GUIA DE PROBLEMAS DE ESTRUCTURA PROTEICA

PRIMER CUATRIMESTRE

1. De las siguientes estructuras primarias (nonapptidos), una corresponde a una porcin trans-membrana.
sugiera cul y justifique brevemente:

a) Arg-Lys-Asp-Gln-Gly-Asp-Lys-Lys-Gly

b) Ile-Cys-Phe-Ala-Ser-Gln-Asp-Met-Lys

c) Leu-Phe-Phe-Asp-Leu-Phe-Leu-Ser-Ser

Respuesta :
a) En este caso hay una distribucin de cargas ++-00++0 que no permitir que esta porcin atraviese la
membrana
b) En este caso, hay una porcin predominantemente hidrofbica y relativamente poco polar hasta Asp lo
que podra permitir su acceso a membrana.
c) En este caso, la carga negativa del Asp queda muy en el medio como para que sea fcilmente
incorporable a la membrana, sin embargo globalmente esta porcin es bastante menos polar que la
anterior.
Adems, utilizando el programa ProtParam (del sitio http://www.expasy.org) tenemos los siguientes ndices de
hidrofobicidad :
a) -3.056
b) 0.200
c) 1.633
Entonces, la primera eleccin podra ser el (c) y luego el (b), aunque si est bien justificado, puede ser al revs.

2. Indique el patrn de corte de los siguientes polipptidos con los agentes indicados

a) Ser-Ala-Phe-Lys-Pro por tripsina

b) Leu-Arg-Ile-Phe-Trp-Met-Arg-Glu por bromuro de ciangeno
c) Trp-Glu-Glu-Arg-Gly-Tyr-Glu-Ser por quimotripsina
d) Arg-Leu-Tyr-Glu-Asp-Glu-Thr-Asp por proteasa Asp-N

Respuesta:
a) Corta entre Lys y Pro
b) Corta entre Met y Arg
c) Corta entre Trp y Glu y entre Tyr y Glu
d) Corta entre Thr y Asp (porque corta del lado del amino terminal de Asp)

3. Se desea averiguar la secuencia de un determinado polipptido. Para ello se realiza una hidrlisis cida
parcial. Luego los oligopptidos obtenidos a partir de la misma son separados y analizada su composicin
aminoacdica. La composicin del polipptido entero es (Ala2, Asp, Cys, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser2, Trp2). El
tratamiento con carboxipeptidasa A da como resultado Leu.
Se obtuvieron los oligopptidos con la siguiente composicin

(Ala, Lys) ; (Ala, Lys, Trp) ; (Ala, Pro) ; (Ala, Pro, Ser) ; (Ser2, Trp) ; (Ala, Ser2) ; (Ala, Trp) ; (Asp, Lys, Phe) ;
(Phe, Asp) ; (Cys, Leu) ; (Cys, Leu, Pro) ; (Phe, Ser, Trp) : (Ser, Trp).

Nota: La carboxipeptidasa A libera el aminocido ubicado en el extremo COOH. Excepto Arg, Lys o Pro.

Respuesta:
Tyr-Ala-Lys-Asp-Phe-Trp-Ser-Ser-Ala-Pro-Cys-Leu
La lnea de razonamiento es:
La carboxipeptidasa A libera el amino carboxilo terminal, por lo tanto es Leu. Dado que hay un dipptido que
tiene Cys y Leu, la secuencia final ser Cys-Leu. Como hay solamente una Cys, me fijo en qu otros
polipptidos la tienen y aparece (Cys, Leu, Pro). Por lo tanto la secuencia terminal va siendo Pro-Cys-Leu.
Como hay una sola Pro, tambin busco qu otros polipptidos la tienen en su composicin. Aparecen (Ala, Pro,
Ser) y (Ala, Pro). Entonces, ya puedo armar Ala-Pro-Cys-Leu y Ser-Ala-Pro-Cys-Leu. A partir de ahora.los
dejo con sus propios pensamientos..

4. Indique cmo es el camino de plegado general para una protena y mencione qu fuerzas intervienen en cada
etapa.
Respuesta: La idea es que la protena puede seguir una combinacin de los tres posibles mecanismos: (1)
formar primero la estructuras secundarias y luego ensamblarlas para formar la terciaria (mecanismo de
difusin-condensacin), (2) formar una estructura secundaria central que luego sirve de ncleo para ensamblar
el resto de la protena (mecanismo de nucleacin-condensacin), o (3) formar el core hidrofbico y con el
mismo ya formado plegar correctamente el resto de la protena (mecanismo de colpaso hidrofbico). Si hay
cuaternaria, normalmente se pliega cada subunidad de forma independiente y luego se ensambla la estructura
cuaternaria (en algunos casos la consolidacin de la estructura terciaria est acoplada al ensamblado de las
subunidades). Las fuerzas seran: puentes de hidrgeno para las secundarias, puentes de hidrgenos e
interacciones hidrofbicas para la terciaria, con estabilizacin final por puentes disulfuro. Normalmente la
principal fuerza para el plegado son las interacciones hidrofbicas.

5. Dada las siguientes secuencias de aminocidos, discuta las posibles estructuras secundarias que puede
adoptar. Justifique su respuesta:

a) N-Gly-Ala-Gly-Phe-Gly-Ala-Gly-Pro-Leu-Gly-Ser-Ala-Phe-Tyr-Arg-Leu-Trp

b) N-gly-Pro-His-Gly-Pro-(OH)Lys-Gly-Pro-(OH)Pro-Gly-Pro-Ala

c) N-Leu-Ser-Phe-Ala-Ala-Met-Asn-Gly-Leu-Ala

Respuesta: La (b) es, evidentemente, una hlice de colgeno por la sucesin de Gly y Pro(OH). En el caso de
(a) la presencia de tantas glicinas no permite una estructura estable, por lo que es esperable una conformacin
aleatoria (random coil). El uso de un programa de prediccin, arroj este resultado:
GAGFGAGPLGSAFYRLW
Ccccccccchhhhhhcc
Donde c es random coil y h es hlice. En el caso de (c), se puede pensar en una hlice dado que no hay
aminocidos grandes cercanos, o cargas que se repelan. De hecho, uno de los programas de ajuste dio esa
estructura secundaria.

5. Usted tiene la siguiente secuencia peptdica: RAVDLIKWSELAK (Arg-Ala-Val-Asp-Leu-Ileu-Lys-Trp-Ser-

Glu-Leu-Ala-Lys), qu tipo de estructura secundaria piensa que es ms probable que forme y por qu?

Respuesta: En este caso, se observa una sucesin de cargas + y a espacios regulares entre 3 o 4 aminocidos
quedando, por lo tanto, cercanas en el espacio si se formara una -hlice con una posible funcin estabilizadora.
Dado que no parece haber un impedimento estrico por la existencia de residuos grandes cercanos o la
presencia de Gly o Pro que desestabilizaran, uno podra pensar en la hlice como estructura secundaria.

6. Usted posee un pptido que es un potente inhibidor de la conduccin nerviosa y desea obtener la estructura primaria. El
anlisis de aminocidos revela la siguiente composicin: Ala(5), Lys, Phe. La reaccin del pptido intacto con FDNB,
libera DNP-alanina, luego de hidrlisis cida y -DNP-lisina (pero no -DNP-lisina) tambin se encuentra. La digestin
con tripsina deja un tripptido (Lys, Ala(2)) y un tetrapptido (Ala(3),Phe). La digestin con quimotripsina del pptido
intacto libera un hexapptido y alanina libre. Escriba la secuencia del pptido e indique los puntos de corte. Datos: la
tripsina corta hacia el extremo COOH de los aminocidos bsicos y la quimotripsina corta hacia el COOH de Phe, Trp,
Tyr.
Respuesta: Ala-Ala-Lys-Ala-Ala-Phe-Ala En este caso, la lisina es el amino terminal por el resultado de la
reaccin con FDNB (fluor dinitro benceno). Los otros derivados de la lisina corresponden al amino en la
posicin psilon. La quimotripsina corta hacia el carboxilo de los aminocidos aromticos y la tripsina hacia el
carboxilo de lisina y arginina. Por lo tanto, el tripptido (Lys, (ALA)2) deber ser Ala-Ala-Lys. El corte con
quimotripsina deja alanina libre, con lo que esta estaba como carboxilo terminal siguiendo a la Phe.

7.Usted sintetiza una cadena polipeptdica que presenta una cara hidrofbica y una cara que alterna porciones
hidrofbicas e hidroflicas. Suponga que enfrenta dos cadenas de iguales caractersticas. Qu caras formarn
ms fcilmente una conformacin cuaternaria y por qu?

Respuesta: Al hablar de caras hidrofbicas o alternando porciones hidrofbicas e hidroflicas, se est

mencionando una estructura secundaria definida, o hlice o cadena porque si fuese aleatoria no podra decirse
lo mismo. En cualquier caso, el tener una cara hidrofbica har que la interaccin entre las dos cadenas sea ms
fcil dado que es la caracterstica de la unin entre subunidades. La otra cara, con alternancia tambin podra
asociarse, pero esto estara menos facilitado aunque, eventualmente, ms especfico.

8.A partir de un hongo raro, usted ha aislado un octapptido que combate la calvicie y desea determinar la estructura
primaria del mismo. La composicin en aminocidos es Lys(2), Asp, Tyr, Phe, Gly, Ser, Ala. La reaccin del pptido
intacto con FDNB da DNP-alanina y 2 moles de -DNP-lisina, luego de hidrlisis cida. Corte con tripsina da pptidos
con una composicin (Lys, Ala, Ser) y (Gly, Phe, Lys) ms un dipptido. La reaccin con quimotripsina libera cido
asprtico, un tetrapptido con composicin (Lys, Ser, Phe, Ala) y un tripptido (Gly, Lys, Tyr). Escriba la secuencia del
pptido e indique los puntos de corte. Datos: la tripsina corta hacia el extremo COOH de los aminocidos bsicos y la
quimotripsina corta hacia el COOH de Phe, Trp, Tyr.

Respuesta: Ala-Ser-Lys-Phe-Gly-Lys-Tyr-Asp
El tratamiento con FDNB (flor dinitro benceno) produce el derivado de Alanina, con lo que se indica que ste es el
amino terminal. Los derivados de lisina, al estar marcados en indica que el reactivo marc el amino de la cadena lateral.
Al cortar con tripsina, los pptidos sern (Ala, Ser)-Lys y (Gly, Phe)-Lys ms el dipptido. Al cortar con quimotripsina,
se libera Asp lo que indica que ste es el COOH terminal y que estaba al lado de un aminocido aromtico. Sumado a lo
anterior, podemos escribir (Lys, Ser, Ala)-Phe y (Gly, Lys)-Tyr pero el dipptido anterior tiene que ser Tyr-Asp, con lo
que va quedando (Gly, Lys)-Tyr-Asp. Pero por el corte con tripsina, este tiene que ser Gly-Lys-Tyr-Asp y por
quimotripsina (Lys, Ser, Ala)-Phe-Gly-Lys-Tyr-Asp y, una vez ms considerando que Ala es el amino terminal y el corte
con tripsina, queda: Ala-Ser-Lys-Phe-Gly-Lys-Tyr-Asp

9.Ud. tiene que disear una protena globular que contenga, en el extremo N-terminal, una -hlice de 5 vueltas que est
destinada a formar un homodmero con otra molcula de la misma protena, como lo indica la figura. Proponga una
secuencia de aminocidos que cumpla con este requisito. Aydese dibujando un esquema en espiral.

Respuesta: Una vez ms, si se genera una cara de la hlice con alta caracterstica hidrofbica, la probabilidad de que se
una en homodmero mediante esa cara es muy alta. Para esto, en las posiciones 3 o 4 de cada vuelta debera haber un
aminocido de esta naturaleza.

10. Indique, brevemente, qu pasos seguira para analizar por completo una protena determinando,
secuencialmente, la estructura primaria, la composicin en estructuras secundarias y la conformacin terciaria.

Respuesta: Para analizar la estructura primaria, si la protena posee subunidades stas se separarn con urea
seguida de una cromatografa o electroforesis para tenerlas como fracciones distintas. Cada una se linealizar
con urea y reducir con mercaptoetanol para romper cualquier puente disulfuro. Luego se degradar con
tripsina u otra proteasa adecuada y los polipptidos se separarn. Cada uno se someter a la degradacin de
Edman y se obtendr la secuencia de los mismos. Repitiendo el proceso con bromuro de ciangeno se podrn
comparar ambos resultados y armar la secuencia de la protena. Para analizar la composicin en estructuras
secundarias, se puede realizar un anlisis de dicrosmo circular calibrando contra estructuras patrn de hlices,
cadenas beta o giros. Finalmente, la estructura terciaria se conocer por cristalografa de rayos-X o RMN.

11. Describa, brevemente, cmo procedera para secuenciar una protena formada por 4 subunidades idnticas.

Respuesta: En este caso, siendo las cuatro subunidades idnticas, basta separarlas con urea y reducirlas con
mercaptoetanol y, luego, proceder a la secuenciacin dado que no har falta tenerlas en forma individual porque
tendrn la misma secuencia.

12. Qu ventajas tiene el uso del MALDI comparado con mtodos de secuenciacin clsica. Describa
brevemente cada uno de los mtodos.
Respuesta: La ventaja del uso del MALDI es que se puede partir de cantidades ms pequeas de protena y es
mucho ms rpido. No discrimina, en principio entre leucina e isoleucina, cosa que el mtodo de Edman s
puede hacerlo. Brevemente, se corta la protena con una proteasa y se colocan los polipptidos en la cmara de
ionizacin. Se ionizan los pptidos y se van separando segn la relacin masa/carga. Cada uno pasa a una
cmara de colisin, donde son bombardeados con Argn a alta velocidad y se produce la fragmentacin en las
uniones peptdicas. Dado que se tienen muchas molculas de cada polipptido, la idea es que se fragmentarn
en todas las posiciones posible, al menos una vez. Esto generar polipptidos de tamaos que diferirn en el PM
de un aminocido. Pasan a la cmara de aceleracin donde llegan al detector, tambin segn relacin
masa/carga. De la diferencia entre los tamaos de los polipptidos, se puede saber qu aminocido corresponde
a cada diferencia y, por lo tanto, la secuencia.

13. Explique cmo procedera para obtener la estructura de una protena utilizando cristalografa de rayos X.

Respuesta: En este caso, hay que obtener un cristal puro de la protena en cuestin, llevarlo a temperatura de nitrgeno
lquido -190C y hacerle llegar un haz monocromtico de rayos X que, al dispersarse, generarn una imagen de puntos
con mayor o menor intensidad lumnica segn las ondas se sumen o resten. El cristal se gira en el espacio para tener todos
los puntos de difraccin. Una computadora, utilizando la transformada de Fourier pone en fase todos los datos,
entregando las coordenadas en las tres dimensiones x, y, z. Con esto se arma el mapa de densidad electrnica y
conociendo la secuencia de aminocidos se establece la conformacin espacial. Para generar los cristales se emplean altas
concentraciones de protena (tpicamente 10 mg/ml) y algn agente qumico que favorece la interaccin entre las
protenas (NaCl, PEG, sulfato de amonio, etc).

14. Qu informacin puede obtenerse a partir del dicrosmo circular?

Respuesta: el dicrosmo circular (CD) mide la diferencia de absorbancia entre luz circularmente polarizada en
sentido dextrgiro y levgiro. Para que una molcula presente bandas en el CD debe tener cromforos quirales
o sino son quirales deben estar rodeados de un entorno quiral. El CD en el UV lejano (190-250 nm) tiene
informacin acerca de la estructura secundaria. En este rango de longitudes de onda el principal cromforo son
las uniones peptdicas (tambin se pude ver el aporte de puntes disulfuro). La hlices alfa y las hojas beta tienen
espectros de CD en el UV lejano bien caractersticos. En el UV cercano (250-350 nm) absorben principalmente
las cadenas laterales de los residuos aromticos (F, Y, W). Si bien estos cromforos son planos y aquirales,
cuando se encuentran en un entorno proteico rgido presentan bandas de CD inducidas. En principio el CD en el
UV lejano da una idea del contenido de estructuras secundarias que se encuentran en una molcula proteica,
mientras que en el UV cercano da una medida de la rigidez del entorno de los residuos aromticos (que
usualmente se asocia a la estructura terciaria). El CD tambin se puede utilizar para seguir la desnaturalizacin
o renaturalizacin de una protena. Asimismo se puede emplear para seguir eventos de unin entre molculas
(siempre y cuando impliquen algn cambio estructural medible por CD) y as poder determinar constantes de
unin.

15. La conformacin del glbulo fundido se estabiliza principalmente por interacciones hidrofbicas. Por
qu no estn involucrados los puentes hidrgeno?

Respuesta: Las uniones puentes de hidrgenos estn involucradas, fundamentalmente, en la formacin y

estabilizacin de las estructuras secundarias. Esto ocurre al principio en el camino de plegado. Una vez que los
ncleos de plegado de estructuras secundarias se han formado, queda que las caras hidrofbicas expuestas se
alejen del solvente interactuando entre ellas para formar el core hidrofbico. Por eso es que las interacciones
hidrofbicas son fundamentales en la estabilizacin del glbulo fundido y llevan al colapso hidrofbico.

16. Indique los posibles efectos de las siguientes mutaciones en la estructura de una protena:

a) Leu a Phe: en este caso estamos cambiando un aminocido hidrofbico por otro tambin
bastante hidrofbico pero aromtico y ms grande. Probablemente el cambio no sea demasiado
marcado, pero va a depender de los aminocidos que se encuentren en la vecindad,
fundamentalmente por un problema estrico.
b) Lys a Glu: dependiendo de dnde se encuentre la lisina, al cambiarla por glutmico
estamos cambiando de carga positiva a negativa. Si la lisina es superficial tal vez sea un
cambio que pase inadvertido. Si la lisina estaba formando un par inico estabilizando una
hlice, entonces la estructura se va a desestabilizar.
c) Val a Thr: en este caso cambiamos un aminocido hidrofbico con cadena lateral
ramificada por uno polar (alcohol). Lo ms probable es que se genere un cambio estructural
que depender de la ubicacin de la valina. Si est en el core hidrofbico ser un cambio que
probablemente no pase inadvertido debido a la gran compactacin del mismo.
d) Gly a Ala: este cambio probablemente tienda a estabilizar ms la estructura dado que
reemplazamos a la glicina por otro aminocido pequeo pero con mayores restricciones
estricas por la cadena lateral.
e) Met a Pro: este cambio muy probablemente genere una desestabilizacin en la estructura
secundaria por las caractersticas estructurales de la prolina como aminocido cclico y su
posibilidad de transicin cis o trans.

ACLARACIONES PARA LOS PROXIMOS PROBLEMAS:

la N-glicosilacin es una de las modificaciones postraduccionales ms comunes. Ocurre sobre las protenas
que son sintetizadas en la va secretoria (en el retculo endoplsmico). Esta modificacin puede tener
consecuencias muy marcadas sobre las propiedades de las protenas. Los oligosacridos pueden tener varios
kilodaltons de peso molecular y su naturaleza hidroflica puede aumenta dramticamente la solubilidad y
estabilidad de las glicoprotenas. Los N-glicanos se clasifican en tres familias: alta manosa, complejos y mixtos.
la agregacin proteica puede medirse mediante dispersin de luz. Tpicamente se usa radiacin de 360 nm.

PROBLEMA 17
La protena Xhil-P est glicosilada en dos sitios. Uno de los N-glicanos es de alta manosa, mientras que el otro
es un azcar complejo biantenario. Para estudiar el efecto de la N-glicosilacin en la estabilidad conformacional
de Xhil-P se decidi desglicosilarla mediante tratamiento con ENDO-H (corta N-glicanos de alta manosa) o
con PNGase F. En paralelo se trat la protena con un procedimiento qumico que elimina TODOS los N-
glicanos. Las muestras se analizaron por un gel de SDS PAGE:

MWM Xhil-P ENDO-H PNGase F Trat. Quimico

66

55

40

A continuacin se midi la estabilidad trmica de Xhil-P y de sus variantes desglicosiladas enzimticamente

siguiendo la seal de dicrosmo circular a 280 nm (reporta estructura terciaria):
 1
Xhil-P
Fraccin
ENDO-H
nativa
PNGase F

Temperatura

1) En base al primer gel, qu puede decir de la especificidad del corte por PNGase F?
2) Cul es el efecto de los N-glicanos en la estabilidad de Xhil-P? A qu se debe la diferencia de estabilidad
entre la protena tratada con ENDO-H y la tratada con PNGase F?

Respuestas: 1) Evidentemente, por la diferencia en tamao observada en el gel, la PNGasa elimina toda la
glicosilacin al igual que el tratamiento qumico siendo, por lo tanto, menos especfica que la ENDO-H. De
hecho se sabe que la PNGase corta todos los N-glicanos (alta manosa, hbridos y complejos), mientras que la
ENDO-H es ms especfica (no corta los N-glicanos complejos)
2) De la curva de estabilidad, se ve que Xhil-P se desnaturaliza en un 50% a mayor temperatura que las otras
dos siendo, por lo tanto, ms estable. Entonces podemos concluir que la glicosilacin aporta estabilidad a la
protena. Comparando el tratamiento con ENDO-H, se ve que el producto es ms estable que aqul que perdi
toda la glicosilacin, es decir que el complejo biantenario (que la ENDO-H no corta) todava estabiliza ms a la
protena que el rico en manosa. De lo contrario, si este biantenario no tuviese un papel importante, ambas
curvas deberan superponerse. Para ver realmente el efecto de este biantenario, debera usarse una glicosidasa
especfica y comparar con la ENDO-H.

PROBLEMA 18
La protena Luc-G se encuentra modificada con un N-glicano de alta manosa. Para estudiar el efecto de la N-
glicosilacin en el comportamiento biofsico de Luc-P, la protena fue desglicosilada con ENDO-H y se estudi
desnaturalizacin trmica de ambas formas mediante dicrosmo circular en el UV cercano (reporta estructura
terciaria) y lejano (reporta estructura secundaria):

UV lejano
UV cercano

Luc-P

65C
Temperatura

UV cercano UV lejano

Luc-P +
ENDO-H

45 C 55C
Temperatura

Para medir la tendencia a formar agregados de ambas protenas se las incub a 70C y se midi la dispersin de
luz a 360 nm a lo largo del tiempo:
 1
OD 360 nm

Tiempo

1) En base a los experimentos de dicrosmo circular Cul fue el efecto de las desglicosilacin en el
camino de desplegado trmico de la protena?
2) Las curvas 1 y 2 corresponden a Luc-G y a su variante tratada con ENDO-H Podra asignar cada
curva a la protena correspondiente? En base a qu decidi su eleccin?

Respuestas:
ACLARACIN: en la curvas de desnaturalizacin seguidas por CD o fluorescencia (o cualquier otra tcnica) a
veces van a ver que a medida que la temperatura o la cc de agente desnaturalizante aumenta la seal medida
sube, y otras vece baja. Que suba o baje va a depender de la longitud de onda que hayan elegido para graficar y
de la seal a dicha longitud de onda de las especies qumicas involucradas en el la transicin que estn
siguiendo. Por ejemplo, si estn siguiendo el desplegado de una protena por fluorescencia, a medida que suben
la cc de urea van a ver que la seal medida a 330 mn va a bajar, en cambio la seal medida a 350 nm va a subir.
Esto se debe a que usualmente las protenas en estado nativo, con sus residuos aromticos en el core
hidrofbico, presentan el mximo de fluorescencia cerca de los 330 nm, mientras que al desplegarse estos
residuos se exponen al entorno acuoso (ms polar) y fluorescen con un mximo cercano a os 350 nm. Lo
importante, ms all de que la seal medida suba y baje, es la posicin en el eje X de la transicin. Siempre a
mayores cc de denaturalizante o a mayor temperatura van a tener a las especies menos plegadas. Ahora s,
vamos al problema.
1) Analizando el grfico de dicrosmo circular para Luc-P y la tratada con ENDO-H, se ve que Luc-P presenta
la misma temperatura para desnaturalizar tanto la estructura secundaria como la terciaria. Esto indica que ambas
estn totalmente coordinadas en su plegado y que el desplegado de la secundaria es acompaado por el de la
terciaria y viceversa. Esto indicara un camino en el que ambas estructuras se rompen al mismo tiempo, siendo
una transicin de dos estados (en el equilibrio tengo slo dos especie, nativa o desplegada, sin intermediarios).
Asimismo podemos decir que en este caso la estructura secundaria depende de la estructura terciaria, puesto
que al romper la terciaria tambin se rompi la secundaria.

Mientras que al analizar el efecto del tratamiento con ENDO-H, se ve una separacin en las temperaturas,
perdindose primero la estructura terciaria y, a mayor temperatura, la secundaria. Evidentemente la
desglicosilacin desestabiliza ms la estructura terciaria que la secundaria, aunque se ve que la secundaria
tambin se pierde a menor temperatura que cuando la protena est completa. Es decir que tambin tiene un
cierto papel en la estabilizacin de la secundaria pero ms importante en estabilizar la terciaria. En este caso la
estructura secundaria no depende de la terciaria, puesto que tengo un rango de temperaturas en donde se perdi
la estructura terciaria pero se mantuvo la estructura secundaria. En este sistema hay al menos tres especies: la
protena nativa, un intermediario tipo glbulo fundido (con prdida de terciaria pero que mantiene la
secundaria) y la protena desplegada. 2) Al incubar a 70C ya se est superando la temperatura de
desnaturalizacin del 50% de la protena, por lo que es de esperar que las estructuras estn desnaturalizadas.
Dado que en el tiempo aumenta la dispersin ptica, esto es un indicio de agregacin proteica (curva 1) que
puede indicar la mayor exposicin de residuos hidrofbicos al desnaturalizarse la protena. Por lo tanto esa
curva debera corresponder al tratamiento con ENDO-H.

PROBLEMA 19:
La protena Kal2 est glicosilada por un N-glicano de alta manosa. Para estudiar el efecto de la N-glicosilacin
en la estabilidad conformacional de Kal2 se purificaron sus variantes glicosiladas y no glicosiladas,
denominadas Kal2 y Kal2-NG, respectivamente. La variante Kal2 fue expresada en levaduras, mientras que la
variante Kal2-NG en Escherichia coli (esta bacteria no N-glicosila protenas). Para verificar el estado de
glicosilacin las protenas se analizaron por un gel de SDS PAGE luego de ser tratadas o no con ENDO-H
(enzima que cliva N-glicanos de alta manosa):
ENDO H - + - +
MWM Kal2 Kal2 Kal2-NG Kal2-NG

55

30

15

A continuacin se midi la estabilidad trmica de Kal2 y Kal2-NG siguiendo la seal de dicrosmo circular a
280 nm (reporta estructura terciaria) y a 220 nm (reporta estructura secundaria):

1
Kal2 (220 y 280 nm)
Seal CD
Kal2-NG (220)
normalizada
Kal2-NG (280 nm)

Temperatura
1) Explique las diferencias de tamao observadas en la electroforesis
2) Cul es el efecto de los N-glicanos en la estabilidad de Kal2?
3) Que indica que las seales a 220 y 280 nm para Kal2 cambien en paralelo? Cul podra ser el motivo del
corrimiento observado entre 280 y 220 nm para Kal2-NG?

Respuestas:
1) La diferencia en la corrida electrofortica de Kal2 con o sin tratamiento con ENDO-H
representa la prdida de los N-glicanos de alta manosa. El hecho que Kal2 haya sido
expresada en levaduras y que Kal2-NG en bacterias explica que la primera est
glicosilada y la segunda no, de all la diferencia en los tamaos moleculares (usualmente
las bacterias no tienen N-glicosilacin de protenas). Por esto, el tratamiento con ENDO-
H de la forma no glicosilada no produce un cambio en tamao, dado que de entrada ya no
estaba glicosilada.
2) Cuando se observan las curvas de dicrosmo para las diferentes formas, puede verse que
Kal2 es ms estable que las formas no glicosiladas. Esto ya indica que la glicosilacin
estabiliza a la conformacin.
3) Dado que Kal2 muestra exactamente la misma variacin a 220 y 280 nm esto muestra que
la estructura secundaria y la terciaria son interdependientes, es decir que los cambios van
en paralelo. Cambian ambas al mismo tiempo con la temperatura. Por el contrario, la
desglicosilacin hace que la estructura terciaria se modifique antes que la secundaria, tal
como se ve en la disociacin de las curvas a 220 y 280 nm para la Kal2-NG. Esto est
indicando que desde el punto de vista de la dependencia con la glicosilacin, la terciaria
depende ms que la secundaria.

El grado de oligomerizacin de Kal2 y Kal2-NG fue estudiado mediante dispersin de luz dinmica. Segn su
secuencia primaria Kal2 presenta un PM de 32 kDa. El PM de las protenas en solucin medido fue:
Kal2: 68 kDa
Kal2-NG: 32 kDa
A continuacin se determin la unin de ANS (cido anilino naftaln sulfnico) a ambas protenas. El ANS es
un compuesto cuya fluorescencia se incrementa unas 100 veces cuando se une a un parche hidrofbico expuesto
de una protena:
Kal2-NG

Fluorescencia

Kal2
Long. onda

Para medir la tendencia a formar agregados de ambas protenas se las incub a 70C y se midi la dispersin de
luz a 360 nm a lo largo del tiempo:

1
OD 360 nm

Tiempo

4) Cul es el efecto de la N-glicosilacin de Kal2 sobre su estado de oligomerizacin?

Cul podra ser la causa del incremento en la unin de ANS a Kal2-NG?
5) En el experimento de agregacin a 360 nm, a cul de las protenas corresponderan las curvas 1 y 2.
Justifique.

Respuestas:
4) Dado que la desglicosilacin aumenta la fluorescencia de Trp es muy probable que esta
mayor interaccin de ANS con la protena se deba a la exposicin de residuos
hidrofbicos, indicativo de una desnaturalizacin. Ahora, el PM de la protena glicosilada
es de 68 mientras que es 32 cuando no tiene los hidratos de carbono. Esto indica que la
protena glicosilada est como dmero. Posiblemente el N-glicano sea parte de la red de
interacciones que permiten la interaccin de las subunidades para formar el dmero.
5) En el experimento de agregacin, la dispersin de la luz aumentando con el tiempo indica
que la protena se est agregando (curva 1) lo que correspondera a una mayor
interaccin con los parches hidrofbicos expuestos (ANS) al desglicosilarse, mientras
que la protena glicosilada (2) no muestra mayor agregacin porque ya est como dmero
y esos parches hidrofbicos estn formando parte de la estructura cuaternaria y no
expuestos.
PROBLEMA 20
Usted est tratando de expresar en E. coli el inhibidor de quimotripsina 2 silvestre (CI2) y una versin mutante
en la cual introdujo por mutagnesis dirigida un puente disulfuro intracatenario (CI2-mut). La masa molecular
de ambas protenas es de 8.5 kDa y se encuentran clonadas en el vector pBAD, inducible por arabinosa. Luego
de inducir dos cepas cada uno expresando una de las protenas, cosecha las clulas, las lisa con lisozima y
Tritn X-100 (un detergente no inico) y centrifuga el lisado, separando el sobrenadante (sn) del precipitado
(pp). Al analizar ambas fracciones mediante un gel de SDS-PAGE observ lo siguiente:

1 2 3 4 5 6 7 8
Arabinosa - + + + - + + +
T T PP SN T T PP SN
180 kDa
100 kDa
66 kDa

29 kDa

10 kDa

T: total (SN + PP)

PP: precipitado. CI2 CI2-mut
SN: sobrenadante

Luego de purificar las protenas de la fraccin soluble estudi su estabilidad conformacional ante la urea,
midiendo en paralelo la fluorescencia de TRP (sensible a la estructura terciaria, lnea continua) y la seal de
dicrosmo circular a 222 nm (sensible a la estructura secundaria, lnea punteada):

Max. Fluor. CD 222 nm

CI2 0 mdeg
320 nm

340 nm -5 mdeg

2M 3.5 M [Urea]
Max. Fluor. CD 222 nm
CI2-mut
320 nm 0 mdeg

340 nm -5 mdeg

5M [Urea]
Preguntas:

1) Cul fue el efecto de la mutacin en la estabilidad de la protena? Explique de qu forma la

introduccin del puente disulfuro afect la estabilidad y cul podra ser su efecto a nivel molecular.
Respuesta: En este caso, la mutacin aument la estabilidad dado que la curva se corre hacia concentraciones
mayores de Urea, es decir a mayor estabilidad. Muy probablemente esto se deba a la aparicin del puente
disulfuro que de alguna manera fija la estructura terciaria al formar esta unin covalente. Normalmente el
efecto estabilizante de los puentes disulfuro se debe a que los mismos disminuyen la movilidad del estado
desplegado. Al tener menor movilidad el nmero de microestados accesible disminuye (o sea que disminuye su
entropa) y se desestabiliza respecto del estado nativo. Como consecuencia de esto aumenta la estabilidad
relativa del estado nativo respecto del desplegado.
2) Existe algn intermediario durante el desplegado de alguna de las protenas? En caso afirmativo, qu
caractersticas estructurales presenta?
Respuesta: En el caso del desplegado de la protena silvestre (CI2) se observa un desfasaje entre la
desnaturalizacin de la estructura terciaria (lnea llena) y la secundaria (punteada) lo que indica que se pasa por
un estado intermediario donde se va desplegando primero la terciaria para, luego a mayor concentracin de urea
se despliega la secundaria. En el caso de la mutante, ambas curvas muestran una variacin simultnea, por lo
que podra pensarse que no hay un intermediario entre el estado nativo y el desnaturalizado, dado que ambas
estructuras varan al mismo tiempo. Esta ltima sera una transicin de dos estados, en donde en el equilibro
tengo nicamente protena nativa o desplegada, y lo que voy haciendo con la urea es desplazar dicho equilibrio.

3) A qu podra deberse la diferencia en la distribucin entre sobrenadante y precipitado entre ambas

protenas? Proponga algn mtodo que le permita recuperar a CI2 del precipitado en forma cuantitativa
y con actividad biolgica.
Respuesta: Evidentemente la protena silvestre (CI2) aparece ms en el precipitado que en el sobrenadante. Esto
podra indicar una mayor agregacin al sobreexpresar esta protena en la bacteria, dado que la versin silvestre
(no mutada) es menos estable y, por lo tanto, podra estar exponiendo ms zonas hidrofbicas que la mutante,
ms estable por la presencia del puente disulfuro. Uno podra tratar de solubilizarla con pequeas
concentraciones urea, para romper las interacciones hidrofbicas que estabilizan el agregado.

PROBLEMA 21

La protena HAL2 est formada por dos subunidades idnticas de 24 kDa cada una. La superficie de contacto
entre las subunidades est formada por una hlice alfa (llamada hlice "C") que presenta la secuencia:

Leu-Ala-Val-Tyr-Ala-Met-Ala-Leu-Ala-Val-Tyr-Ala-Met-Ala-Leu-Ala-Val-Tyr-Ala-Met-Ala-Leu-Ala

Por otra parte, HAL2 presenta una segunda hlice alfa (hlice "B"), de la cual NO se sabe si participa en la
superficie de contacto entre las subunidades.

A continuacin se realizan las siguientes mutaciones:

Mutante 1: (llamada MUT1) sobre la hlice C que forma la superficie de contacto se cambian dos residuos de
Leu por Ala, la nueva hlice presenta la secuencia:

Leu-Ala-Val-Tyr-Ala-Met-Ala-Ala-Ala-Val-Tyr-Ala-Met-Ala-Ala-Ala-Val-Tyr-Ala-Met-Ala-Leu-Ala

Mutante 2: (llamada MUT2) se cambia una Tyr de la hlice "B" por Gly

Para ver el efecto de las mutaciones sobre la estructura y estabilidad de HAL2 se realizaron curvas de
desnaturalizacin inducidas por UREA seguidas mediante las siguientes tcnicas:
a) Dispersin de luz: permite medir el tamao de las molculas en solucin
(DATO: si una protena tiene estructura cuaternaria por dispersin de luz se obtiene el tamao del oligmero.
Los cambios de estructura terciaria no se detectan)
Tamao
48 kDa Curvas para HAL2 y
MUT2

MUT1
24 kDa
2 2.5 M UREA (M)
b) Dicrosmo circular en el UV cercano (estructura terciaria)

Fraccin
desplegada Curvas para HAL2 y
MUT2 MUT1

0
2.5 M 3.5 M UREA (M)

c) Dicrosmo circular en el UV lejano (estructura secundaria)

Fraccin Curvas para

desplegada HAL2 y
MUT2 MUT1

0
2.5 M 5 M UREA (M)

Preguntas:
1) Cmo es el camino de desplegado de HAL2? Describa cmo es la prdida de los diferentes niveles de
estructura en base a las curvas.
Respuesta: analizando solamente HAL2, puede verse lo siguiente: la dispersin de luz indica que a 2.5
M de urea, las dos subunidades se separan (pasamos de 48 kDa a 24 kDa) directamente sin
intermediarios. Este paso es desagregacin de las subunidades (prdida de estritura 4ria). Cuando
pasamos a UV cercano (estructura terciaria), vemos que HAL2 necesita urea 3.5 M (ya se separaron las
subunidades) para desplegarse y perder su estructura terciaria. Mientras que la estructura secundaria se
pierde recin a urea 5M, es decir se pasa por un estado intermediario donde HAL2 ha perdido su
estructura terciaria pero mantiene la secundaria para, luego, perderla a mayor concentracin de urea.
Esquemticamente se puede representar as:

Urea 2.5 M Urea 3.5 M Urea 5 M

prdida 4ria prdida 3ria prdida 2ria

2) Cul fue el efecto de las mutaciones introducidas en MUT1 sobre el camino de desplegado? Describa
cmo es la prdida de los diferentes niveles de estructura en base a las curvas.
Respuesta: El desplegado de Mut1 puede representarse as:
 Urea 2 M Urea 3.5 M Urea 5 M
prdida 4ria prdida 3ria prdida 2ria

Puede observarse que MUT1 (mutacin en la hlice C) provoca que la separacin de las subunidades
ocurra a menor concentracin de urea (dispersin de la luz). Esto indica que la hlice C estaba jugando
un papel importante en el mantenimiento de ambas subunidades en una estructura cuaternaria. Si
continuamos con el estudio de MUT1, vemos que la prdida de estructura terciaria se superpone con
HAL2, es decir que esta hlice no contribua a la estructura terciaria dado que no cambia el patrn de
seal con respecto a la protena silvestre. Lo mismo ocurre con la prdida de estructura secundaria que
se superpone con HAL2. Es decir que el camino se diferencia, fundamentalmente, en la desagregacin
de las subunidades, donde la hlice C juega un papel importante en mantenerlas asociadas.

3) Qu tipo de motivo estructural mantiene a HAL2 en forma dimrica?

Respuesta: Cuando uno analiza la secuencia y ve que la mutacin en MUT1 (hlice C) corresponde a un
cambio de dos leucina por alaninas. Asimismo, en la secuencia se puede ver que hay cuatro Leu cada
siete residuos. Lo ms probable es que este pptido forme un cierre de leucinas (leucine zipper), el
cual mantuviese asociadas a la subunidades.

4) Cul fue el efecto de la mutacin introducida en MUT2 sobre el camino de desplegado? Describa como
es la prdida de los diferentes niveles de estructura en base a las curvas.
Respuesta:
El desplegado de Mut2 puede representarse as:

Urea 2.5 M
prdida 4ria,
3ria y 2ria

En este caso, la mutacin se produce sobre la otra hlice (B) cambiando una tirosina por glicina. Si
analizamos el proceso de ruptura del dmero, esta mutacin no modifica la separacin de las
subunidades, indicando que esta hlice no estaba involucrada en mantenerlas asociadas en la estructura
cuaternaria. Al estudiar la prdida de estructura terciaria (UV cercano), se ve que esta mutacin
desestabiliza la estructura terciaria porque ahora se pierde a menor concentracin de urea que para
HAL2 y MUT1, es decir que esa hlice contribua al mantenimiento de la conformacin terciaria. Lo
mismo ocurre con la estructura secundaria que, ahora, se desnaturaliza a menor concentracin de urea
que HAL2 y MUT1, pero coincide con la prdida de la estructura terciaria. Es decir que esta mutacin
hace que el pasaje de estructura terciaria y secundaria hacia la forma desnaturalizada ocurra al mismo
tiempo a la misma concentracin de urea. Entonces, el camino sera la desagregacin en subunidades y,
luego, la desaparicin simultnea sin intermediarios de las estructuras terciaria y secundaria. O sea que
 la desnaturalizacin de Mut2 es un proceso de dos estados, en donde en el equilibrio hay slo dos
especies (dmero nativo y monmero desplegado).

5) Cmo es la dependencia mutua de los diversos niveles de estructura para MUT2? (dicho de otra forma:
Cmo depende la estructura terciaria y secundaria de la estructura cuaternaria?)
Respuesta: En el caso de MUT2, la concentracin de urea para desagregar las subunidades y
desnaturalizar las estructuras terciaria y secundaria es la misma, comparada con lo que pasa para HAL2
y MUT1, por lo que podra pensarse en una total interdependencia de los tres tipos de estructura en el
caso de MUT2. Para HAL2 y MUT1 la estructura secundaria no depende de la terciaria, y a su vez la
estructura terciaria no depende de la cuaternaria. Dicho de otra forma, puedo disociar el dmero y
generar monmeros plegados (con estructura terciaria), con lo cual la terciaria es independiente de la
cuaternaria, y a su vez puedo romper la estructura terciaria sin romper la secundaria (o sea que la
secundaria es independiente de la terciaria).

6) Cul podra ser el motivo molecular de cambiar TYR por GLY en la estabilidad de MUT2?
Respuesta: en general la mutacin por glicina tiene efectos desestabilizantes sobre la estructura. Ese es
el caso de Mut2, en donde la desestabilizacin fue tan grande que cuando a 2.5 M urea disocio el
dmero, esa cc de urea ya es lo suficientemente alta como para tambin romper la estructura terciaria y
secundaria. La razn molecular de esto se debe a que la glicina estabiliza el estado desplegado,
favoreciendo el desplazamiento del equilibrio desde el estado nativo. Esto se debe a que la Gly aumenta
la entropa del estado desplegado. Al no tener cadena lateral, la glicina permite explorar conformaciones
prohibidas para otros residuos (puede estar en cualquier cuadrante del grfico de Ramachandan). Este
efecto se ve en el estado desplegado, el cual ahora tiene una mayor flexibilidad conformacional y
aumenta el nmero de microestados que pueden explorar (o sea su entropa), estabilizndolo.

PROBLEMA 22

El gen que codifica para la protena Sma fue aislado de hgado de rata y clonado en un vector de expresin en la
bacteria Escherichia coli. Sma est formada por dos dominios: el dominio A tiene un PM de 11 kDa y el B un
PM de 15 kDa. Cada una de los dominios presenta un triptofano en el core hidrofbico, el cual sirve para medir
la estabilidad de la protena mediante fluorescencia.

Para determinar si la protena Sma expresada en E. coli es soluble o se fue a cuerpos de inclusin, luego de
crecer las bacterias a 37 C, se rompieron mediante sonicacin y detergente , se centrifug el material resultante
y se separ el sobrenadante (SN) del precipitado (PP). Las fracciones aisladas se analizaron por SDS-Page:

Gen de Sma - + + +
fraccin total total SN PP
Marcadores PM
180 kDa

100 kDa

50 kDa

27 kDa
10 kDa
A continuacin se expresaron los dominios por separado y se realiz un anlisis similar:

Expresin del dominio A

Plsmido con A - + + +
fraccin total total SN PP
Marcadores PM
180 kDa

100 kDa

50 kDa

27 kDa
10 kDa

Expresin del dominio B

Plsmido con B - + + +
fraccin total total SN PP
Marcadores PM
180 kDa

100 kDa

50 kDa

27 kDa
10 kDa

Luego de purificar las protenas (Sma completa, y los dominios por separado) se les midi la estabilidad
trmica siguiendo la intensidad de fluorescencia del triptofano en funcin de la temperatura:
 65 C

Sma 28 C
Fluorescencia 350 nm
S

28 C
A
Fluorescencia 350 nm

65 C
B
Fluorescencia 350 nm

Temperatura

Preguntas:

1) Explique la curva de desplegado de Sma (Por qu presenta dos transiciones?)

Respuesta: la protena Sma posee dos dominios (recuerden que un dominio es un mdulo estructural de
plegado independiente del resto de la protena, aunque formen parte de la misma secuencia
polipeptdica) entonces estas dos transiciones representan el diferente camino de plegado que cada
dominio sigui al plegarse la protena completa. Esto lo podemos inferir porque la temperatura de las
dos transiciones de Sma coinciden con la temperatura de las transiciones de los dominios aislados.

2) Cul es el grado de cooperacin del plegado de los dominios de Sma en la protena completa? (Se ve
afectada la estabilidad de un dominio por la presencia del otro?)
Respuesta: al comparar las tres curvas de fluorescencia, puede observarse que las dos transiciones que
se ven en la protena completa coinciden con la transicin individual para cada dominio por separado.
Por lo tanto, no pareceran cooperar en el plegado de la protena completa. Ojo que esto no
necesariamente es siempre as, hay muchos ejemplos de protenas multidominio en donde el desplegado
de un dominio induce el desplegado de otro dominio, o sea que no son independientes

3) Explique la distribucin intracelular de cada una de las protenas (SN o PP) en base a su estabilidad
trmica
Respuesta: De la distribucin entre precipitado y sobrenadante en las electroforesis en geles, puede
verse que tanto la protena completa como el dominio A aparecen fundamentalmente en el precipitado.
Dado que el dominio A se desnaturaliza a 28C y el B lo hace a 65C, puede pensarse que a 37C el
dominio A estar desnaturalizado y, por lo tanto, exponiendo ms zonas hidrofbicas lo que llevara a
agregacin tanto en la protena completa como en el dominio A aislado. El dominio B todava estara
plegado y no intervendra en esa agregacin.

PROBLEMA 23

La protena RepM cuando se une a secuencias especficas de DNA reprime la transcripcin de las
enzimas involucradas en la biosntesis de metionina. La unin al DNA es precedida por la unin a RepM de
una molcula pequea llamada S-adenosil metionina (SAM). Si SAM no est unida a la protena, sta no se
une al DNA. Segn su estructura primaria RepM tiene una masa molecular de 32 kDa. La estructura terciaria
de RepM puede esquematizarse de la siguiente forma:

Sitio de unin a SAM

K
Hlice A Superficie de unin al
D
ADN
K: lisina (residuo positivo)
D: cido asprtico
Los residuos de K y D marcados en la figura estn a tres aminocidos de distancia en la secuencia de RepM.

RepM posee varios residuos de triptofano que permiten estudiar cambios conformacionales mediante
fluorescencia.

Se estudi el efecto de la urea sobre RepM mediante dicrosmo circular en el UV lejano (far-UV, sigue
cambios de estructura secundaria) y por fluorescencia de triptofano (sigue cambios en la estructura terciaria, y
si la hubiere, de estructura cuaternaria). Las curvas se realizaron en ausencia y en presencia de SAM:

Sin SAM:
Fluorescencia CD far UV
MAX
nm 350 0

-5000
339

4.5 M 4.5 M

[UREA] [UREA]

Con SAM:
Fluorescencia CD far UV
MAX
nm 350
0
nm
2M

-5000
339
nm
330 4.5 M 4.5 M
nm
[UREA] [UREA]

A continuacin se determin el tamao de la protena por cromatografa de exclusin molecular (cuanto ms

grande es una protena su volumen de elucin es menor). El tamao de las protenas fue medido a la salida
de la columna mediante un detector de dispersin de luz:

Abs 280 nm
+SAM -SAM
64.2 kDa 32 kDa

Volumen
 Finalmente se estudi el efecto del la hlice A sobre la estructura de RepM. Para ello se mut el residuo de
lisina que est marcado en la figura por un cido asprtico y se midi el efecto de la urea en presencia de
SAM:

RepM mutada en presencia de SAM:

Fluorescencia CD far UV
MAX 350
nm nm 0
2M

339 -5000
nm

330 3M
nm 3M
[UREA] [UREA]

PREGUNTAS:

1) En base a los experimentos dibuje un modelo que describa el camino de desplegado de RepM en
presencia y en ausencia de SAM.
Respuesta:
1- Ausencia de SAM: de las curvas de fluorescencia (terciaria) y UV lejano (secundaria) se puede
observar que RepM no muestra intermediarios pasando de estructura terciaria a desnaturalizada al
mismo tiempo que pierde la estructura secundaria.
2- Presencia de SAM: la presencia de SAM lleva a RepM a una estructura cuaternaria de dmero
(pasar de 32 kDa a 64.2 kDa) lo que muestra un camino de desplegado que comienza con la
disociacin del dmero (primera transicin por fluorescencia indicando la prdida de estructura
cuaternaria) para luego seguir con el camino de desplegado sin intermediarios donde la terciaria y
la secundaria se pierden al mismo tiempo.

2) Cul es la estructura cuaternaria de RepM cuando se encuentra unido al DNA?

Respuesta: dado que RepM necesita tener unida a SAM para poder interactuar con el ADN y, adems
de los datos de las curvas de fluorescencia que siguen estructura terciaria y cuaternaria, se observa
que acta como un dmero.

3) Cul fue el efecto de la mutacin de K por D sobre la estabilidad de RepM? Cul podra ser la
causa de dicho efecto?
Respuesta: puede verse que la fase de transicin para la prdida de la agregacin se mantiene en
urea 2 M pero que la prdida de las estructuras terciaria y secundaria sigue ocurriendo al mismo
tiempo pero a menor concentracin de urea, indicando menor estabilidad. El cambio de lisina (K) por
asprtico (D) provoca el cambio de una carga positiva por una negativa. Muy probablemente la lisina
estuviese formando un par inico con una carga negativa que, ahora, se convierte en una fuerza
repulsiva (ver la ubicacin de K y D en la hlice).

4) Por qu podra ser que la primera transicin (la de urea 2 M) de la protena mutada sucede en la misma
concentracin de urea que con la protena silvestre?
Respuesta: el hecho que la primera transicin ocurra a la misma concentracin de urea tanto para la protena
silvestre como para la mutada, indica que en la agregacin de las subunidades no estaban interviniendo la
hlice en cuestin.

Nota: si bien este es un ejemplo inventado, en la realidad el comportamiento de RepM es bastante cercano.
SAM es un metabolito secundario de la metionina, la necesidad de RepM por SAM para unirse al DNA
constituye un elegante mecanismo de autorregulacin en la biosntesis de este aminocido. Medtelo por unos
segundos.
PROBLEMA 24

La protena IivA presenta un peso molecular predicho a partir de su secuencia de 12 kDa. En su secuencia
presenta un nico residuo de cistena.

Cuando se realiza un gel de SDS-page en condiciones reductoras (R) y no reductoras (NR) de IivA se observa:

Marcadores de R NR
peso molecular
50 kDa

30 kDa

15 kDa

6 kDa

La estabilidad de la protena fue medida mediante curvas de desnaturalizacin trmica. Las mismas fueron
seguidas mediante dicrosmo circular en el UV-lejano (estructura secundaria), dicrosmo circular en el UV
cercano (estructura terciaria) y por dispersin de luz (tamao molecular, estructura cuaternaria). Los
experimentos fueron hechos en condiciones reductoras (lnea punteada) y no reductoras (lnea continua):

CD UV lejano

Fraccin
desplegada

55 C 70 C Temperatura

CD UV cercano

Fraccin
desplegada

55 C 70 C Temperatura
Dispersin de luz

Peso
molecular

24 kDa

12 kDa

55 C Temperatura

Preguntas:

1) En base a los experimentos realizados describa el camino de desplegado trmico que siguen ambas
protenas. Cmo dependen los diversos niveles de estructura (cuaternaria, terciaria y secundaria) entre
s?
Respuesta: el comportamiento electrofortico de la protena en condiciones reductoras y no reductoras
indica que la cistena forma un puente disulfuro manteniendo ambas subunidades asociadas
covalentemente. Analizando ahora por separado las dos condiciones:
No reductoras: el dmero se mantendr siempre unido y las estructuras terciaria y secundaria se ve que
se pierden al mismo tiempo con la temperatura, desnaturalizndose a 70C sin pasar por intermediarios.
Dado que el puente disulfuro se mantiene, la dispersin de luz no indica que haya una separacin de las
subunidades (lnea llena a 24 kDa).
Reductoras: en este caso, se ve que las subunidades son menos estables cuando estn separadas por lo
que la desnaturalizacin ocurre a menor temperatura, pero sigue el mismo camino desplegndose la
terciaria y secundaria al mismo tiempo. En este caso, la dispersin indica la separacin de las
subunidades que, evidentemente ocurre en una sola etapa junto con la desnaturalizacin de la terciaria y
secundaria a la misma temperatura de 55C.

2) Cul es el efecto del puente disulfuro sobre la estructura y estabilidad de IivA?

Respuesta: el puente disulfuro aumenta la estabilidad y mantiene una estructura cuaternaria en la
protena como dmero.

3) Qu particularidades estructurales presenta el aminocido prolina?

Respuesta: la prolina es el nico aminocido cuyo amino unido al carbono alfa est formando parte de
un ciclo, por lo que al formarse la unin peptdica no puede formar puente de hidrgeno para estabilizar
una hlice u hoja beta. Por tal motivo la Pro tiende a romper este tipo de estructuras secundarias.
Asimismo, debido a los ngulos que puede adoptar la Pro, es relativamente comn encontrarla en los
giros de las protenas. Y por esto, dado que los giros estn expuestos al solvente, la Pro tiene un grado
de ocultamiento al solvente mucho menor de los esperado considerando su polaridad. Adems las
uniones X-Pro pueden adoptar la conformacin CIS con ms facilidad que los dems aminocidos.
Aproximadamente el 7 % de las uniones X-Pro son CIS, haciendo que aproximadamente un 43 % de
todas las protenas tengan una unin X-Pro en CIS. La isomerizacin CIS-TRANS de las uniones
peptdicas es muy lenta porque tienen una energa de activacin muy grande. Dado que durante la
sntesis de protenas el ribosoma sintetiza las uniones peptdicas en TRANS, aquellas protenas que en
su estructura nativa deban tener una unin X-Pro en CIS van a tener que isomerizar dicha unin para
que la protena se pueda plegar. Este evento de isomerizacin en muchos casos es el paso limitante de
 todo el proceso de plegado, y de hecho existen una variada familia de enzimas denominadas peptidil-
prolil CIS-TTRANS isomerasas encargadas de caelerar este proceso. La isomerizacin de una prolina
durante el camino de plegado in vitro de una protena muchas veces puede detectarse por la aparicin de
una fase lenta en la cinetica de plegado, la cual se corresponde a la isomerizacin de la unin X-Pro.

4) Por qu la mutacin de un residuo por glicina por lo comn disminuye la estabilidad de una protena?
Respuesta: dado que la glicina es el nico aminocido sin cadena lateral (posee un hidrgeno) tiene
menos restricciones para su ubicacin en el espacio por lo que tiene mayor grado de libertad. Esto hace
que tenga mucha mayor movilidad y, por lo tanto, tiende a desestabilizar la estructura secundaria y se
ubica mejor en los giros o estructuras aleatorias. Ver la explicacin en el problema 21.

5) Explique brevemente el origen del efecto hidrofbico.

Respuesta: uno puede pensar en una protena como una micela muy particular debido a los residuos
hidrofbicos y zonas hidrofbicas que expone al solvente acuoso del citoplasma celular. En este sentido
se comporta como una micela clsica de cidos grasos que obliga al solvente a adquirir una estructura
ordenada para tratar de mantenerla en solucin y, al aumentar la concentracin de las especies
hidrofbicas, stas tienden a agruparse entre s por razones termodinmicas dejando, por lo tanto, ms
libre al solvente que puede desordenarse mucho ms y, de este modo, aumentar la entropa del universo
en estudio. Las razones termodinmicas se vinculan a la entropa del agua. Cuando un compuesto no
polar est expuesto al solvente acuoso, las molculas de agua que estn en contacto con el mismo
forman una estructura muy ordenada similar al hielo denominada clatrato, de forma de maximizar el
nmero de puentes hidrgeno que formar entre s. Cuando las molculas no polares se agrupan
formando una nueva fase, la superficie no polar expuesta al solvente acuoso disminuye, esto permite
que las molculas de agua que estaban formando los clatratos ahora puedan ir al medio del solvente
acuoso. All tienen ms microestados accesibles (o sea que tienen mayor entropa). Entonces, la prdida
de entropa originada al agrupar las molculas no polares en una nueva fase se ve compensada por el
aumento de la entropa del agua que es liberada al disminuir la superficie no polar expuesta al agua. Este
efecto de disminuir la superficie no polar es el motivo por el cual los compuestos no polares son
hidrofbicos, los detergentes y fosfolpidos formas micelas y bicapas, y las protenas se pliegan.