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47 Mutacin

I~Investigacin

T T Y D R O X Y L A M I N E como agente mutgeno N E U R O S P O R UNA CRA N S


A

H. V. M A L L I N G
Biolog3' Divisin, Oak Ridge National Laboralor), Roble l?idge, Tenn. ( U . S . d . )
(Recibido j u n e 2ist, I000)

Resumen

La mutagenicidad de hidroxilamina (HA) ha sido probado en 8 diferentes adenina-requerir


mutantes (AD-3B) de Neuro@ora crassa: 4 mutantes de este probador establecer volver despus del
tratamiento con cido nitroso y etil methanesulfonate indicando que volver por un par de bases,
sustitucin 2 mutantes revertir slo despus del tratamiento con FIC-17o indicando que volver por
un par de bases de insercin o eliminacin, y 2 mutantes revertir slo espontneamente. HA inducido
el retorno en 3 de los 4 mutantes que revertir por sustitucin de pares de bases y en ninguno de los
otros. La especificidad de la accin de ha en los mutantes en el presente conjunto de probador es
consistente con la hiptesis de que la clase predominante de alteraciones genticas inducidas por
hectrea en Neuro@ora es transiciones de pares de bases de guanina-citosina adenina a timina.
Furthernlore, se constat que la reversin frecuencia despus de hectreas del tratamiento aumenta
en proporcin al cuadrado de la duracin del tratamiento.

UCTION INTROI)

HA induce substituciones de pares de base en fago y el tipo de la gentico altera-ciones es


preferente de GC a AT. La reaccin qumica entre HA y ADN ha sido analizada por Freese et al.
8 hectreas que encontr que slo reacciona con citosina y HMC. Tratamiento de ARN con HA altera
tanto el uracilo y citosina; a pH 6.1 La reaccin es mucho ms rpida con una citosina que con el
uracilo, mientras que a pH ms altos es la relacin reversedlL ha sido demostrado inducir daos
chromosonml en clulas de mamferos 1", pero ningn intento anterior ha tenido xito en la
identificacin de la alteracin gentica(s) inducida por hectrea en eucariotas en el nivel molecular.
Las Caract. de terization-ha-mutaciones inducidas en Neurospora es particularmente importante
porque m a y ser tan especfica en clulas eucariotas como en fago en producir mutaciones por
substituciones de pares de base resultante de GC en las transiciones. Tal especificidad hara hectreas
especialmente adecuado para la caracterizacin de las alteraciones genticas inducidas por

Abbrevi~ciones: AT, adenina timina . I,;MS, ethvl mcthanesulfonatc . GC, guanina citosina. Ja, la hidroxilamina . HMC,
hy~troxymethylcytos{ne. Fic-f7s, m e t h o x y 6-cloro - (3 - 0 - 2 - chlorethyl etlico] - aminopropylamino)acridina
dihidrocloruro. NA, cido nitroso. SP, s p o n t a n e o s frecuencia de reversin de la u e n t r a t e d serie.

~Iulalion Las., 3 (I966) 47 476


Mutagnesis qumica en N . c r a n s a 471

Menos mutgenos especficos a nivel molecular b y los medios de pruebas para determinadas
revertibility. Las pruebas para la induccin de retorno en m u t a n t e s resultante de gentica
conocida altera-ciones es un mtodo mucho ms sencillo para caracterizar los efectos genticos
de mutgenos que una mutacin conocida y avance - tcnica en Neurospora 6,19. La
caracterizacin es limitada b y la matriz de alteraciones genticas en cada m u t a n t e integrado
por un probador. Sin embargo, b y seleccionar m u t a n t e s volver b y alteraciones genticas
ms comunes, es posible obtener una primera aproximacin del espectro de alteraciones
genticas producidas b y un mutgeno .

En este documento, un comprobador de AD-3B m u t a n t e s consta de 4 m u t a n t e


s que revertir slo b y sustitucin de pares de bases, 2 m u t a n t e s que revertir slo b y base-
par la insercin o eliminacin, y 2 m u t a n t e s que revertir slo espontneamente cada uno
fueron tratados con H A y luego evaluadas para detectar el retorno a un tipo salvaje. Los
resultados de estas pruebas muestran claramente en Neurospora tha t h produce una
reversin slo en aquellas cepas que revertir b y sustitucin de pares de bases. La especificidad
de la accin de H A de la m u t a n t e s en el presente conjunto de probador es consistente con
la hiptesis de que la clase predominante de alteracin gentica inducida b y H en Neurospora
un par de bases es la transicin de la GC.

Materiales y Mtodos

(A) cepas
El m u t a n t e s con el prefijo 2-17 fueron inducidos b y cido nitroso
en Neurospora cepa wild-type 74 A (DE SERRES, BROCKMAN, Barnett y KOLMARK, en prepa-
cin). Mutante n 5-4-1 es de origen espontneo (BROCKMAN, indito). La mu - tant s han
sido aislados b y el mtodo directo 3.

(B) Preparacin de la cultura


En todos los experimentos los efectos mutagnicos tratamiento t se llev a cabo en las
suspensiones de conidias cosechadas a partir de la i25 - ml Matraces Erlenmeyer que contiene
20 ml de glicerol com-pletar 10 mediano (IO m! El glicerol por litro en vez de 20 m l ) + un d
e i n e sulfato (25 rag/l). Los frascos fueron inoculadas se incubaron durante me da y en 3O y
luego de 6 - 9 das un t 25 . Los conidios fueron cosechadas b y primera agitando las culturas
con perlas de vidrio (4 m m de dimetro) a brea k hasta las cadenas de conidios; luego fueron
suspendidas en solucin salina (o.9~s), filtrada a travs de un tamiz de platino, lavadas dos
veces b y centrifugacin, y luego resuspendido en solucin salina. Ad-3 m u t a n t e s difieren
entre s en relacin con el desarrollo del pigmento morado en el micelio y conidios cuando se
cultiva en glicerol completa, bu t b y la adicin de 250 mg por litro de sulfato de adenina
pigmento morado acumulacin es esencialmente eliminado. La densidad de la suspensin
conidial se midieron en un colormetro (Spectronic 20, Bausch & Lomb, Rochester, Nueva
York) en el pico de absorcin de 750 m#.

(C) Los tratamientos


Todos los tratamientos fueron realizados con suspensin conidial ( ~ 2 IoT/ml) en
matraces Erlenmeyer en un r o t a r y agitador en waterbat h a 25 para mantener las conidias
en sus-pensin durante el tratamiento . 5 min antes de saciar los conidios fueron centrifugadas
y el supernatan t se decanta. En el momento de enfriamiento despus de t r e t a m i e n t o con
NA, EMS, o FIC-I7O, los conidios fueron resuspendido en una solucin salina de papas fritas'
1 mnimo ajustado a p H 8 con NaOH . Este procedimiento se repite dos veces.
Res. de mutacin, 3 (1966) 470-476
472 Tt . V. MAIA . Ing

E l sal t s o l u c i o n e s de papas fritas' m i n i m a l a d j u s t e d a p H ha sido f o u n d a s t o p t


h e reac - t i o n b e t e s e n las celdas a n d a l k y l a t i n g c o m p o u n d s a n d a i n m e d i a t e
l e s (MALLI~'C., ONU - publicado) .

(D) N Trealmenls
T h e c o n i d i a fueron de s u s p e n d e d a 0,05 m o d i s u m a c e t a t e intermedias en p h 4-
5. Uno v o l u m e de freshl y p r e p a r e d o.o2 m o d i s m u n i t r a t e sol n fue un d a d e d a 3 v o l u
m e s de conidias . Final t e c o n c e n t r a t i o n fue de 0.oo 5 M NaNO,,, a n d e l t r a t e m e n t fue q u
e n c h e d a d e s c r i b e d a b a s e a 4V o mi n a f e r t a e s t a r t t h e t r e t a m i e n t o .

(E) E M S TreaOnent
C o n i d i a fueron de s u s p e n d e d
T h e en un 0.067 M P h o s p h a t e a t buffer p H 7.0. E l
Tretamen Un d a d i n g e n s u g B r i n g t h final e c o n c e n t r a t i o n e s u p
t Fue s t a r t e d B y h EMS A a
La lluvia
O . I M ; t h e T r e t a m e n t Fue Q u e n c h e d 30o ms tarde .

(F) el ICR - z7o tratamiento


NUmbe
I C I - I 7 o Es el cdigo e r Assigne d a m e t h o x y 4 ) - c h l o r - 9 - ( 3 - [ e t h y l - 2 -
CREECH un n
C h l o r e s t h l i l - a m i n o d e p r o p y l a m i n o ) un c r i d i n e d i h y d r o c h l o r i d e b s . ,J. d Co-
Institute El Investigacin , P h i l a d e l p h i a . E
W o r k e r s t t h e para cncer l Conidi fueron Sus-
P e n d e d en una o.o67 M P h o s p h a t e a t buffer p H 7.o. E l t r a t e m e n t e s t a r t e d b y d d i n g
I Vol. de freshl y p r e p a r e d o s o l u c i o n e s de ICR - I7 O (25 rag/1 H20) a 49 vols. de t h e
c o n i d i a suspensio n cuyo h gav final e c o n c e n t r a t i o n e s de lO . 58/~M . E l t r a t e m e n
t fue q u e n c h e d a d e s c r i b e d a b o v e 13s una lluvia f t e r s t a r t a d e t r e t a m i e n t o .
El t r e t a m e n t a n d o t h e r m a n i p u l a c i o n e s i n v o l v i n g ICR - I7 o un n d c o n i d i a
fueron p e r f o r m e d u n d e r r e d l i g h t e a l i m e n t e d e p h o t o d o s n a m i c a efectos s s
o c i a t e d ingenio h e l a c r I d i n e ringVa, ~a. P l a t e s tambin se i n c u b a t e d a d e s a r k
durante al menos 24 h para permitir suficiente t i m e d e c o n i d i a de la GIV e lugar a s m a l l
colonias.

(G) H UN Treatmenl
Antes t h e h a t r e t a m e n t , t h e c o n i d i a fueron de s u s p e n d e d a 3 M de NaCl a n d t h
e n f u r t h e r d i l u t e d 5 t i m e s t h e h a r e a c c i o n e s m i x t u r e de Strack, FREESE Y FREESE 17, g
i v i n g una ltima H A c o n c e n t r a t i s N de i m . 5 mi n antes del t h e t r e a t m e n t fue saciada , t
h e c o n i d i a c fueron e n t r i f u g e d a n d a d e c a n t e d a n d a t h e q u e n c h i n g t i m e (es
decir, 3oo lluvia un f t e r t h e s t a r t t h e t r e a t m e n t ) t h e c o n i d i a se r e s U s p e n d e d a 3 M
de NaCl. Thi s w a s h i n g p r o c e d u r e se r e p e a t e d dos veces a n d t h e n t e c o n i d i a fueron de
s u s p e n d e d a t e s t h sal o l u c i o n e s de f r i e s ' m i n i m a l m e d i u m t a d j u s t e d a p H 8.

(H) medio chapado


A e s t i m a t e t h e v i a b i l i t y t h e t r e t e d a n d u e n t r a t e d conidias, t h e y fueron
p l a t e d En WESTERC.AARO m i n i m a l TM s u p p l e m e n t e d h sorbose wit (15 g/l), glucosa
(0. 5 g/l), fructos e (0,5 g/l), c a s a m i n o d aci (200 rag/l), v i t a m i n a sol n como en g l y c e r o
l - c o m p l e t i ml/1), a n d a d e i n e sulfat e (25 rag/l) .
A e s t i m a t e d e n u m b e r r e v e r t a n t e s t h e conidi fueron p l a t e d en t h e sam sub
- e s t r a t e utilizar d para scorin g s u r v i v e r s b u t s u p p l e m e n t e d h wit 0.2 rag/1 a d e i n
e sulfat e in-s t e a d de 25 rag/1 a d e i n e sulfate .
En t h e p l a t e s a d e t e r m i n e s u r v i v a l t h e d e n s i s t a d e c o n i d i a fue de 5 IO c o n i d i
a pe r ml s u b s t r a t e en un t o t a l v o l u m e de a b o u t IOO ml. Puntuacin de f o r r e v e r t a n t e s a f t e
r

3/Iutation Res., 3 (I966) 47 476


Mutagnesis qumica en N. crassa 473

NA, EMS, o FIC-I7O tratamiento, los conidios fueron sembradas a una densidad de OIE conidios
por ml y 2 10 5 conidios por ml, cada enfermo un volumen total de IOO ml. Para la calificacin de
la revertants despus del tratamiento ha, la densidad de las conidias fue 2 5 baja por ml en un
volumen total de 500 ml.

(I) la prueba estadstica


La prueba de significacin se realiza segn BIRNBAUM (vase ref. 2, pg. 261). El nmero
de revertants es considerado como teniendo una distribucin de Poisson. La probabilidad se calcula
suponiendo que los siguientes dos ratios pertenecen a la misma poblacin-specto :

Poblacin total (sobrevivir despus del tratamiento)


(I)
Poblacin total (sin tratar)+poblacin total (sobrevivir despus del tratamiento)
Nmero total de revertants en la poblacin tratada
Nmero total de revertants en el tratamiento p o p u l a c i o n e s + t o t a l nmero de (2)
En la poblacin tratada revertants

Una probabilidad inferior al 5% indica una diferencia significativa entre el nmero de


retorno en el control y la serie tratada.

Resultados y Discusin

Supresores (a)
Identificacin de las alteraciones genticas en mutantes individuales determinando la
especificidad en la induccin de retorno despus del tratamiento con diferentes agentes estar
distorsionada por la ocurrencia de mutaciones supresor junto con reversa muta- ciones. A partir del
20 de diferentes Revertants mutantes inducidas en los loci ad-3 (refs. 5, I I , y Barnett, inditos) han
sido analizados para la ocurrencia de supresores extragnica, y ninguno fue encontrado. Nosotros m
a y, por lo tanto, asumir que los supresores de que ocurran fuera de la ad-3A o AD-3B locus son
raros o que no se produzcan.

La influencia de los supresores de la identificacin de las alteraciones genticas en cada ad-


3 mutantes se discute en otro documento (MALLING Y DE SERRES,en preparacin, 1966 ).
Adems un anlisis detallado de inducido el retorno de mutantes ad-3B est siendo realizado para
proporcionar informacin adicional sobre este punto. Sin embargo, desde la revertants de los
mutantes en el probador actual aparecen pronto y se encuentran en la parte principal de no acumular
los pigmentos prpura suele hacerse por ad-3 mutantes, parece probable que la frecuencia de
supresores extragnica en el presente anlisis es baja.

(B) La alteracin gentica inducida por ha.


La mutagenicidad de ha sido estudiado por determinar si hay alguna especificidad en su
actividad de accin para inducir el retorno con un comprobador set de 8 mutantes (Tabla I). Sobre
la base de los datos actuales, 4 de estas cepas parecen revertir slo por sustituciones de pares de
bases (reversible por NA y EMS), 2 cepas parecen volver por un par de bases de insercin y/o
supresin (slo reversible por ICR-I7O), y 2 cepas revertir slo espontneamente.

Fic-ito es una acridina monofunctional gas mostaza; adelante mutaciones inducidas por ICR-
I7O en Neurospora crassa parecen ser principalmente a base de inserciones o eliminaciones de
par 4. Por lo tanto, es probable suponer que los mutantes que vuelve despus del tratamiento con
ICR-
Res. de mutacin, 3 (I966) 470-476
474 H . V . MALLING

T A B L E Yo
T H E S U R V I V A LP E R C E N T A G EA N D T H E R E V E R S I O N E S FREQUENCIES OF THE TESTE
R SET AFTER TRI~T-

El MENT CON I C I - I 7 0
, NA,EMSyH
El porcentaje de
Mutant supervivencia Retorno por ~ o s supervivientes
N H
No. UN E M S1CR - I7O H UN SP N UN E M SICR-zTO UN

2 - 17 - 8 75 77 86 54 Yo Oa Oh 5 Oh
2 - 7 - 2 de 3 8o 95 61 62 O. 3 Oh Oh Oh Oh
5-4-1 88 77 68 5 0.2 Oh 5 1938 Oh
2 - 17 - 7 5 69 7 90 4 Oh 5 749 Oh
2 - 17 - 61 8o 68 62 60 5 183 198 Oh 45
2 - 17 - 155 93 99 72 62 Yo 79 377 8 20
21-7-1-8 61 71 61 64 3 182 IO 91 Oh
2-1-7126 82 95 9 68 4 136 77 146 8

Un Omentasthereversionesfrequencynotsignificantelydifferentfromt hespont
a n e o s m u t a c i o n e s f r e q u e n c y t t h e 5 % c o n f i d e n c level .

17s y no despus de tratamiento con NA y EMS, que predominantemente induce substituciones de


pares de base, volver por un par de bases de insercin o eliminacin. Sin embargo, se encontr (Tabla
I) que los mutantes que revertir por sustituciones de pares de bases (2-17-155 , 2-17-18 , 2-17-126 )
tambin vuelven despus del tratamiento con FIC-I7O. Esto puede ser explicado por el hecho de que
ICI-I7O es un monofunctional mostaza y por lo tanto capaces de alquilatos, y el resultado de una
alquilacin en el ADN es generalmente un par de bases de sustitucin.
La reversin de frecuencias despus ha tratamiento son bajos en comparacin con la rever-
sion frecuencias tras tratamiento con NA y EMS en frecuencias de supervivencia comparables.
Cepa 2-17-155 ha sido tratada con hectreas a pH 6,2 durante diversos perodos de tiempo. Una
expresin directa para mostrar que ha tiene un efecto mutagnico en Neurospora puede ser ob-
mantenido por el clculo de la ratio (M/m) donde (M) = el nmero de retorno por
IO~ conidias despus del tratamiento y HA (M0) = el nmero de retorno espontneo por lO s
conidios. En la Fig. I puede verse que hemos obtenido 8 veces como muchos mutantes en el AP -
serie tratada como en el control. Por lo tanto, podemos concluir que se ha.

100 -

80 -
Yo 60 - ~ o

~ 40-
\
>

N~

~ 20 -

-----R
~ 10 ~
0 2 4 6
Horas de tratamiento Horas de tratamiento
Pliegue de t h
Fig . I. T h e I n c r e a s e en eN U m b e r r e v e r s i o n e s ( M ) R e s c o d A f t e r H a t e a r t m e n t o v e r t h e
NUmbe Mutacion
r De S p o n t a n e o s e s (Mo) P l o t e d A G a i n s t T h e T i m e de H UN T r e t a m i e n t o .
Fig . 2. T h e S u r v i v a l p e r c e n t a g e P l o t e d A G a i n s t T h e t i m e De H A t r e t a m i e n t o .
Res. de mutacin, 3 (1966) 470476
En la Mutagnesis qumica ]~ . C r a n s a 475

Mutgeno en Neurospora. La supervivencia no fue inferior al 42%, incluso para el ms largo


tratamiento t (Fig. 2). Se encontr t i t a tha induce el retorno en 3 de las 4 cepas que revertir b
y sustituciones de pares de bases (Tabla I). El fracaso de algunas base - Sustitucin de par m u
t a n t e s para volver con una H puede justificarse si suponemos t h t induce predominantemente
las transiciones de GC - T en Neurospora como lo hace en fago. Si t h t es el caso, entonces
deberamos esperar que ciertos pares de bases sustitucin m u t a n t e s existentes que no
pueden ser revertidos b y HA.

(C) La cintica de induccin de retorno


- El ha inducido la reversin de frecuencias no son proporcionales al tiempo de Neuros-
pora pero sigue una cintica de segundo orden (Fig. 3). Sin embargo, ha inducido - avance y
retroceso n mutatio en fago siga una cintica de primer orden 8,9. Esta incongruencia podra ser el
resultado de varios mecanismos: ( z ) que una reversin en Neurospora inducida debe expresar

60-
/

50-

Oh

40-
0").

M 30-
_O 20-
/
]0-

15 35 4~ ~"
Tratamiento HOURSOF SQUAREOF(t)

Fig . 3. K i n e t i c a s t h e i n d u c c i o n e s t a r e v e r s i o n e s b y H a i n t h e b a s e - p i r s u b s t i t u c i o n e s m u t a
n t 2- x 7-15.5. T h e f r e q u e n c y t h e r e v e r s i o n e s p e r lO 8 s u r v i v e r s t p l o t e d a g a i n s t t h e s p u r e t h e t
imehatretamiento.

En un conidium, que tiene un promedio de 2 ncleos, y la expresin depende de la inactivacin


de uno de los 2 ncleos, (2) tha t h un tratamiento t promover una mayor velocidad de
penetracin de H A en la clula, o ms probablemente (3) tha t la reaccin de H con una
citosina ocurre en dos pasos (para revisin, ver SCHUSTER Y WITTMAN15) y t h t la
velocidad de reaccin de los 2 pasos estn ms cerca de la igualdad en Neurospora que en
fago.
La velocidad de reaccin de la citosina con H UN depende de p h ; aumentar p h da una
disminucin de las tasas de reaccin 14. Experimentos para investigar la relacin entre el
mecanismo de H A mutagnesis en Neurospora y virus B y estudiar el efecto de la mutatio p
h a n ahora las tarifas estn en progreso.

(D) hacia adelante mutaciones inducidas por ha.


Los experimentos se han llevado a cabo para obtener informacin ms detallada sobre
los efectos genticos de una H en Neurospora b y t de un tratamiento equilibrado dikaryon
marcados genticamente 7. La frecuencia de mutacin - Avance despus del 6-h tratamiento t
bajo la con-
M u t a c i o n e s Res., 3 (1966) 4 7
0-476
476 N . v . MALLING

D i c i o n e s d e s c r i b e d h e r e g v e 600 m u t a n t e s P e r io ~ s u r v i v i n g e n c i d i a . M u t a c i o n e s s o b
tened
En t h i s t e s t S y s t e m Renow En t h e P r o c e s s a b
einganalyzedwith Regard Togentospe
(nica o r m u l t i c u l o s m u t a c i o n e s ) , Allica c o m p l e m e n t a c i n
(Percentagecomplement -
I n g M u t a n t e s Como Bien Como T h e Types Complementac
i n P a r t e n s ) , una especfica n d r e v e r t i -
Bility After Tretament With NA, EMS, ICI-I7o O
Other A g e n t o s A n d Se b e Reported
Elsewhere.

Acuse de recibo

I W h i s t o c k n o w e l d e g r a t e f u l l y D R . F. J. DE SERRES' v a l u a b l e s u g e s t i o n e s s a n d
c o o p e r a c i o n e s , t h e a i d a d r . MARVIN I{ASTENBAUM en t h e s t a d s t i c a l a n a l s i s , a n d
DR. H .J . CREECH un n d C o -w o r k e r s t h e Institute Forcancer
research,Philadelphia,
F o r t h e r i g i f t De ICI-I7o. This Researchwas
Sponsoredijontlyby The National Insti-
Tutes De h e a l t h A n d B y t h e U . S . Atomic Energy Comisi
onesunder Contract With The

Uniones C a r b i d e Corporaciones.

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