3

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Di tahun 1903 Tswett menemukan teknik kromatografi. Teknik ini

bermanfaat sebagai cara untuk menguraikan suatu campuran. Dalam kromatografi,
komponen-komponen terdistribusi dalam dua fase. Salah satu fase adalah fase diam
dan yang lainnya bergerak (fase gerak). Fase gerak membawa zat terlarut melalui
media, hingga terpisah dari zat terlarut lainnya. Umumnya zat terlarut dibawa
melalui media pemisah oleh aliran suatu pelarut berbentuk cairan atau gas yang
disebut eluen. Fase diam dapat bertindak sebagai zat penyerap, seperti halnya
penyerap alumina yang diaktifkan, silica gel, dan resin penukar ion, atau dapat
bertindak melarutkan zat terlarut sehingga terjadi partisi antara fase diam dan fase
gerak. Transfer masa antara fase bergerak dan fase diam terjadi bila molekul-
molekul campuran terserap pada permukaan partikel-partikel atau terserap di dalam
pori-pori partikel atau terbagi ke dalam sejumlah cairan yang terikat pada
permukaan atau di dalam pori. Laju perpindahan suatu molekul zat terlarut tertentu
di dalam kolom atau lapisan tipis zat penyerap secara langsung berhubungan
dengan bagian molekul-molekul tersebut diantara fase bergerak dan fase diam.
Jika ada perbedaan penahanan secara selektif, maka masing-masing
komponen akan bergerak sepanjang kolom dengan laju yag tergantung pada
karakteristik masing-masing penyerapan. Jika pemisahan terjadi, masing-masing
komponen keluar dari kolom pada interval waktu yang berbeda, mengingat bahwa
proses keseluruhannya adalah fenomena migrasi secara diferensial yang dihasilkan
oleh tenaga pendorong tidak selektif berupa aliran fase bergerak (KHOPKAR,
1990).
Umumnya metode kromatografi seperti adsorpsi, partisi, dan penukar ion
adalah contoh-contoh dari kromatografi kolom. Kromatografi berdasarkan fase
geraknya dapat dibagi menjadi dua yaitu kromatografi cair dan kromatografi gas.
Kromatografi cair adalah teknik kromatografi yang digunakan untuk memisahkan
ion-ion atau molekul-molekul yang dilarutkan dalam suatu pelarut. Pemisahan
tersebut terjadi karena adanya perbedaan migrasi dari masing-masing komponen
campuran yang terpisah pada fase diam di bawah pengaruh fase gerak cairan dengan
tekanan tinggi.
 4

Dengan berkembangnya teknologi kromatografi cair terutama kemajuan

dalam kromatografi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sensitif
telah menyebabkan perubahan kolom cair menjadi suatu sistem pemisahan dengan
kecepatan dan efisiensi tinggi. Metode ini dikenal sebagai kromatografi cair kinerja
tinggi (KCKT) atau high performance liquid chromatography (HPLC).
Pada metode kromatografi cair ini digunakan kolom tabung gelas atau
stainless steel dengan bermacam diameter. Partikel dengan dimensi yang bervariasi
digunakan sebagai penunjang stasioner. Banyaknya cairan pada kolom jumlahnya
sedemikian rupa sehingga hanya cukup menghasilkan sedikit tekanan untuk
memelihara aliran fase gerak yang seragam. Secara keseluruhan pemisahan ini
memakan waktu lama. Berbagai usaha telah dilakukan untuk menambah laju aliran
tanpa mengubah tinggi piringan teoritis kolom. Kromatografi cair kinerja tinggi
berbeda dari kromatografi cair klasik. KCKT menggunakan kolom dengan
diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran partikel penunjang 50 m,
sedangkan laju aliran dapat ditingkatkan dengan menggunakan tekanan yang tinggi.
Bila dibandingkan terhadap kromatografi gas-cair, maka KCKT lebih
bermanfaat untuk isolasi zat tidak mudah menguap, demikian juga zat yang secara
termal tidak stabil. KCKT dengan prinsip kromatografi adsorpsi banyak digunakan
pada industri farmasi dan pestisida. Zat-zat dengan kepolaran berbeda, yaitu antara
sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan KCKT berdasarkan partisi cair-
cair (KHOPKAR, 1990).

Sistem Pemisahan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Menurut MULJA dan SUHARMAN (1995) sistem pompa kromatografi

cair kinerja tinggi sudah diprogram untuk dapat melakukan pemisahan dengan satu
atau lebih macam pelarut. Dikenal dua sistem pompa pada kromatografi cair
kinerja tinggi, yaitu :

1. Sistem Isokratik
Sistem isokratik merupakan teknik pemisahan dengan komposisi fase gerak
tidak berubah selama proses berlangsung. Hal ini berarti polaritas fase gerak tetap,
 5

sehingga untuk pemisahan contoh yang mengandung komponen-komponen dengan

polaritas bervariasi akan memberikan hasil yang kurang memuaskan.
2. Sistem Gradien
Sistem gradien merupakan teknik pemisahan dengan komposisi fasa gerak
berubah sacara periodik selama analisis berlangsung. Hal ini berarti selama
analisis, polaritas fase gerak bervariasi (berubah-ubah). Sistem ini digunakan untuk
pemisahan contoh yang mengandung komponen-komponen dengan polaritas
beragam, sehingga menghasilkan pemisahan yang baik.

Instrumentasi Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Pada dasarnya kromatografi cair kinerja tinggi terdiri dari sistem

penampung fase gerak dan sistem penanganan pelarut, sistem pemompaan, sistem
injeksi, kolom, dan detektor (SKOOG et al., 1998). Gambar 3 menunjukkan
instrumentasi dari KCKT.
 6

Gambar 3. Instrumentasi KCKT (SKOOG et al., 1998).

Fase Gerak dan Tempat Pelarut

Pada KCKT, komposisi fase gerak merupakan salah satu variabel yang
mempengaruhi pemisahan. Fase gerak akan membawa serta komponen-komponen
melewati kolom, selain itu fase gerak akan berinteraksi dengan fase diam.
Kekuatan dari masing-masing interaksi tadi akan mempengaruhi resolusi
pemisahan kromatografi. Fase gerak yang digunakan untuk KCKT mempunyai
beberapa persyaratan, diantaranya murni tanpa cemaran, tidak bereaksi dengan
kolom, dapat melarutkan contoh, tidak mempunyai serapan dan tidak
mempengaruhi serapan zat standar, viskositas rendah dan kevolatilannya kecil, dan
sesuai dengan detektor (JOHNSON & STEVENSON, 1991).

Sistem Pemompaan
Pompa di dalam KCKT digunakan untuk memompa larutan dari tempat
penyimpanan larutan ke dalam kolom agar didapat aliran fase gerak yang konstan.
Suatu pompa harus mengalirkan larutan ke seluruh sistem dengan kecepatan alir
yang tetap karena hal inilah yang akan memberikan jaminan adanya keberulangan
yang baik.
Persyaratan dari suatu pompa KCKT antara lain pompa terbuat dari bahan
yang tahan terhadap fase gerak yang digunakan, misalnya terbuat dari bahan tahan
korosi seperti stainless steel atau teflon, dapat memberikan tekanan sampai 6000
psi, tidak memberikan pulsa atau dilengkapi dengan penghilang pulsa, kecepatan
alir antara 0,1-10 mL/menit, pengulangan pengaturan kecepatan aliran tidak
berbeda lebih dari 0,5 % (SKOOG et al., 1998).

Sistem Injeksi
Sistem injeksi merupakan sistem dari salah satu bagian dari peralatan
KCKT yang menentukan banyaknya zat yang dimasukkan ke KCKT melalui
 7

injektor. Salah satu cara yang paling sederhana untuk memasukkan contoh ke
dalam sistem KCKT adalah dengan syringe seperti kromatografi gas. Contoh harus
dimasukkan ke dalam pangkal kolom dan diusahakan agar sedikit mungkin terjadi
gangguan pada kemasan kolom (JOHNSON & STEVENSON, 1991).

Kolom
Kolom adalah suatu bagian dari KCKT yang umumnya terbuat dari stainless
steel atau kaca tebal yang dilapisi oleh tabung baja. Kolom merupakan jantung dari
keseluruhan peralatan kromatografi. Keberhasilan atau kegagalan analisis
bergantung pada pemilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat, karena pada kolom
terjadi proses pemisahan komponen, oleh karena itu kolom yang digunakan
haruslah sesuai dengan sifat komponen yang akan dipisahkan. Pemisahan dapat
terjadi karena fase diam yang terdapat di dalam kolom dapat berinteraksi dengan
berbagai komponen, kekuatannya berbeda satu dengan yang lainnya, sehingga
masing-masing komponen akan keluar dari kolom dengan waktu retensi yang
berbeda. Menurut MULJA dan SUHARMAN (1995) dilihat dari jenis fase diam
dan fase geraknya, kolom KCKT dibedakan atas :

1. Kolom fase normal

Teknik pemisahan dilakukan dengan menggunakan fase diam
berupa senyawa polar, misalnya silika dan fase gerak yang kurang polar
seperti n-heksana, kloroform, dan dietileter. Dalam hal ini didominasi oleh
interaksi fase diam yang polar dengan bagian polar dari molekul sehingga
senyawa polar akan lebih lama tertahan dalam fase diam, sedangkan
senyawa kurang polar akan terelusi lebih awal.
2. Kolom fase terbalik
Kolom ini mempunyai sifat kebalikan dari kolom fase normal. Fase
gerak yang digunakan bersifat polar, seperti metanol, asetonitril, dan air.
Kolom jenis ini sering digunakan untuk pemisahan senyawa-senyawa
dengan polaritas bervariasi melalui teknik elusi gradien.
 8

Kolom KCKT umumnya terbuat dari pipa baja nirkarat namun ada juga
yang terbuat dari pipa kaca berdinding tebal. Kolom kaca memiliki kemampuan
tekanan maksimum 600 psi. Kolom biasanya dipakai pada suhu kamar, tetapi dapat
juga dipakai pada suhu yang lebih tinggi dengan menggunakan suatu pemanas
kolom (SKOOG et al., 1998).

Detektor
Detektor merupakan alat untuk mendeteksi adanya contoh pada kolom dan
mengukur jumlahnya dalam bentuk sinyal listrik yang dapat dicatat oleh recorder
(alat pencatat). Detektor yang ideal harus peka, tidak terpengaruh dengan adanya
perubahan suhu atau komposisi fase gerak, dan dapat mendeteksi berbagai senyawa
walaupun dalam jumlah kecil (JOHNSON & STEVENSON, 1991).
Jenis-jenis detektor antara lain ; detektor fotometer, detektor elektrokimia,
detektor refraktometer, detektor fluoresensi, dan detektor indeks refraksi.

1. Detektor fotometer
a. Detektor ultraviolet, digunakan untuk senyawa yang menyerap sinar
ultraviolet dan merupakan detektor utama kromatografi cair kinerja
tinggi. Detektor UV dapat digunakan untuk sistem isokratik maupun
gradien.
b. Detektor visibel, digunakan untuk senyawa yang menyerap cahaya
tampak. Detektor ini dapat digunakan untuk sistem isokratik maupun
gradien.
c. Detektor inframerah, digunakan untuk mendeteksi gugus fungsional
yang ada pada contoh.
2. Detektor elektrokimia
Digunakan untuk mendeteksi senyawa yang dapat mengalami reaksi
oksidasi dan reduksi.
3. Detektor fluoresensi
Detektor jenis ini disebut juga detektor fluorometer yang hanya dapat
mendeteksi komponen-komponen yang dapat berfluoresensi dan hanya
 9

komponen tertentu yang memberikan respon terhadap detektor ini.

Kepekaan yang dihasilkan oleh detektor fluoresensi ini cukup tinggi.
4. Detektor indeks refraksi
Detektor ini dapat mendeteksi senyawaan karbohidrat. Detektor ini dipakai
pada analisis kuantitatif dan kualitatif terhadap macam-macam karbohidrat.
Biasanya dipakai untuk analisis konsentrasi gula (SKOOG et al., 1998).

Pencatat (recorder)
Pencatat pada KCKT berfungsi untuk mencatat atau merekam hasil
pemisahan yang sedang berlangsung di dalam kolom. Pada umunya sinyal yang
berasal dari detektor diperkuat terlebih dahulu sebelum disampaikan pada alat
perekam otomatis yang sesuai. Dapat pula sinyal dikirimkan pada suatu integrator
digital elektronik untuk mengatur luas pik kromatogram secara otomatis (DEPKES
RI, 1995).

JOHNSON, E. L. dan R. STEVENSON. 1991. Dasar Kromatografi Cair.

Diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata. Penerbit ITB. Bandung.

KHOPKAR, S. M. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Diterjemahkan oleh A.

Saptorahardjo. Universitas Indonesia Press. Jakarta.

MULJA, M. dan SUHARMAN. 1997. Analisis Instrumental. Airlangga

University Press. Surabaya.

SKOOG, D. A., F. J. HOLLER dan T. A. NIEMAN. 1998. Principles of

Instrumental Anaysis. Fifth Edition. Harcourt Brace & Company. Florida.
50