar).

Tras aadir 5 ml de dicho medio a los tubo de ensayo utilizados para la resiembra,
stos fueron esterilizados mediante el autoclave a 120 C durante 15 minutos.
Posteriormente, se dej enfriar en posicin tumbada para que el agar solidificase de
forma adecuada.

Una vez fros, se realiz un primer pase en estra de las siete levaduras empleando
para ello una aguja. Pasados dos das, tras un correcto crecimiento, se hicieron dos
pases ms de la misma forma que el anterior (Figura II.3.).

58
 Figura II.3. Coleccin de cepas seleccionadas

Las cepas fueron conservadas en el frigorfico a una temperatura aproximada de 4 C

durante todo el estudio.

II.3. PODER FERMENTATIVO

El poder fermentativo de las levaduras fue determinado mediante microvinificaciones

de 50 ml de mosto.

Para ello, se emplearon viales esterilizados en autoclave a 120 C durante 15

minutos y sellados mediante vlvula Mller con cido sulfrico, para evitar posibles
contaminaciones durante la fermentacin.

Se utiliz mosto congelado al que se le determinaron los siguientes parmetros:

pH de 3,97, mediante pH-metro

Concentracin en azcar de 13,3 B (240,5 g/L), mediante aermetro.
Densidad 1100 g/L mediante densmetro.

Se aadi 1 g/L de enocianina en polvo (SECNASA, Valencia) para evaluar

posteriormente la formacin de vitisinas y la evolucin del contenido de antocianos
monomricos con cada levadura.

59
A continuacin, se prepararon 14 tubos de YEPD, esterilizados en autoclave a
120 C durante 15 minutos para la sincronizacin de las levaduras. Se realizaron dos
resiembras.

El primer pase se hizo mediante asa sobre 5 ml de medio YEPD. Transcurridas 24

horas se realiz el segundo, de 0,1 ml sobre 5 ml de medio YEPD.

Cada uno de los viales fue inoculado con 1 ml de levadura, hacindolo por triplicado
para cada una de ellas. Las fermentaciones se realizaron isotrmicamente,
manteniendo los microfermentadores a temperatura ambiente durante todo el
proceso (25 C aproximadamente).

Se recogieron los pesos durante 21 das, hasta comprobar que haba finalizado la
fermentacin.

El poder fermentativo se ha calculado gravimtricamente (Vaughan-Martini y Martini,

1988) evaluando la prdida de peso por liberacin de CO2 entre el inicio y el final de
la fermentacin mediante la siguiente estimacin:

PF ( Etanol) = [ P final (g) P inicial (g) ]* 2,5

II.4. CINTICA FERMENTATIVA

El seguimiento de las cinticas fermentativas se realiz de forma gravimtrica,

mediante la determinacin de la prdida de peso durante las microvinificaciones de
50 ml de mosto en viales sellados mediante vlvula Mller.

Este criterio se ha estudiado grficamente representando las variaciones de peso

diarias frente al tiempo transcurrido en das.

60
II.5. ACIDEZ VOLTIL

La acidez voltil se ha determinado segn el mtodo Cazenave a partir de los mostos

fermentados mediante microvinificadores con cada una de las cepas en estudio,
segn se indica en el apartado II.3.

Siguiendo este mtodo, cada muestra fue sometida a vaco durante dos o tres
minutos para la eliminacin del CO2. Para ello se emple un kitasato y una bomba de
vaco.

A continuacin se destilaron las muestras mediante arrastre de vapor, haciendo uso

del destilador automtico DEE Gibertini conectado a una unidad generadora de vapor
VADE 3 Gibertini ( Gibertini Electrnica SRL, Novate, Italia), ( Figura II.4.).

Figura II.4. Destilador autmatico

Una vez destiladas, se valoraron con sosa, Na(OH) 0,1 N. de factor conocido 0,99
en presencia de fenolftaleina como indicador.

61
La acidez voltil se determino segn indica el mtodo mediante la frmula (Recueil
des Mthodes Internacionales dnalyse des Vins. O.I.V.):

V * f * 0,6 = g/L de acidez voltil expresada en cido actico.

Siendo:

V: Volumen de sosa empleado en la valoracin.

f: Factor de la disolucin de Na(OH) 0,1 N.

II.6. PRODUCCIN DE CIDO MLICO.

La produccin de cido mlico se determin de forma enzimtica sobre los mostos

fermentados por cada una de las cepas de estudio, segn se indica en el apartado
II.3. Previamente fueron diluidos con agua MilliQ, siendo el factor de dilucin 1:10 v/v.

Para ello, se utiliz el test N 10 139 0.68 035 ( Boehringer Mannheim / R-Biopharm,
Darmstadt, Germany) para determinacin de cido mlico en alimentos.

Dicha determinacin se basa en la medida de la variacin de absorbancia a una

longitud de onda de 340 nm que se produce al reducirse el NAD+ a NADH como
consecuencia de la oxidacin del cido mlico a oxalacetato por la enzima L-malato
deshidrogenasa (Figura II.5.), (Mollering ,1974); (Mayer y Pause, 1969); (Klopper,
Angelino, Tuning y Vermeire, 1986); (Gutmann, Wahlefeld, 1974).

L-MDH
L-malato + NAD+ Oxalacetato + NADH + H+

GOT
Oxalacetato + L- glutamato L-Aspartato + 2-Oxoglutarato

Figura II.5. Reacciones que se suceden para la determinacin de cido mlico

62
Para ello se pipetearon las siguientes cantidades en dos cubetas (blanco y muestra)
de 1 cm de espesor:

o Solucin 1: 500 l.
o Solucin 2: 100 l.
o Suspensin 3: 5 l.
o Muestra: 50 l (nicamente en la cubeta correspondiente).
o Agua MilliQ: 500 . en la cubeta del blanco y 450 l en la de la muestra.

Una vez mezclado y pasados tres minutos a temperatura ambiente, se midi

mediante espectrofotmetro la absorbancia A1.

A continuacin, se adicionaron 5 l en ambas cubetas de la solucin 4, se volvi a

mezclar y se determin la absorbancia A2 tras 5-10 minutos de espera.

Contenido de las soluciones:

Solucin 1: Gliciglicina, cido L-glutmico.

Solucin 2: NAD
Suspensin 3: Glutamato-oxalacetato transaminasa (GOT)
Solucin 4: L-malato deshidrogenasa ( L-MDH)

A partir la absorbancias medidas se determin el contenido de cido mlico

aplicando la siguiente frmula:

C cido mlico (g/L) = [ ( V * MW) / ( *d * v * 1000)] * A

A = ( A2 A1) muestra ( A2 A1) blanco

Siendo:
V: Volumen final (ml)
v: Volumen de la muestra (ml)
MW: Peso molecular de la glucosa.
d: Paso de la luz a travs de la cubeta (cm).
: Coeficiente de extincin del NADPH para cada longitud de onda

63
En este caso, corresponder:

C cido mlico (g/L) = [(1,110 *134,09) / (6,3 * 1 *0,050 * 1000)] * A

El resultado se multiplic por el factor de dilucin de la muestra.

II.7. DETERMINACIN DE GLICERINA

La determinacin de glicerina se realiz enzimticamente sobre los fermentados por

cada cepa de levadura, segn se indica en el apartado II.3. Previamente fueron
diluidos con agua MilliQ, siendo el factor de dilucin 1:20 v/v.

Los anlisis se han realizado mediante el test N 0148270 ( Boehringer Mannheim /

R-Biopharm, Darmstadt, Germany) para determinacin de glicerina en alimentos.

La determinacin se basa en la medida de la variacin de absorbancia a una longitud

de onda de 340 nm que se produce al oxidarse el NADH a NAD+ como
consecuencia de la reduccin del piruvato a L-lactato por accin de la enzima L-
lactato deshidrogenasa (Eggstein y Kuhlmann, 1974); (Walter y Kohler, 1985).

Las reacciones que se suceden son las siguientes: (Figura II.6.)

El glicerol es fosforilado por el ATP ( Adenosin-5-trifosfato), pasando a L- Glicerol-3-

fosfato, bajo la accin de la enzima Glicerolquinasa (GK) (1).

A continuacin, el ADP resultante (adenosin-5-difosfato), es reconvertido en ATP

gracias al Fosfoenolpiuvato (PEP), siendo esta reaccin catalizada por la enzima
Piruvatoquinasa (PK) y frmndose Piruvato como resultado (2).

Por ltimo, y en presencia de la enzima L-lactato deshidrogenasa (L-LDH), el

Piruvato es reducido a L-lactato y el NADH se oxida a NAD+ (3).

64
 GK
(1) Glicerol + ATP L-Glicerol-3-fosfato + ADP

PK
(2) ADP + PEP ATP + Piruvato

L-LDH
(3) Piruvato + NADH + H+ L-Lactato + NAD+

Figura II.6. Reacciones que tienen lugar durante la determinacin del contenido en glicerina

Se adicionaron las siguientes cantidades de las soluciones que este test contiene:

o Solucin 1: 500 l.
o Muestra: 50 l. (en la cubeta correspondiente)
o Agua MilliQ: 1000 l en el blanco y 950 l en la cubeta que contena la
muestra.
o Suspensin 2: 5 l.

Se esperaron 7 minutos a temperatura ambiente y se tom la primera medida de

absorbancia A1.

Finalmente, se adicionaron 5 l de la suspensin 3 y tras mezclar y esperar el mismo

tiempo se midi la segunda absorbancia A2.

Contenido de las soluciones:

Solucin 1: Gliciglicina como sustancia tampn.

Suspensin 2: Enzimas Piruvatoquinasa (PK) y L-lactato deshidrogenasa ( L-
LDH)
Suspensin 3: Enzima Gliceroquinasa (GK)

65
A partir la absorbancias medidas se determin el contenido en glicerina aplicando las
siguientes frmulas:

C Glicerina (g/L) = [ ( V * MW) / ( *d * v * 1000)] * A

A = ( A1 A2) muestra ( A1 A2) blanco

Siendo:

V: Volumen final (ml)

v: Volumen de la muestra (ml)
MW: Peso molecular.
d: Paso de la luz a travs de la cubeta (cm)
: Coeficiente de extincin del NADPH para cada longitud de onda

En este caso, corresponder:

C Glicerina (g/L) = [ (1,510 *92,1) / (6,3 * 1 *0,050 * 1000)] * A

El resultado se multiplic por el factor de dilucin de la muestra.

II.8. ANLISIS DE PERFILES DE ANTOCIANOS MEDIANTE HPLC

Se determinaron los diferentes antocianos contenidos en las 21 fermentados de las

cepas de levadura en estudio, obtenidos segn se indica en el apartado II.3.

Las muestras se analizaron mediante un cromatgrafo de lquidos Waters (Milford,

MA) equipado con una controladora 600-MS, un inyector automtico 717 plus y un
detector de array de fotodiodos 996 (Figura II.7.).

66
 Figura II.7. Cromatgrafo HPLC (Waters) utilizado, con detector array de fotodiodos

Se utiliz gradiente de disolvente A (agua/cido frmico, 90:10, v/v) y B (metanol) en

una columna de fase reversa Nova-pack C18 (300 x 3,9 mm) como se indica a
continuacin: 0-20% B lineal (flujo de 0,8 ml/min) de 0 a 5 minutos, 20-50% B Lineal
(0,8 ml/min) de 5 a 70 minutos y un reequilibrado de la columna de 70 a 95
minutos.

La deteccin se hizo determinando los espectros de absorcin de 500 a 600 nm. La

cuantificacin se realiz extrayendo los cromatogramas a 525 nm y mediante
calibrado del equipo utilizando estndar externo de cloruro de malvidn-3-O-
glucosido.

Se inyectaron volmenes de muestra de 100 l de cada fermentado, previamente

filtrados mediante filtros de membrana de acetato de celulosa de 0,45 m de
dimetro de poro.

67
La Tabla II.1. recoge todos los antocianos estudiados en las muestras.

Tabla II.1. Antocianos presentes en Vitis Vinifera L.

Smbolo Antocianos
D3G Delfinidin-3-O-glucosido
Cy3G Cianidin-3-O-glucosido
Pt3G Petunidin-3-O-glucosido
Pn3G Peonidin-3-O-glucosido
M3G Malvidin-3-O-glucosido
D3G6Ac Delfinidin-3-O-(6-O-acetil)-glucosido
Cy3G6Ac Cianidin-3-O-(6-O-acetil)-glucosido
Pt3G6Ac Petunidin-3-O-(6-O-acetil)-glucosido
Pn3G6Ac Peonidin-3-O-(6-O-acetil)-glucosido
M3G6Ac Malvidin-3-O-(6-O-acetil)-glucosido
D3G6Cm Delfinidin-3-O-(6-O-p-cumaril)-glucosido
Cy3G6Cm Cianidin3-O-(6-O-p-cumaril)-glucosido
Pt3G6Cm Petunidin3-O-(6-O-p-cumaril)-glucosido
Pn3G6Cm Peonidin3-O-(6-O-p-cumaril)-glucosido
M3G6Cm Malvidin3-O-(6-O-p-cumaril)-glucosido
VIT A Malvidin-3-O-glucosido-piruvato
VIT B Malvidin-3-O-glucosido-aducto vinlico
Vph1 y 2 Vinifenoles

Los diferentes antocianos se identificaron por sus tiempos de retencin relativos con
respecto al antociano mayoritario en Vitis vinifera L., malvidin-3-O-glucosido, y
estudiando los espectros de absorcin UV-Visible y comparndolos con los
publicados en la literatura.

II.9. RESISTENCIA AL ETANOL

La resistencia al etanol de las levaduras en estudio fue determinada sometindolas a

fermentaciones de un mosto estndar, con un contenido en azcar correspondiente a

68
12 B (212 g/L), en presencia de distintas concentraciones de etanol de 99,9% de
pureza v/v.
Para ello se hizo una resiembra de las levaduras en 10 ml de medio YEPD
previamente esterilizado en autoclave durante 15 minutos a 120 C.

Se inocul 0,1 ml de cada una de las levaduras en doce tubos con 10 ml de mosto
estndar, esterilizados en las mismas condiciones que los anteriores. Tres de ellos
no contenan etanol, otros tres presentaban un 4%, tres un 6% y por ltimo tres con
un 8% de etanol.

Para determinar la resistencia al estrs fermentativo que supone las elevadas

concentraciones de etanol, se hizo un seguimiento del crecimiento de las levaduras
en las diferentes muestras. Para ello, se hizo un recuento de las unidades
formadoras de colonias presentes por mililitro haciendo uso de un microscopio
electrnico (Figura II.8.) y un cuentaglbulos calibrado en pequeos cubos de
0,00025 mm3 de volumen.

Los conteos se realizaron cada 2 das para un mejor seguimiento del crecimiento
microbiano.

Figura II.8. Microscopio electrnico empleado para el recuento de levaduras

69
Para expresar los resultados obtenidos en u.f.c. se aplic la siguiente frmula:

N * 4 * 106 = u.f.c./ ml, siendo N el nmero medio de clula contadas por cuadrado
de la retcula.

Los resultados se han expresado grficamente como u.f.c./ml frente a tiempo

transcurrido en das para observar la evolucin de cada una de ellas a las diferentes
concentraciones.

II.10. DETERMINACIN DE AZCARES RESIDUALES. GLUCOSA Y FRUCTOSA

Los azcares residuales fueron determinados sobre mostos estriles inoculados con
las levaduras en estudio, con una concentracin de etanol del 8%, y fermentados
segn la metodologa descrita en el apartado anterior. Con ello, se pretenda
determinar qu cantidad de azcares haban sido fermentados por las levaduras en
estas condiciones de estrs fermentativo.

La determinacin se realiz enzimticamente sobre los fermentados de cada cepa.

En algunos casos no fue necesaria su dilucin, pero en otros se tuvo que diluir hasta
100 veces con agua MilliQ.

Para ello, se empleo el test N 10 139 106 035 (Boehringer Mannheim / R-Biopharm,
Darmstadt, Germany) para determinacin de D-glucosa y D-Fructosa en alimentos.

Dicha determinacin se basa en la medida de la variacin de la absorbancia, a una

longitud de onda de 340 nm, como consecuencia de las distintas reacciones que se
producen por accin de diferentes soluciones que se adicionan a lo largo del
proceso:

La D-Glucosa y D-Fructosa son fosforiladas a D-Glucosa-6-fosfato y D-Fructosa-6-

fosfato por la accin conjunta de la enzima Hexokinasa y el Adenosin-5-Trifosfato;
con la formacin simultnea de adenosin-5- Difosfato (Figura II.8, (1) y (2)).

70
En presencia de la enzima Glucosa-6-Fosfato Deshidrogenasa, la Glucosa-6-Fosfato
es oxidada por el NADP+ a D-Gluconato-6-fosfato con la formacin de NADPH
(Figura II.8, (3)).
La cantidad de NADPH formado en la reaccin es proporcional a la cantidad de
D-Glucosa y es precisamente el NADPH lo que es medido mediante el incremento
de absorbancias.

Por otro lado, la Fructosa-6-Fosfato pasa a Glucosa-6-Fosfato por accin de la

Fosfoglucosa isomerasa (Figura II.8, (4)).

De nuevo se producen las reacciones anteriores, de forma que la cantidad de

NADPH obtenida esta reaccin corresponder a la cantidad de D-Fructosa presente
en la muestra, (Schmidt, 1961); (Bergmeyer, Bernt, Schmidt y Stork, 1974); (Bernt y
Bergmeyer, 1974); (Kunst, Draeger y Ziegenhorn, 1984); (Beutler, 1984).

HK
(1) D-Glucosa + ATP Glucosa-6-fosfato + ADP

HK
(2) D-Fructosa + ATP Fructosa-6-fosfato + ADP

G6P-DH
(3) Glucosa-6-fosfato + NADP+ D-gluconato-6-fosfato + NADPH + H+

PGI
(4) Fructosa-6-fosfato Glucosa-6-fosfato

Figura II.8. Reacciones que se producen para la determinacin de azcares.

Se adicionaron las siguientes cantidades a dos cubetas (blanco y muestra) de 1 cm

de espesor:

o Solucin 1: 500 l.
o Muestra: 50 l (en la cubeta correspondiente).
o Agua MilliQ: 950 l en la cubeta correspondiente a la muestra y 1000 l en la
del blanco.

71
Tras mezclar y esperar tres minutos, dejando las cubetas a temperatura ambiente, se
midi la absorbancia A1.

Para determinar la absorbancia A2 se aadieron 10 l de la solucin 2, se mezcl y

se tomaron medidas tras 10-15 minutos de espera.
Por ltimo se incorporaron 10 l de la solucin 3 a las cubetas, se mezcl el
contenido y se midi A3 transcurridos 10-15 minutos.

Contenidos de las soluciones:

Solucin 1: Trietanolamina, NADP, ATP y sulfato magnsico.

Solucin 2: Hexokinasa (HK) y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6P-DH)
Solucin 3: Fosfoglucosa isomerasa (PGI)

A partir de las tres absorbancias medidas se calcularon los contenidos en D-

Glucosa y D-Fructosa aplicando las siguientes frmulas:

C (g/L) = [ ( V * MW) / ( *d * v * 1000)] * A

A = ( A2 A1) muestra ( A2 A1) blanco

A = ( A3 A2) muestra ( A3 A2) blanco

Siendo:

V: Volumen final (ml)

v: Volumen de la muestra (ml)
MW: Peso molecular de la glucosa.
d: Paso de la luz a travs de la cubeta (cm).
: Coeficiente de extincin del NADPH para cada longitud de onda

72
En este caso, corresponder:

C glucosa (g/L) = [ (1,510 * 180,16 ) / (6,3 * 1 *0,050 * 1000)] * A

C fructosa (g/L) = [ (1,510 * 180,16 ) / (6,3 * 1 *0,050 * 1000)] * A

El resultado fue multiplicado por el factor de dilucin correspondiente a cada muestra.

II.11. LIBERACIN DE POLISACRIDOS

En primer lugar se prepar cierta cantidad de levadura liofilizada de cada una de las
cepas en estudio. Para ello se sigui el proceso que indica la Figura II.9. y que a
continuacin se explica.

LAVADO LIOFILIZACIN

Figura II.9. Proceso esquemtico de obtencin de levadura liofilizada

Se consigui una cantidad suficiente de masa de levadura mediante su cultivo en

medio YEPD. Para ello, se inocul cierta cantidad de patina, tomada con asa, en un
matraz Erlenmeyer con 50 ml de dicho medio, previamente esterilizado mediante
autoclave a 120 C durante 15 minutos.

Transcurridos 2 das en los que los matraces permanecieron a temperatura ambiente

(25 C aproximadamente), se hizo una segunda resiembra pasando su contenido a

73
matraces de mayor volumen que contenan 1500 ml de YEPD y que, al igual que los
primeros haban sido esterilizados con el fin de asegurar el crecimiento nico de la
levadura inoculada. Tras 1 semana a temperatura ambiente, se haba producido un
crecimiento suficiente de las levaduras.

Se elimin la mayor parte del lquido sobrenadante, pasando el resto del contenido a
vasos de precipitados, que se metieron en el frigorfico para acelerar la decantacin
de las levaduras. Una vez decantadas, se elimin de nuevo el lquido y el resto se
pas a tubos Falcon para realizar los lavados de la levadura.

Se hicieron tres lavados: Se igualaron los pesos con agua destilada para una
correcta centrifugacin y se centrifug a 2000 r.p.m. durante 4 minutos. A
continuacin se adicionaron 20 ml de agua destilada a cada tubo y se volvi a
centrifugar en las condiciones anteriores, repitindose este proceso hasta completar
los tres lavados.

Una vez lavada la masa de levadura, se congel para su posterior

liofilizacin (Figura II.10.).

Figura II.10. Liofilizador empleado para liofilizacin de las muestras

74
Posteriormente, se inocularon 0,8 g/L de levadura en un matraz con 50 ml medio
Feuillat, hacindolo por triplicado para cada una de ellas. (Charpentier, C; Feuillat, M.
1992).

Este medio se compone de 0,5 g de cido tartrico, 100 ml de etanol y agua

destilada hasta enrasar a un litro. Tras su preparacin y distribucin en los diferentes
matraces fue esterilizado mediante autoclave a 120 C durante 15 minutos para
evitar posibles contaminaciones.

Los matraces fueron agitados diariamente durante 1 hora a 120 r.p.m. durante el
tiempo que dur el ensayo (Figura II.11.).

Figura II.11. Agitacin orbital de las muestras durante 1 hora a 120 r.p.m.

Transcurrido un mes se hizo la primera preparacin para la determinacin de los

polisacridos liberados mediante la tcnica HPLC (Cromatografa lquida de alta
resolucin).

Una vez agitados los matraces, se pasaron 2 ml de su contenido a tubos Falcon y se

centrifugaron durante 15 minutos a 5000 r.p.m. Seguidamente se tom 1 ml del
lquido que qued en la parte superior y se pas a un nuevo tubo Falcon, se
adicionaron 5 ml de etanol y 50 l de cido clorhdrico 1 N. Tas agitar la mezcla se
dejaron reposar a 4 C durante 24 horas.

75
Pasado dicho tiempo, los tubos se centrifugaron a 8000 r.p.m. durante 15 minutos. A
continuacin se realizaron tres lavados:

Tras retirar el lquido sobrante se aadi 1 ml de etanol, se agit y se centrifug a

8000 r.p.m. durante 5 minutos.
A continuacin se realiz el segundo lavado de igual forma que el anterior. En el
tercero tan slo se adicionaron 250 l de etanol y se centrifug en idnticas
condiciones.

Se dejaron secar en la estufa a 45 C sobre un lecho de arena para mantener mejor

el calor.

A las 24 horas, tras comprobar que se haban secado correctamente, se aadi 1 ml

de Nitrato sdico 0,1 M. a cada uno de los tubos y se agit el contenido. Finalmente,
se pas a viales pequeos filtrando el lquido mediante filtros.

Los polisacridos se analizaron por cromatografa HPLC mediante separacin en

columna de exclusin molecular ultrahydrogel 250 (Waters, MA), utilizando como
eluyente NaNO3 0,1 M en isocrtico y detectando mediante ndice de refraccin.
El equipo utilizado fue un cromatgrafo Waters con bomba 600E, inyector 717 plus y
detector IR 2412.

Se repiti el proceso a los dos meses.

II.12. PODER FERMENTATIVO A BAJA TEMPERATURA

El poder fermentativo de las levaduras a baja temperatura fue determinado mediante

microvinificaciones de 50 ml de mosto. Durante el tiempo que dur la fermentacin
los viales se mantuvieron a 15 C.

76
Para ello, se emplearon viales esterilizados en autoclave a 120 C durante 15
minutos y sellados mediante vlvula Mller con cido sulfrico, para evitar posibles
contaminaciones durante la fermentacin.

Se utiliz mosto congelado al que se le determinaron los siguientes parmetros:

pH de 3,91, mediante pH-metro

Concentracin en azcar de 13,7 B (250 g/L), mediante aermetro.
Densidad 1105 g/L, mediante densmetro.

Se prepararon 14 tubos de YEPD, esterilizados en autoclave a 120 C durante 15

minutos para la sincronizacin de las levaduras. Se realizaron dos resiembras.

El primer pase fue mediante asa sobre 5 ml de medio YEPD. Transcurridas 24 horas
se hizo el segundo, de 0,1 ml sobre 5 ml de medio YEPD.

Cada uno de los viales fue inoculado con 1 ml de levadura, hacindolo por triplicado
para cada una de ellas.

Las fermentaciones se realizaron isotrmicamente, manteniendo los

microfermentadores a 15 C durante todo el proceso.

Se recogieron los pesos durante 21 das, hasta comprobar que haba finalizado la
fermentacin.

El poder fermentativo se ha calculado gravimtricamente (Vaughan-Martini y Martini,

1988) evaluando la prdida de peso por liberacin de CO2 entre el inicio y el final de
la fermentacin mediante la siguiente estimacin:

PF ( Etanol) = [ P final (g) P inicial (g) ]* 2,5

77
II.13. CINTICA FERMENTATIVA DE FERMENTACIONES A BAJA
TEMPERATURA

El seguimiento de las cinticas fermentativas se realiz de la misma forma que en el

apartado II.4; de forma gravimtrica, mediante la determinacin de la prdida de peso
durante las microvinificaciones de 50 ml de mosto en viales sellados mediante
vlvula Mller.

Este criterio se ha estudiado grficamente como representacin de las variaciones de

peso diarias frente al tiempo transcurrido en das.

II.14. ACIDEZ VOLTIL DE MOSTOS FERMENTADOS A BAJA TEMPERATURA

La acidez voltil se ha determinado segn el mtodo Cazenave a partir de los mostos

fermentados mediante microvinificadores con cada una de las cepas en estudio,
segn se indica en el apartado II.11.

Segn este mtodo, cada muestra fue sometida a vaco durante dos o tres minutos
para la eliminacin del CO2. Para ello se emple un kitasato y una bomba de vaco.

A continuacin se destilaron las muestras mediante arrastre de vapor, haciendo uso

del destilador automtico DEE Gibertini.

Una vez destiladas, se valoraron con Na(OH) 0,1 N. de factor conocido 0,99 en
presencia de fenolftaleina como indicador. La acidez voltil se determino segn
indica el mtodo mediante la frmula:

V * f * 0,6 = g/L de acidez voltil expresada en cido actico.

Siendo:
V: Volumen de sosa empleado en la valoracin.
f: Factor de la disolucin de Na(OH) 0,1 N.

78
II.14. BIBLIOGRAFA

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Bernt, E. y Bermeyer, H.U. 1974. In Methoden der enzymatischen Analyse

(Bergmeyer, H.U., Hrsg) 3. Aufl, Bd. 2, S. 1349-1352; Verlag Chemie, Weinheim and
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79
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Morata A.; Caldern F.; Colomo B.; Gonzlez M.C.; Uthurry C; Yeramian N;
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80
III. RESULTADOS Y DISCUSIN

81
III. RESULTADOS Y DISCUSIN

III.1. PRESELECCIN REALIZADA

III.1.1. Nomenclatura empleada

Cada cepa aislada va identificada con las letras G o S en funcin de la variedad

de uva a la que pertenecen, Garnacha o Shiraz respectivamente. El nmero que
acompaa a la variedad indica el matraz del que se obtuvo. El nmero identificativo
final va precedido de la letra T en aquellas cepas aisladas a los tres das de
fermentacin, e incluido en un parntesis cuando lo fueron a los 12 das.

III.1.2. Primera seleccin: Poder fermentativo y cinticas

Entre las 60 cepas aisladas a los tres das de fermentacin se escogieron las 22
cepas que presentaban un mayor poder fermentativo (Tabla III.1.). Todas ellas
alcanzaron valores similares superndose en todos los casos un contenido en
etanol del 13% v/v.
De la misma forma, se seleccionaron las cepas de mayor poder fermentativo entre
las obtenidas a los 12 das de fermentacin, recogidas en la Tabla III.2.

Comparando los valores obtenidos en cada caso, se observa que las cepas aisladas
a los tres das alcanzan poderes fermentativos superiores (2% aproximadamente) a
las cepas obtenidas a los 12 das de fermentacin.

Las concentraciones azucaradas de los mostos empleados en las

microvinificaciones fueron de16 B (303,3 g/L) y 16,2 B (307,5 g/L)
respectivamente, por lo que est diferencia no es atribuible al contenido en azcares.

Los valores obtenidos en ambos casos fueron inferiores a los esperados segn las
concentraciones azucaradas de los mostos de partida.

82
 Levaduras PFT
G2(1) 12,28
G2(8) 11,33
G2(10) 11,65
Tabla III.1. Poder fermentativo alcanzado Tabla III.2. Poder fermentativo
G2(12) 11,07 alcanzado
por las cepas seleccionadas, aisladas a los por las cepas seleccionadas, aisladas a los
tres das de fermentacin doceG3(7) 11,35
das de fermentacin
S2(4) 11,65
S2(11) 11,9
G2(13) 11,7
Levaduras PFT
G2T1 13,4
G2T2 13,2
G2T3 13,78
G2T4 13,85
G2T5 13,65
G2T7 14,6
G2T8 13,3
G2T9 13,65
G2T12 13,78
G2T14 14,23
S2T1 13,75
S2T2 13,38
S2T3 14,08
S2T4 13,7
S2T5 14,15
S2T6 13,1
S2T7 13,1
S2T8 13,15
S2T10 13,78
S2T11 13,13
S2T12 13,63
S2T14 13,55

Se estudiaron las cinticas fermentativas de cada una de las cepas aisladas a los
tres y a los doce das de fermentacin. Para ello se evaluaron las variaciones de
peso diarias frente al tiempo transcurrido.

Como muestra la Figura III.1., todas las cepas seleccionadas entre las aisladas a
los tres das consiguen cinticas fermentativas bastante regulares, sin elevaciones
excesivas de temperatura. Sin embargo se pueden detectar diferencias en cuanto a
su velocidad de fermentacin.
Las cepas S2T3, S2T12 y S2T14 son las ms rpidas y las que, por tanto, podran
dar mayores problemas trmicos. Por otro lado, las cepas G2T1, G2T8, G2T9,
G2T14, S2T6, S2T7, S2T8 y S2T11 muestran cinticas ms progresivas y por ello

83
resultan ms interesantes. En todos los casos la duracin total del proceso fue ms o
menos la misma.

1,60

1,40

1,20
Prdida Peso(g)

1,00

0,80

0,60

0,40

0,20

0,00
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Tiempo (das)

G2T1 G2T2 G2T3 G2T4 G2T5 G2T7 G2T8 G2T9 G2T12

G2T14 S2T1 S2T2 S2T3 S2T4 S2T5 S2T6 S2T7 S2T8
S2T10 S2T11 S2T12 S2T14

Figura III.1. Cinticas fermentativas de las cepas seleccionadas, aisladas a los tres das de fermentacin

Sin embargo las cepas seleccionadas entre las aisladas a los doce das (Figura III.2.)
presentan mayor dificultad en arrancar la fermentacin, con una fase de latencia ms
prolongada y una cintica ms irregular. El acabado es ms lento pudiendo dar
problemas en vendimias con alto contenido azucarado.

La duracin del proceso fue similar al caso anterior pero, tal y como indican las
cinticas y los poderes fermentativos alcanzados (Tabla III.2.), la presencia de
azcares residuales es mayor, no llegando a un correcto acabado.

84
 0,70

0,60
Prdida de Peso (g)

0,50

0,40

0,30

0,20

0,10

0,00
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Tiempo (das)

G2(1) G2(8) G2(10) G2(12) G3(7) S2(4) S2(11) G2(13)

Figura III.2. Cinticas fermentativas de las cepas seleccionadas, aisladas a los doce das de fermentacin

III.1.3. Segunda seleccin: Poder fermentativo y cinticas en presencia de cido

decanoico

En ocasiones, la vinificacin en tinto parte de una materia prima con un contenido

azucarado muy elevado. Por otra parte, la fermentacin tiene que ser simultaneada
con la maceracin de los hollejos para facilitar la extraccin y difusin de la materia
colorante y otros compuestos polifenlicos que van a dar al vino tinto su estructura
caracterstica y la capacidad antioxidante necesaria para soportar el envejecimiento
en barrica.

Todo ello hace que sean frecuentes las elevaciones de temperatura, especialmente
en las proximidades del sombrero de hollejos por la mayor concentracin de
levaduras existente, y sobre todo los finales de fermentacin con elevadas
concentraciones de etanol y un medio agotado en nutrientes para las levaduras.
Todos estos factores pueden ser causas de paradas de fermentacin y por tanto, de
presencia de azcares residuales no deseados.

85
Una forma de evaluar la resistencia de las cepas de levadura utilizadas en
vinificacin, especialmente en los acabados, es estudiar su capacidad de fermentar
en presencia de cidos grasos saturados de cadena corta.

En los finales de fermentacin, cuando el medio se vuelve ms reductor y los

nutrientes lipdicos escasean, la levadura no puede sintetizar cidos grasos
insaturados por la falta de oxgeno disponible (Henry, 1982); (Macy y Miller,1983).
Esto implica una rigidizacin de las membranas que dificulta la nutricin celular. Este
efecto txico de los cidos grasos saturados de cadena corta (Comi, duberts y
Valenti, 1990), (Kabara, 1979) que se acumulan en las membranas celulares, permite
que la fermentacin en presencia de cantidades elevadas de estas molculas sea
comparable a finales de fermentaciones difciles en vinificacin en tinto y hace que se
pueda utilizar como criterio de seleccin de levaduras resistentes al estrs
fermentativo.

La Tabla III.3. detalla los poderes fermentativos de las levaduras seleccionadas

segn este criterio.

Tabla III.3 Poder fermentativo alcanzado por las cepas

seleccionadas en presencia de cido decanoico (n=3
para las desviaciones estndar de las medias)

Levadura PFT
G2T1 8,21 1,05
G2T4 8,74 0,59
G2T5 8,57 0,44
G2T7 8,63 0,46
G2T8 8,87 0,23
G2T14 9,26 0,43
S2T1 9,63 0,55
S2T12 9,98 0,26
G3(7) 7,48 0,40
S2(4) 8,43 0,66
S2(11) 12,10 0,94
G2(13) 9,19 0,99
7VA 10,37 0,58

86
Estudios anteriores verificaron el buen comportamiento del testigo 7VA en estas
condiciones y aunque todas las cepas excepto la S2(11) presentan valores inferiores
a ella, las diferencias, sobre todo en el caso de la S2T1, G2T14, S2T12 y G2(13) no
son relevantes.

El efecto del cido saturado resulta ms importante en algunos casos, como la cepa
G3(7), no llegando a superar el 9% v/v de contenido alcohlico.

Cabe destacar la cepa S2(11) que consigue el poder fermentativo ms elevado,

soportando de forma satisfactoria las condiciones de estrs fermentativo existentes.

La Figura III.3. muestra las cinticas de las cepas de levadura seleccionadas en

presencia de cido graso saturado n-decanoico (C10). En todos los casos se produce
un retraso en el arranque de la fermentacin prolongndose la fase de latencia como
respuesta al estrs fermentativo. Se observa tambin que en presencia de C10 no se
fermentan todos los azcares quedando azcares residuales, sin alcanzarse el grado
alcohlico final del testigo, a excepcin de la cepa S2(11).

1,20

1,00
Prdida de peso (g)

0,80

0,60

0,40

0,20

0,00
0 2 4 6 8 10 12 14 16
-0,20

Tiempo (das)

G2T1 G2T4 G2T5 G2T7 G2T8 G2T14 S2T1

S2T12 G3(7) S2(4) S2(11) G2(13) 7VA

Figura III.3. Cinticas fermentativas en presencia de cido decanoico de las cepas seleccionadas (media con desviaciones
estndar) y del testigo comercial

87
En este caso el testigo presenta una cintica irregular al inicio de la fermentacin.
Este comportamiento no es normal en esta cepa y por ello no se ha considerado
importante. Este mismo hecho se produce en las cepas G2(13) y S2(4), aunque
finalmente consiguen alcanzar valores fermentativos similares al resto de las cepas.
En todos los casos la duracin del proceso es la misma situndose el final de
fermentacin en torno al da 12.

II.1.4. Tercera seleccin: Poder fermentativo, cinticas y acidez voltil a

diferentes temperaturas

La temperatura a la que se lleva a cabo la fermentacin alcohlica afecta al

crecimiento
de las levaduras y por tanto a la duracin de la fermentacin, a la contribucin que
las
diferentes especies tienen en la fermentacin y al metabolismo de las levaduras, que
es el que finalmente va a determinar la composicin qumica y organolptica del vino
(Fleet y Heard, 1993).

Se verific el poder fermentativo en distintas condiciones de temperatura que pueden

tener lugar en la vinificacin en tinto (23 y 30 C). En ambos casos el mosto
empleado en las microvinificaciones presentaba una concentracin de azcar de
14,5 B (268 g/L).

La Tabla III.4. resume estos resultados para las cepas seleccionadas segn este
criterio. Se puede observar cmo las altas temperaturas de fermentacin
(fermentacin isoterma a 30 C) afecta al poder fermentativo en la mayora de los
casos. Tan slo la cepa S2(11) consigue terminar correctamente la fermentacin
superando incluso el poder fermentativo alcanzado por la cepa testigo 7VA.

A 23 C, la cepa testigo 7VA presenta un poder fermentativo ligeramente superior,

aunque muy prximo al alcanzado por el resto de cepas. Slo la cepa G3(7) falla en
estas condiciones trmicas, mostrando un valor bastante bajo en comparacin con el
resto de las cepas seleccionadas.

88
La cepa S2(11) es la nica que alcanza mayor poder fermentativo a altas
temperaturas, aunque la diferencia con el valor mostrado a 23 C no es relevante. El
resto, en las que se incluye la cepa testigo, muestra valores inferiores a altas
temperaturas siendo la variacin especialmente importante en el caso de la G2T5.

Tabla III.4. Poder fermentativo alcanzado por las cepas seleccionadas en distintas
condiciones de vinificacin (n=3 para las desviaciones estndar de las medias)

Temperatura 23C 30C

Levadura PFT PFT
G2T1 14,93 0,22 13,57 0,14
G2T4 14,87 0,03 13,67 0,40
G2T5 15,15 0,19 13,53 0,20
G3(7) 13,51 0,37 13,29 0,55
S2(4) 14,78 0,16 14,25 0,35
S2(11) 14,78 0,72 15,00 0,03
7VA 15,19 0,04 14,93 0,29

Las Figuras III.4. y III.5. muestran las cinticas fermentativas de las levaduras
seleccionadas a 23 C y 30 C respectivamente.

2,50

2,00
Prdida de peso (g)

1,50

1,00

0,50

0,00
0 2 4 6 8 10 12
Tiempo (das)

G2T1_A G2T4 G2T5 G3(7) S2(4) S2(11) 7VA

89
 Figura III.4. Cinticas fermentativas de las cepas seleccionadas y del testigo comercial a una temperatura de vinificacin de
23C (n=3)

3,00

2,50
Prdida de peso (g)

2,00

1,50

1,00

0,50

0,00
0 2 4 6 8 10 12
Tiempo (das)

G2T1 G2T4 G2T5 G3(7) S2(4)_A S2(11) 7VA

Figura III.5. Cinticas fermentativas de las cepas seleccionadas y del testigo comercial a una temperatura de vinificacin de
30C

En ambos casos, las cinticas son bastante regulares, con un arranque rpido de la
fermentacin. Sin embargo, se observa que a altas temperaturas las fermentaciones
son ms rpidas, dndose por finalizadas en todo los casos en torno al sexto da. En
cambio, a 23 C la duracin total se alarga hasta el octavo da aproximadamente.

El acabado de la fermentacin se produce de una forma ms correcta a 23 C en

todos los casos, a excepcin de la cepa S2(11) cuyo comportamiento se ve
favorecido por las altas temperaturas.

Para una mejor comparacin con la cepa testigo, la Figura III.6. muestra las cinticas
medias de las cepas seleccionadas frente al testigo comercial, a ambas
temperaturas. En ambos casos las fermentaciones son bastante similares en cuanto
a regularidad y duracin, sin embargo, se observa que a altas temperaturas la cepa
testigo produce fermentaciones ligeramente ms rpidas que las cepas

90
seleccionadas, lo que implica una posible elevacin de la temperatura durante la
fermentacin.

3,00

2,50
prdida de peso (g)

2,00

1,50

1,00

0,50

0,00
0 2 4 6 8 10 12
Tiempo (das)

Media 23C Media 30C 7VA 23C 7VA 30C

Figura III.6. Cinticas fermentativas de las cepas seleccionadas y del testigo comercial a 23C y 30C

La Tabla III.5. resume la acidez voltil alcanzada por las cepas seleccionadas a las
temperaturas de estudio.

Todas las cepas presentan voltiles superiores a 0,3 g/L a ambas temperaturas
siendo los valores alcanzados superiores a mayor temperatura.

Tabla III.5 Acidez voltil (g/L de cido actico) producida por las cepas seleccionadas a
diferentes temperaturas de vinificacin (n=3 para las desviaciones estndar de las medias)

Temperatura 23C 30C

Levadura Acidez voltil Acidez voltil
0,52 0,00 0,58 0,00
G2T1
0,45 0,06 0,58 0,00
G2T4
0,47 0,00 0,64 0,00
G2T5
0,47 0,00 0,62 0,00
G3(7)
0,41 0,00 0,58 0,00
S2(4)
0,41 0,00 0,62 0,00
S2(11)
0,41 0,00 0,47 0,00
7VA

91
A 23C todas las cepas a excepcin de la G2T1 se sitan por debajo de los 0,5 g/L,
valor establecido como lmite a la hora de seleccionar. La cepa testigo junto con las
cepas S2(11) y S2(4) son las que muestran valores ms bajos.

A 30 C todas ellas superan los 0,5 g/L de voltiles, tan slo la cepa testigo 7VA se
mantiene por debajo de este lmite. Los valores mayores los alcanzan las cepas
G2T5, G3(7) y S2(11), superando los 0,6 g/L.

Si comparamos los datos obtenidos a ambas temperaturas, se observa que las

acideces voltiles de las cepas S2(11), S2(4) y G2T5 son las ms afectadas por el
aumento de la temperatura, mostrando incrementos de 0,21 g/L, 0,17 g/L y 0,17 g/L
de cido actico respectivamente.

III.2. NOMENCLATURA DE LAS CEPAS SELECCIONADAS

La Tabla III.6. resume la clasificacin asignada a las cepas finalmente seleccionadas

para el estudio aplicando criterios de seleccin ms especficos, as como la variedad
a la que pertenecen y momento fermentativo en el que fueron aisladas.

Tabla III.6. Clasificacin y origen de las cepas seleccionadas

Cepa de levadura Variedad Momento fermentativo

G2T1 Garnacha A los 3 das de fermentacin
G2T4 Garnacha A los 3 das de fermentacin
G2T5 Garnacha A los 3 das de fermentacin
G3(7) Garnacha A los 12 das de fermentacin
S2(4) Shiraz A los 12 das de fermentacin
S2(11) Shyraz A los 12 das de fermentacin

92
III.3. PODER FERMENTATIVO DE LAS CEPAS SELECCIONADAS

Se verific el poder fermentativo alcanzado por las distintas cepas de levadura en

diferentes condiciones que pueden darse en vinificacin de vinos tintos.

Por un lado, se realizaron microvinificaciones utilizando mosto con un contenido

azucarado elevado de 13,3 B (240,5 g/l) y mantenindolas a temperatura ambiente
(25 C) durante todo el proceso. Por otro lado se estudi el poder fermentativo a baja
temperatura (15 C), empleando para ello mosto de 13,7 B (250 g/L) de
concentracin de azcar. Se realiz por triplicado para cada una de las cepas de
levadura en estudio.

La Tabla III.7. resume los resultados de las cepas seleccionadas. Se ha utilizado

como testigo la cepa 7VA, elegida por su buen comportamiento en ensayos
anteriores.

Tabla III.7. Poder fermentativo alcanzado por las levaduras seleccionadas (% v/v de etanol) en distintas condiciones de
microvinificacin. ( n=3 para las desviaciones estndar de las medias)

Temperatura (C) 25C 15C

B 13,3 B 13,7 B
Levadura
S2(4) 13,83 0,01 14,24 0,07
G3(7) 13,56 0,36 13,81 0,12
G2T5 13,76 0,33 14,24 0,01
G2T1 14,15 0,49 14,12 0,23
S2(11) 13,76 0,07 14,14 0,12
G2T4 13,84 0,09 14,23 0,09
7VA 13,90 0,36 14,42 0,20

Se observa como todas las cepas seleccionadas terminan correctamente la

fermentacin. En todos los casos se obtienen poderes fermentativos superiores a
baja temperatura, excepto la cepa G2T1 que muestra valores similares a ambas
temperaturas. La concentracin azucarada del mosto empleado en las
microvinificaciones a baja temperatura es algo superior al utilizado en el otro ensayo,
por lo que es normal que el poder fermentativo en este caso sea tambin mayor.

93
En todos los casos se verifica que el poder fermentativo de la cepa testigo 7VA es
superior al de las cepas de levaduras seleccionadas, a excepcin de la cepa G2T1
que, a temperatura ambiente, alcanza un valor superior.

Por tanto, ninguna de las cepas seleccionadas se ve afectada por las bajas
temperaturas, pudiendo ser este hecho considerado a la hora de plantear este tipo de
vinificaciones.

III.4. CINTICAS DE LAS CEPAS SELECCIONADAS

Las Figuras III.7. y III.8. muestran las cinticas fermentativas de las levaduras
seleccionadas a diferentes temperaturas (25 C y 15 C respectivamente).

A 25 C, (Figura III.7.) todas las cepas presentan cinticas muy similares, con un
rpido arranque de la fermentacin y un transcurso ms o menos regular. A 15 C,
(Figura III.8.), sin embargo, las cinticas son ms irregulares y se ralentiza el
arranque de la fermentacin prolongndose la fase de latencia. La duracin total del
proceso es mucho mayor que en el caso anterior, con un promedio de 10 das ms.
Se observa que la cepa G3(7) es la que presenta finales de fermentacin con un
mayor contenido de azcares residuales.

2
Prdida de peso (g)

1,5

0,5

0
0 5 10 15 20 25
Tiempo (das)

S2(4) 7VA G3(7) G2T5 G2T1 S2 (11) G2T4

Figura III.7. Cinticas fermentativas de las cepas seleccionadas a 25C

94
 0,8
Prdida de peso (g) 0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 5 10 15 20 25 30
Tiempo (das)

S2(4) 7VA G3(7) G2T5 G2T1 S2 (11) G2T4

Figura III.8. Cinticas fermentativas de las cepas seleccionadas a 15C

La Figura III.9. muestra la cintica media de las cepas seleccionadas frente a la cepa
comercial. Se observa que a ambas temperaturas la cepa testigo produce
fermentaciones ligeramente ms rpidas que las cepas seleccionadas. Comparando
las cinticas a ambas temperaturas se verifica que a bajas temperaturas la fase de
latencia es mucho ms prolongada, producindose un arranque de fermentacin ms
tardo que a 25 C. Sin embargo las posibles elevaciones de temperatura en este
caso son mucho menores, reducindose la necesidad de frigoras en bodega. Por
otro lado se observa cmo a baja temperatura se ralentiza el proceso, siendo la
duracin total del mismo mucho mayor.

1,8
1,6
Prdida de peso(g)

1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 5 10 15 20 25
Tiempo (das)

Media 15C 7VA (15C) Media 25C 7VA (25C)

Figura III.8. Cinticas fermentativas medias de las cepas seleccionadas y del testigo comercial a 15C y 25C

95
III.5. ACIDEZ VOLTIL

La Tabla III.8. resume la acidez voltil alcanzada por cada una de las levaduras en
microvinificaciones, realizadas por triplicado, de mostos con 13,3 B (240,5 g/L) y
13,7 B (250 g/L) de concentracin de azcar y sometidas a temperaturas de 25 C
y 15 C respectivamente.

Tabla III.8. Acidez voltil (g/L de cido actico) producida por las cepas seleccionadas en mostos de dos
concentraciones de azcar y a diferentes temperaturas( n=3 para las deviaciones estndar de las medias)

Temperatura (C) 25C 15C

B 13,3 B 13,7 B
. Levadura
S2(4) 0,31 0,03 0,29 0,00
G3(7) 0,33 0,03 0,39 0,03
G2T5 0,31 0,03 0,31 0,03
G2T1 0,33 0,03 0,29 0,00
S2(11) 0,37 0,03 0,31 0,03
G2T4 0,29 0,00 0,33 0,03
7VA 0,27 0,03 0,35 0,00

Todas las cepas producen voltiles normales a ambas temperaturas, mostrando

valores cercanos a 0,3 g/L, muy por debajo del mximo establecido (0,5 g/L). Las
cepas de levadura S2(4), G2T1 y S2(11) presentan voltiles menores a bajas
temperaturas. El resto, por el contrario, aumentan su valor al disminuir la
temperatura. La cepa G2T5 no se ve afectada por la variacin de esta condicin.

A temperatura ambiente la cepa testigo muestra el valor ms bajo, siendo la cepa

G2T4 la que presenta un valor ms cercano. Sin embargo a baja temperatura
muestra el valor ms alto, nicamente superado por la cepa G3(7).

96
III.6. PRODUCCIN DE CIDO MLICO

El cido mlico es el segundo cido orgnico ms importante cuantitativamente en

las uvas de vinificacin y resulta inestable, siendo susceptible de degradacin
bacteriana.

La capacidad de algunas cepas de levadura para degradar parte del contenido de

cido mlico de los mostos durante la fermentacin alcohlica puede acelerar la
fermentacin malolctica posterior, cuyo fin es conseguir una mayor estabilidad
biolgica del vino final. En la actualidad, es comn inducir la fermentacin malolctica
mediante la inoculacin de cultivos puros de bacterias lcticas, que facilitan el
proceso que puede ser complicado si las temperaturas son bajas y los niveles de
sulfuroso elevados. La capacidad de algunas cepas de levadura de degradar parte
del contenido de cido mlico de los mostos durante la fermentacin alcohlica
puede acelerar la fermentacin malolctica.

La Tabla III.9. muestra los contenidos finales de cido mlico alcanzados por las
cepas de levadura en estudio tras las microvinificaciones realizadas por triplicado
sobre mosto con 13,3 B (240,5 g/L) de azcar.

Tabla III.9. Contenidos en cido mlico expresado en g/L.

(n=3 para las desviaciones de las medias)

Levadura cido mlico

S2(4) 1,37 0,21
G3(7) 1,47 0,11
G2T5 1,55 0,14
G2T1 1,05 0,22
S2(11) 0,85 0,20
G2T4 0,28 0,08
7VA 1,41 0,11

97
Puesto que se desconoce el contenido inicial del mosto en cido mlico no se puede
hacer una evaluacin rigurosa de la capacidad degradadora o productora de cada
una de las cepas, sin embargo si se pueden sacar conclusiones comparando los
valores mostrados por cada una de ellas as como por el testigo empleado.

Como se puede observar en la Figura III.9., las cepas G2T5 y G3(7) son las que
alcanzan mayores contenidos de cido mlico superando los mostrados por la cepa
testigo (7VA). Por ello, pueden resultar interesantes en la vinificacin en tinto para
incrementar los contenidos en cido lctico tras la fermentacin malolctica, por la
sensacin de suavidad, redondez y grosor que aporta a los vinos.

1,8
1,6
1,4
cido mlico (g/L)

1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
G2T4 S2(11) G2T1 S2(4) G2T5 G3(7) 7VA
Levaduras

Figura III.9. Representacin grfica de los contenidos medios de cido mlico alcanzado
por cada cepa de levadura y la cepa testigo.

En cambio las cepas G2T4 y en menor medida la cepa S2(11), destacan por su gran
actividad degradadora, dejando contenidos muy bajos de cido mlico. Este hecho
puede favorecer la fermentacin malolctica posterior, lo que conlleva una mejora en
la estabilidad del producto final.

98
III.7. PRODUCCIN DE GLICERINA

La glicerina es el componente mayoritario de los vinos despus del agua y el etanol.

Aporta densidad, estructura, suavidad y dulzor al vino, por lo que su presencia en el
mismo resulta de suma importancia. La cantidad de glicerol producida puede oscilar
en un rango de 5 a 8 g/L dependiendo del contenido inicial de azcares, la
temperatura de fermentacin y la cepa de levadura utilizada.

La Tabla III.10. resume la produccin de glicerina de cada una de las cepas de

levadura seleccionadas, tras las microvinificaciones realizadas por triplicado de un
mosto con un contenido azucarado de 13,3 B (240,5 g/L).

Todas las cepas presentan valores de produccin inferiores al mostrado por la cepa
7VA empleada como testigo (Figura III.10.). Tan slo las cepas S2(4) y G3(7)
superan los 5 g/L pero no llegan a alcanzar valores destacables. Las cepas S2(11) y
G2T4 son las que presentan contenidos ms bajos, sin llegar a alcanzar los 4 g/L.

Al ser la glicerina un metabolito que se produce durante la fermentacin

gliceropirvica que tiene como sustrato inicial los azcares glucosa y fructosa,
cualquier elevacin del contenido de stos en el mosto supondr una elevacin de la
glicerina en los vinos.

Tabla III.10. Produccin de glicerina media (n=3) y

desviaciones estndar para las distintas levaduras (en g/L).

Levadura Glicerina
S2(4) 6,04 0,12
G3(7) 5,89 0,34
G2T5 4,90 1,11
G2T1 4,16 0,09
S2(11) 3,81 0,02
G2T4 3,91 0,06
7VA 6,75 0,16

99
 8
7

Glicerina (g/L) 6
5
4
3
2
1
0
G2T4 S2(11) G2T1 S2(4) G2T5 G3(7) 7VA
Levaduras

Figura III.10. Comparativa de las producciones medias de glicerina de las distintas levaduras y la cepa testigo

III.8. IDENTIFICACIN Y CONTENIDO DE ANTOCIANOS

El contenido de antocianos se evalo sobre los fermentados de las diferentes cepas

de levadura estudiadas. La Tabla III.11. detalla los contenidos medios de cada
antocianidin 3-O-glucsido determinados en las muestras.

Tabla III.11. Contenido de antocianos (mg/L) de los mostos fermentados con las cepas de levadura seleccionadas y el testigo.
(n=3 para las desviaciones estndar de las medias)

Levaduras G2T1 G2T4 G2T5 S2(4) S2(11) G3(7) 7VA

D3G 5.59 0.18 5.83 0.39 4.92 0.32 5.37 0.33 4.41 0.16 4.33 0.54 4.92 0.13
Cy3G 0.20 0.02 0.19 0.01 0.17 0.00 0.17 0.01 0.16 0.02 0.16 0.02 0.17 0.02
Pt3G 8.42 0.08 8.22 0.07 7.71 0.48 8.17 0.12 7.49 0.36 7.56 0.36 7.66 0.22
Pn3G 2.85 0.09 2.87 0.31 2.51 0.08 2.58 0.04 2.32 0.10 2.16 0.25 2.37 0.14
M3G 58.10 0.28 57.94 0.02 56.57 1.06 57.58 0.39 54.62 0.16 55.85 1.63 52.49 1.84
VIT A+B 1.06 0.11 1.02 0.01 0.99 0.04 0.97 0.01 1.02 0.02 0.97 0.04 1.04 0.05
Pt3G6Ac 0.37 0.01 0.38 0.01 0.37 0.02 0.39 0.02 0.37 0.02 0.38 0.02 0.34 0.02
Pn3G6Ac 0.44 0.03 0.43 0.01 0.43 0.02 0.42 0.01 0.43 0.01 0.41 0.03 0.41 0.01
M3G6Ac 3.37 0.04 3.38 0.04 3.27 0.07 3.37 0.03 3.10 0.00 3.30 0.15 2.94 0.04
Pt3G6Cm 0.67 0.01 0.69 0.02 0.66 0.01 0.66 0.01 0.62 0.03 0.73 0.05 0.56 0.07
Pn3G6Cm 0.94 0.04 0.95 0.03 0.92 0.04 0.95 0.01 0.64 0.38 0.98 0.04 0.81 0.05
M3G6Cm 4.74 0.14 4.73 0.06 4.62 0.17 4.76 0.07 4.46 0.15 4.77 0.22 4.10 0.20
Vph1 0.22 0.02 0.21 0.02 0.22 0.01 0.22 0.01 0.20 0.02 0.22 0.02 0.20 0.02
Vph2 0.18 0.03 0.13 0.02 0.22 0.04 0.20 0.01 0.18 0.06 0.20 0.02 0.19 0.02

100
La Figura III.11., que expresa grficamente los datos recogidos en la Tabla III.11.,
muestra un claro predominio de los antocianidin-3-O-glucsidos trisustituidos en el
anillo B (delfinidina, petunidina y malvidina), perfil propio de la variedad Vitis Vinfera
L.

70
60
50
40
mg/L

30
20
10
0
7VA G2T5 G2T4 S2 11 G2T1 S2 4 G37
Levaduras

D3G C3G PT3G PN3G M3G

VIT A+B PT3GAC PN3GAC M3GAC PT3GCM
PN3GCM M3GCM VPH1 VPH2

Figura III.11. Representacin grfica de los contenidos de cada antocianidin-3-O-glucsidos

Los contenidos de malvidn-3-O-glucsido (antociano mayoritario) oscilan entre 52 y

58 mg/L, siendo el valor ms alto el correspondiente a la cepa G2T1. Las cepas
G2T4 y S2(4) presentan valores ligeramente inferiores pero en cualquier caso,
superiores a la cepa 7VA empleada como testigo.

Las cepas G2T1 y G2T4 son las que presentan mayores concentraciones en el resto
de antocianos sin acilar, aunque las diferencias con los contenidos mostrados por el
resto de las cepas no son destacables.

En el caso de las vitisinas, destaca la cepa G2T1, nica que supera el valor
alcanzado por la cepa testigo 7VA. Las cepas G2T4 y S2(11) presentan valores
inferiores pero muy prximos a ella.

En cuanto a los derivados acetlicos, en todos ellos, todas las cepas han superado
los valores mostrados por el testigo 7VA. En el caso del Petunidin-3-O-(6-O-acetil)-
glucosido todas las cepas muestran valores similares, siendo el valor ms alto el

101
alcanzado por la S2(4). Lo mismo ocurre con el Peonidin-3-O-(6-O-acetil)-glucosido,
en el que todos los valores estn comprendidos entre 0,41 y 0,44 mg/L. Ms amplio
es el rango de variacin de los contenidos en Malvidin-3-O-(6-O-acetil)-glucosido,
donde destacan las cepas G2T4 y G2T1.

Dentro de los derivados p-cumarlicos estudiados, es la cepa G3(7) la que muestra

mayores contenidos de todos ellos. Los valores ms bajos en Petunidin3-O-(6-O-p-
cumaril)-glucosido y Malvidin3-O-(6-O-p-cumaril)-glucosido los presenta la cepa
testigo y en Peonidin3-O-(6-O-p-cumaril)-glucosido la cepa S2(11) aunque en ningn
caso las diferencias son especialmente destacables.

En vinifenoles es la cepa G2T5 la que muestra concentraciones ms altas. Algo

inferiores pero muy prximos son los valores mostrados por el resto de las cepas,
donde se incluye el testigo 7VA. Tan slo cabe destacar la cepa G2T4 por su bajo
contenido en el vinifenol 2 en comparacin con el resto.

Para una mejor comprensin de los resultados, se han agrupado los distintos
antocianos analizados y cuantificados por familias: antocianidn 3-O-glucsidos sin
acilar (3G), vitisinas (VIT), derivados acetlicos (6Ac), derivados p-cumarlicos (6Cm)
y vinifenoles (VPH). La Tabla III.12. resume los valores medios para cada una de
estas familias representados grficamente en la Figura III.12.

Tabla III.12. Contenidos de antocianos (mg/L) agrupados por familias de los mostos fermentados con las cepas de levadura
seleccionadas. (n=3 para las desviaciones estndar de las medias).

Levaduras 3G VIT Ac Cm VPH

G2T1 75.16 0.18 1.06 0.11 4.19 0.06 6.35 0.19 0.41 0.02
G2T4 75.05 0.44 1.02 0.02 4.19 0.03 6.37 0.10 0.35 0.03
G2T5 71.88 1.69 0.99 0.04 4.06 0.08 6.20 0.22 0.44 0.05
S2(4) 73.87 0.77 0.97 0.01 4.18 0.03 6.37 0.07 0.42 0.02
S2(11) 68.99 0.59 1.02 0.02 3.89 0.01 5.72 0.28 0.38 0.08
G3(7) 70.06 2.28 0.97 0.04 4.09 0.18 6.48 0.26 0.42 0.04
7VA 67.61 2.31 1.04 0.05 3.69 0.05 5.48 0.32 0.39 0.04

102
 80,00

70,00

60,00

50,00
mg/L

40,00

30,00

20,00

10,00

0,00
7VA G2T5 G2T4 S2 (11) G2T1 S2 4 G3(7)
Levaduras
3G VIT A+B Ac Cm VPH

Figura III.12. Representacin grfica de los contenidos de los antocianos agrupados por familias

Como es lgico, la familia de antocianidn 3-O-glucsidos sin acilar (3G) presenta

contenidos muy superiores al resto de los grupos. Destacan las cepas de levadura
G2T1 y G2T4 por sus elevados contenidos. En cuanto al contenido en vitisinas y
derivados acetlicos tambin son las cepas que han alcanzado valores superiores.
Sin embargo, es la cepa G3(7) la que muestra un mayor contenido en derivados p-
cumarlicos y la G2T5 la que destaca en vinifenoles.

La cepa 7VA empleada como testigo ha dado contenidos ms bajos en la mayora de

los antocianos. Los valores mostrados han sido superados por las cepas en estudio
en casi todos los casos. Tan slo la concentracin de vitisinas presenta valores
dentro de la media.

103
III.9. RESISTENCIA AL ETANOL

La produccin de etanol est limitada por el efecto inhibitorio que ejerce sobre la
cepa que lo produce, siendo este efecto difcilmente evitable. A medida que
transcurre la fermentacin se produce un incremento de la concentracin de etanol,
lo que supone un importante obstculo para el crecimiento microbiano.

Se hizo un seguimiento del crecimiento poblacional que se produca en

fermentaciones de un mosto estndar con un contenido azucarado de 12 B (212
g/L) en presencia de concentraciones crecientes de etanol. Se realiz por triplicado
para cada cepa y concentracin de etanol.

Las Tablas III.13. III.14. recogen los recuentos medios, realizados mientras tena
lugar la fermentacin, de los mostos inoculados con las cepas seleccionadas y la
cepa testigo.

Para un mejor estudio de las variaciones producidas en el tamao de las poblaciones

que llevaban a cabo cada fermentacin, as como de su evolucin a lo largo del
tiempo, se han representado grficamente los datos recogidos en las Tablas III.13. y
III.14. ( Figuras III.13., III.14., III.15., III.16., III.,17., III.18. y III.19).

En ausencia de etanol, todas las cepas, incluida la cepa testigo, muestran las curvas
de crecimiento propias de la fermentacin. Inicialmente, pasan por una fase de
latencia, hasta el arranque de la fermentacin. En una segunda fase, se alcanza el
mximo crecimiento poblacional y se maximiza la velocidad de liberacin de CO2.
Finalmente, las levaduras dejan de ser proliferantes, observndose un decrecimiento
de la curva. Durante toda esta fase la actividad de las levaduras disminuye
progresivamente por la falta de nutrientes nitrogenados asimilables y la presencia de
etanol.

A medida que se incrementa la concentracin de etanol se observa que el nmero de

colonias va disminuyendo de una forma ms o menos progresiva. El arranque de la
fermentacin se retrasa y alargndose la fase de latencia. Pero el crecimiento de
cada cepa se ve alterado en mayor o menor medida segn las concentraciones.

104
En el caso de la cepa G2T1 los mximos poblacionales se alcanzan ms lentamente
que en el resto de cepas seleccionadas, por lo que no lleg a observarse un
decrecimiento final. A lo largo de todo el proceso se observa el efecto negativo del
etanol sobre el crecimiento poblacional. Dicho efecto se manifiesta de una forma ms
o menos progresiva, disminuyendo los recuentos a medida que se incrementan los
contenidos en etanol. A los 15 das de fermentacin las diferencias en los recuentos
son destacables corroborando la alta influencia del etanol sobre esta cepa.

En el caso de la cepa S2(11) la influencia del etanol se manifiesta igualmente de

forma progresiva. A medida que se incrementan las concentraciones de etanol el
arranque se ve cada vez ms ralentizado pero finalmente, a diferencia de la cepa
G2T1, consigue alcanzar poblaciones con densidades adecuadas de poblacin.

La cepa G2T5 se ve altamente afectada por la presencia de etanol al inicio de la

fermentacin. A bajas concentraciones (4%) ya se observa una fuerte disminucin en
los recuentos; presentando un crecimiento poblacional mucho ms lento que en
ausencia de etanol. Las diferencias en presencia de contenidos del 4% y del 6% no
son destacables, sin embargo a concentraciones del 8% se alarga la fase de latencia
inicial, aunque finalmente consigue alcanzar una densidad poblacional similar.

Las cepas G3(7), G2T4 y S2(4) no muestran grandes alteraciones a bajas

concentraciones, pero a partir de contenidos del 6% de etanol dichas alteraciones
comienzan a manifestarse. En el caso de las cepas S2(4) y G3(7) aunque el
crecimiento se ve ralentizado con el incremento de alcohol, finalmente consiguen
alcanzar poblaciones cercanas, sin embargo la cepa G2T4 parece verse ms
afectada segn indican los recuentos poblacionales al final de la fermentacin.

A altas concentraciones de etanol (8%), la actividad fermentativa es muy baja en

todos los casos. Destacan las cepas G2T4, S2(11) y G2T5, en ellas la fase de
latencia se alarga considerablemente pero finalmente consiguen un desarrollo
poblacional ms importante que en el resto de los casos.

105
 6
Tabla III.13. Unidades formadoras de colonias/ml a diferentes concentraciones de etanol. ( x 10 ) de las cepas seleccionadas.

Levadura Das Media 0% Rango Media 4% Rango Media 6% Rango Media 8% Rango
G3(7) 1 6,67 6,2-7,2 3,41 3,2-3,6 0,43 0,1-0,8 0,53 0,4-0,6
4 64,33 23,0-116,0 76,33 42,0-144,0 26,29 12,4-44,0 5,23 1,9-9,4
6 87,33 64,0-104,0 41,67 24,0-72,0 21,67 11,0-29,0 19,53 9,6-33,0
8 79,00 68,0-100,0 33,00 21,0-46,0 20,77 13,0-28,0 26,00 21,0-36,0
11 58,63 48,0-77,3 36,67 18,0-64,0 28,00 26,0-29,0 34,00 32,0-36,0
15 64,67 62,0-68,0 26,00 18,0-40,0 47,33 44,0-54,0 32,67 26,0-44,0
G2T1 1 5,01 2,8-6,5 2,08 1,4-2,4 1,39 1,2-1,4 1,01 0,9-1,1
4 49,44 43,0-57,3 24,37 5,4-46,6 17,92 9,7-32,8 3,89 1,1-6,2
6 57,33 48,0-70,0 28,00 25,0-33,0 24,33 21,0-26,0 10,33 8,0-14,0
8 81,33 64,0-104,0 50,67 38,0-64,0 34,00 18,0-48,0 17,00 6,0-32,0
11 80,00 36,0-108,0 34,00 32,0-36,0 20,00 15,0-23,0 17,00 14,0-19,0
15 82,67 56,0-100,0 48,67 22,0-80,0 19,67 16,0-25,0 20,33 8,0-42,0
G2T5 1 4,00 3,0-5,2 2,72 2,4-3,0 1,07 0,8-1,4 0,37 0,1-0,6
4 95,33 84,0-104,0 34,07 29,0-42,0 29,07 19,2-39,2 5,01 3,3-7,5
6 131,33 78,0-180,0 34,00 14,0-68,0 29,33 16,0-54,0 18,33 12,0-24,0
8 113,33 92,0-136,0 35,33 19,0-66,0 32,67 24,0-40,0 37,67 21,0-52,0
11 59,33 50,0-68,0 34,77 27,0-40,0 25,33 19,0-32,0 50,67 40,0-64,0
15 94,67 84,0-100,0 54,67 48,0-60,0 73,33 52,0-88,0 56,00 44,0-64,0
G2T4 1 6,35 5,2-7,0 3,04 2,4-3,5 1,17 0,9-1,6 0,80 0,6-0,9
4 37,55 30,6-50,0 49,11 34,6-74,0 16,85 7,3-24,0 6,88 1,4-14,2
6 41,33 34,0-46,0 47,33 34,0-58,0 21,67 18,0-28,0 17,00 13,0-21,0
8 49,33 42,0-54,0 36,20 24,0-58,0 28,67 22,0-40,0 28,67 20,0-3,0
11 56,67 52,0-62,0 35,67 19,0-48,0 26,00 18,0-36,0 61,33 42,0-88,0
15 85,33 64,0-108,0 44,00 36,0-48,0 28,00 26,0-30,0 46,67 22,0-92,0
S2(11) 1 5,87 4,9-7,0 2,35 2,0-2,5 1,28 0,6-2,0 1,17 0,9-1,4
4 74,33 35,0-112,0 36,33 30,0-41,0 8,16 7,2-9,9 2,51 1,2-4,8
6 79,33 76,0-84,0 27,33 17,0-34,0 24,00 22,0-27,0 2,61 0,6-6,4
8 78,67 60,0-112,0 35,67 25,0-52,0 19,67 18,0-21,0 9,33 8,0-11,0
11 70,67 28,0-100,0 40,67 32,0-52,0 19,00 14,0-24,0 27,67 23,0-33,0
15 56,67 52,0-62,0 46,67 36,0-66,0 45,33 32,0-60,0 40,00 16,0-56,0
S2(4) 1 5,71 5,4-6,0 2,72 1,9-3,6 2,08 0,6-3,2 1,28 1,1-1,4
4 49,67 21,0-72,0 47,00 19,0-64,0 20,00 13,6-24,8 3,30 1,2-4,3
6 44,00 34,0-52,0 61,33 24,0-116,0 22,67 16,0-30,0 19,67 14,0-27,0
8 65,00 51,0-80,0 44,67 19,0-80,0 44,00 30,0-54,0 20,33 14,0-30,0
11 94,20 38,6-160,0 58,67 26,0-108,0 65,00 31,0-96,0 39,00 13,0-84,0
15 61,33 48,0-82,0 48,00 44,0-52,0 43,67 19,0-62,0 34,33 18,0-56,0

6
Tabla III.14. Unidades formadoras de colonias/ml a diferentes concentraciones de etanol. ( x 10 ) de las cepa testigo (7VA).

Levadura Das Media 0% Rango Media 4% Rango Media 6% Rango Media 8% Rango
7VA 1 6,67 6,0-7,0 0,96 0,6-1,4 0,48 0,3-0,6 0,21 0,1-0,3

4 44,67 20,0-92,0 28,83 11,2-62,0 7,36 4,1-11,2 2,83 1,1-5,4

6 61,67 29,0-124,0 42,33 14,0-92,0 14,67 10,0-18,0 10,60 0,8-18,0

8 73,00 17,0-140,0 24,11 9,3-38,0 33,00 17,0-44,0 16,33 0,0-30,0

11 43,33 30,0-64,0 40,00 12,0-72,0 20,00 11,0-36,0 22,00 13,0-28,0

15 37,33 32,0-44,0 35,33 28,0-42,0 24,00 18,0-28,0 15,33 10,0-20,0

106
 7VA

80

70

60
u.f.c./ml

50

40

30

20

10

0
1 4 6 8 11 15

Tiempo (das)

MEDIA 0% MEDIA 4% MEDIA 6% MEDIA 8%

Figura III.13. Evolucin poblacional de la cepa de levadura 7VA a lo largo del tiempo a diferentes concentraciones de etanol.

La cepa testigo al igual que el resto de cepas estudiadas se ve afectada por la

presencia de etanol. A bajas concentraciones, ya se observa un decrecimiento
poblacional. Esta disminucin comienza a ser importante a partir de concentraciones
del 6 % de etanol, no consiguiendo un desarrollo poblacional suficiente para llevar a
cabo una fermentacin completa.

90
80 G2T1
70
60
u.f.c./ml

50
40
30
20
10
0
1 4 6 8 11 15
Tiempo (das)

MEDIA 0% MEDIA 4% MEDIA 6% MEDIA 8%

Figura III.14. Evolucin poblacional de la cepa de levadura G2T1 a lo largo del tiempo a diferentes concentraciones de etanol.

107
 90

80

70 S2(11)
60
u.f.c./ml

50

40

30

20

10

1 4 6 8 11 15

Tiempo (das)

MEDIA 0% MEDIA 4% MEDIA 6% MEDIA 8%

Figura III.15. Evolucin poblacional de la cepa de levadura S2(11) a lo largo del tiempo a diferentes concentraciones de etanol.

140

120 G2T5

100
u.f.c./ml

80

60

40

20

0
1 4 6 8 11 15
Tiempo (das)

MEDIA 0% MEDIA 4% MEDIA 6% MEDIA 8%

Figura III.16. Evolucin poblacional de la cepa de levadura G2T5 a lo largo del tiempo a diferentes concentraciones de etanol.

90

80
G2T4
70

60
u.f.c./ml

50

40

30

20

10

0
1 4 6 8 11 15

Tiempo (das)

MEDIA 0% MEDIA 4% MEDIA 6% MEDIA 8%

Figura III.17. Evolucin poblacional de la cepa de levadura G2T4 a lo largo del tiempo a diferentes concentraciones de etanol.

108
 100

90

S2(4)
80

70
u.f.c./ml

60

50

40

30

20

10

0
1 4 6 8 11 15

Tiempo (das)

MEDIA 0% MEDIA 4% MEDIA 6% MEDIA 8%

Figura III.18. Evolucin poblacional de la cepa de levadura S2(4) a lo largo del tiempo a diferentes concentraciones de etanol.

100
90
80
70 G3(7)
u.f.c./ml

60
50
40
30
20
10
0
1 4 6 8 11 15

Tiempo (das)

MEDIA 0% MEDIA 4% MEDIA 6% MEDIA 8%

Figura III.19. Evolucin poblacional de la cepa de levadura G3(7) a lo largo del tiempo a diferentes concentraciones de etanol.

III.10. AZCARES RESIDUALES. GLUCOSA Y FRUCTOSA

Se estudi el contenido de azcares residuales tras las fermentaciones llevadas a

cabo por las cepas seleccionadas y la cepa testigo (7VA) en presencia de altas
concentraciones de etanol (8%).

La Tabla III.15. recoge los resultados obtenidos para cada una de las cepas
seleccionadas as como los del testigo. En todos los casos los contenidos residuales
de fructosa son ms elevados que los de glucosa, como caba esperar. Las cepas
G2T4 y G2T5 prcticamente han fermentado todos los azcares. Las cepas S2(4) y
S2(11) presentan pequeas cantidades de glucosa y fructosa, mientras que en el

109
caso de las cepas G2T1 Y G3(7) estos valores son considerablemente altos sobre
todo en el caso de la cepa G3(7).

Los valores ms altos de azcares residuales los alcanza la cepa testigo.

Tabla III.15. Azcares residuales contenidos en los mostos fermentados por las levaduras
seleccionadas u el testigo en presencia de etanol (8%)

Levadura Glucosa Fructosa

G2T1 3,14 4,34 34,81 8,89
G2T5 0,06 0,06 0,56 0,24
G2T4 0,04 0,02 0,36 0,42
S2(4) 0,27 0,38 0,98 1,38
S2(11) 0,13 0,12 2,01 2,37
G3(7) 15,46 6,06 40,52 4,40
7VA 27,14 0,70 47,49 2,24

III.11. LIBERACIN DE POLISACRIDOS

Las mejoras en la estructura de los vinos derivan de la cesin de polisacridos de la

pared celular que aumentan la densidad de los mismos y suavizan la astringencia y
tanicidad de la fraccin fenlica.

La estabilidad del color se ve incrementada por la mejora en el equilibrio coloidal que

supone la liberacin de polisacridos y manoprotenas de bajo peso molecular,
adems de la posible formacin de agregados entre los antocianos y los
polisacridos o la adsorcin de los antocianos en los polisacridos.

La mejora en el aroma deriva de la cesin de compuestos voltiles durante la

autolisis procedentes de la pared celular, de la membrana biolgica, del citosol y de
las diferentes estructuras celulares.

Se evalo la liberacin de polisacridos producida en las distintas cepas de levadura

seleccionada y de la cepa testigo durante dos meses consecutivos.

110
Aunque para evaluar este criterio se requieren periodos de estudio mucho mayores y
los resultados obtenidos en este caso no fueron satisfactorios, s se pueden sacar
ciertas conclusiones de ellos. La Tabla III.16. muestra los resultados obtenidos para
cada cepa y cada mes.
Para una mejor evaluacin de la variacin entre meses la Figura III.20. muestra
grficamente los valores alcanzados en cada caso. Se ha prescindido de la cepa
S2(11) por la incongruencia de sus resultados.

Tabla III.16. Polisacridos liberados por las cepas seleccionadas y el testigo durante dos meses consecutivos.

Levadura Polisacridos 1 mes Rango Polisacridos 2 mes Rango

G3(7) 23211,0 22887- 23535 53392,0 47576- 59208
G2T1 33357,5 30939- 35776 49404,5 32449- 66360
G2T4 27298,0 24886- 29710 41781,0 39663- 43899
G2T5 32301,0 22262- 42340 41970,0 38846- 45094
S2(4) 23167,0 22691- 23643 36192,0 30369- 42015
S2(11) 16627,5 10803- 22452 89023,0 27982- 150064
7VA 18788,5 13027-24550 38769,0 32541- 44997

Las cepas que sufren una mayor autolisis durante el primer mes son la G2T1 y
G2T5, sin embargo el segundo mes es la cepa G3(7) la que muestra valores ms
elevados.
En cualquier caso, segn los resultados parece que es la cepa G2T1 la que presenta
una mayor tasa de liberacin, aunque dada la ambigedad de los resultados
obtenidos en este ensayo esta interpretacin es muy relativa.

111
 60000

50000

40000
mg/L 30000

20000

10000

0
7VA G2T5 G2T4 G2T1 G37 S24
Levaduras

1 MES 2 MES

Figura III.20. Representacin grfica de polisacridos liberados por las cepas seleccionadas y el testigo durante dos meses
consecutivos

112
III.12. CONCLUSIONES

Vinificacin a baja temperatura:

Segn los resultados obtenidos, todas las cepas estudiadas podran resultar
interesantes para llevar a cabo vinificaciones a baja temperatura. Los contenidos en
alcohol alcanzados por ellas son satisfactorios en todos los casos, sin embargo, se
podra elegir la cepa S2(4) como la ms interesante por mostrar valores de acidez
voltil muy bajos, por debajo de los 0,3 g/L, y una cintica bastante regular, con
rpido arranque, sin elevaciones excesivas de temperatura y con valores mnimos de
azcares residuales.
Produccin/degradacin de cido mlico:
La cepa G2T5 resulta interesante como preservadora del cido mlico existente en el
mosto, favoreciendo la fermentacin malolctica posterior, llevada a cabo por las
bacterias lcticas. En el caso de que interesara que dicha fermentacin fuera
producida por las propias levaduras, la cepa G2T4 resulta la ms idnea por su alta
capacidad degradadora.
Produccin de glicerina:
Ninguna de las cepas destaca por la produccin de este compuesto, siendo la cepa
S2(4) la ms interesante entre las estudiadas.
Contenido en antocianos:
Todas las cepas dan resultados aceptables, destacando las cepas G2T1 y G2T4 por
ser las que mayores contenidos alcanzan en la mayora de estos compuestos.
Resistencia al estrs fermentativo generado por el etanol:
En funcin del estudio realizado, las cepas S2(11) y S2(4) son las que mejor
soportan las condiciones adversas que plantea el incremento en etanol que se
produce a medida que transcurre la fermentacin, por lo que podran resultar
interesantes en uva con un alto contenido azucarado donde los finales de
fermentacin resulten muy complicados.
Liberacin de poliscaridos:
La cepa G3(7) es la que consigue mejores resultados en este sentido, si bien es
cierto que el estudio realizado no ha sido lo suficientemente largo y riguroso como
para sacar conclusiones en este sentido.

113
III.13. BIBLIOGRAFA

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