1.

Cuando se analiza un DNA plasmdico, no tratado con enzimas de

restriccin, mediante electroforesis en gel de agarosa, se visualiza en el gel ms
de una banda. Explicar por qu.

A pesar de no estar cortado por una enzima de restriccin, un plsmido (por ser
un DNA circular) existe en la clula en distintas conformaciones denominadas
topoismeros, que difieren en su grado de superenrollamiento. Esto puede
deberse a que una de las dos hebras se haya roto (accidentalmente en la clula
o durante la manipulacin experimental del plsmido), con lo que se pierde
superenrollamiento. Tambin puede deberse a la accin de las topoisomerasas,
enzimas que existen normalmente en la clula y catalizan el cambio en el grado
de superenrollamiento. La forma con superenrollamiento cero se llama
relajada. Debido a su diferente tamao (volumen), estos topoismeros avanzan
con distinta velocidad en el gel de electroforesis (a pesar de que todos tienen la
misma longitud en pb). Tpicamente se observan una banda que avanza menos, debida a la forma relajada, ms voluminosa, y
una o ms bandas, ms rpidas, de la(s) forma(s) ms o menos superenrollada(s). A mayor grado de superenrollamiento, ms
compacta es la molcula del plsmido y ms avanza en el gel (banda ms abajo).

2. Antonio y Luis purificaron un plsmido partiendo de un mismo cultivo de bacterias E. coli. Posteriormente, el
plsmido purificado se trat, por separado, con dos enzimas de restriccin. La figura muestra el resultado obtenido
al analizar algunas de esas muestras (1 a 4) mediante electroforesis en gel de agarosa.

1) Identificar a qu corresponde cada banda (a,b,...f). Por qu son diferentes los resultados de Antonio y Luis, si su
plsmido debe ser el mismo?

2) Dibujar el resultado que se debe obtener en las calles 5 y 6 (muestras de Luis tras la digestin).

3) Cuntas secuencias diana tiene el plsmido para las enzimas BglII y PvuII?

(1) a es el plsmido relajado; b es el plsmido superenrollado; c y d son 2 fragmentos

lineales generados por 2 cortes con BglII; e es el plsmido entero pero abierto, lineal,
generado por 1 corte con PvuI; tiene, por tanto, la longitud (pb) total del plsmido.
(3) Por tanto, el plsmido tiene 2 dianas para BglII y 1 diana para PvuI.
Puesto que f est en la misma posicin que e, la interpretacin ms simple es que el
plsmido de Luis se ha roto, se ha abierto el crculo y es una molcula lineal. Esto puede
deberse a la manipulacin durante la purificacin.
(2) El plsmido abierto de Luis, al digerirlo con las mismas enzimas dar un fragmento
ms en cada caso (ver figura) Las 3 bandas de la calle 5 y las 2 de la calle 6 deben estar
ms abajo que la f; adems, una de la calle 5 debe coincidir con una de las de la calle 2 (puedes decir por qu?).

Al usar diferentes enzimas de restriccin, se generan diferentes segmentos.

Por ejemplo, si la secuencia reconocida por la enzima Sall aparece en la
molcula del ejemplo una vez, cortara el segmento en dos partes. Si la
secuencia reconocida por EcoRI, aparece dos veces, generara tres pedazos.
Al usar las dos enzimas simultneamente, se produciran cuatro segmentos.