UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

FACULTAD DE CIENCIA BIOLOGICAS

GUIA DE PRCTICA

CURSO BIOLOGA MOLECULAR

Profesores: Elena Arbaiza P.

Fanny Lazo M.
Edith Rodrguez Q.
Gustavo Sandoval P.
Giovanna Sotil C.
Dan Vivas R.
Armando Yarlequ Ch.

Lima Per
2017
 Pr ctics de Biolog Moleculr Semestre 2017-II

INDICE

PRACTICAS:
1. EXTRACCIN DE ADN
2. CARACTERIZACIN DEL ADN
3. ANLISIS BIOINFORMATICO DE SECUENCIAS
NUCLEOTIDICAS
4. ANLISIS BIOINFORMATICO: SECUENCIAS PEPTIDICAS
5. ANLISIS ELECTROFORETICO DE ADN
6. ANLISIS DE ADN POR PCR
7. DETERMINACIN DE PROTENAS
8. CROMATOGRAFIA DE FILTRACIN
9. CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO INICO
10. ANLISIS ELECTROFORETICO DE PROTENAS
11. SEMINARIO : Mecanismo de Reparacin del ADN
12. SEMINARIO : Caractersticas Moleculares de los Virus
13. SEMINARIO :Bases Moleculares del Cncer y de la Apoptosis
 Pr ctics de Biolog Moleculr Semestre 2017-II

PRACTICA N 1

EXTRACCION DE ADN
1. MARCO TERICO

Las caractersticas fisiolgicas y bioqumicas de todo ser vivo estn contenidas en sus respectivos
genomas. Los genomas de bacterias, hongos, plantas, animales y algunos virus estn compuestos por
molculas de cido desoxirribonucleico: ADN, es una estructura qumica cuyas unidades
monomericas los nucletidos se organizan de manera lineal generndose secuencias de informacin.
Las molculas de ADN son generalmente enormes. Los PM de muchos ADNs se conocen. Un
milln de PM corresponde aproximadamente a 1.5 kb.

La forma extremadamente alargada del dplex de ADN junto a su rigidez lo hace muy susceptible
del dao mecnico fuera de proteccin de la clula, las fuerzas hidrodinmicas que se generan por
manipulaciones como la agitacin y pipeteo rompen el ADN en pedazos relativamente pequeos, por
lo que el aislamiento de una molcula intacta de ADN requiere una manipulacin cuidadosa.
Es conveniente entonces emplear mtodos que permitan en una primera etapa, la separacin de los
numerosos componentes celulares y luego aislarlo de las protenas que principalmente en clulas
eucariticas son sus acompaantes.

Con tal motivo, el mtodo de extraccin de DNA que utiliza cloroformo:alcohol isoamlico es
el ms practico e idneo pues no solo permitir mantener la estructura de esta macromolcula sino
que su obtencin ser observable mediante la aparicin de fibras tpicas al adicionarse etanol.
Teniendo en cuenta la practicidad del mtodo, es necesario indicar que el procedimiento
requiere un cuidadoso manipuleo del material en estudio y adems la inhibicin de las nucleasas que
pueden degradarlo rpidamente. Esto se consigue, en el primer caso, mediante mezclas suaves del
extracto y en el segundo, agregando agente quelantes que bloqueen la actividad de estas enzimas.
Como se sabe el DNA es una doble hebra helicoidal constituida por bases nitrogenadas
(ATGC), la pentosa denominada desoxirribosa y una molcula de cido fosfrico. Estos componentes
pueden ser reconocidos utilizando reactivos qumicos especficos con la ayuda de la
espectrofotometra.
Para ello se requiere efectuar una hidrlisis cida en la macromolcula o someterlo a la accin
enzimtica de las nucleasas de acuerdo con los requerimientos analticos que se establezcan. Aunque
no es un requisito indispensable para los ensayos antes propuestos, es conveniente averiguar
previamente si el DNA que vamos a examinar se encuentra en estado nativo o denaturado. Adems es
conveniente acercarse al conocimiento de su grado de pureza determinndose para ello su probable
contaminacin con las protenas.
Se puede deducir entonces que el anlisis de DNA es un proceso cuidadoso que depende
fundamentalmente del modo en que fue extrado del contenido celular.

2. OBJETIVO
- Determinar la capacidad de absorcin de radiacin UV de las bases nitrogenadas.
- Extraer el DNA a partir de un extracto celular animal y vegetal

3. MATERIALES

- 15 g de Pisum sativum congelado - Embudos

- 1g de tejido gonadal de Argopecten - Morteros
- Sodio dodecil sulfato al 25% (SDS) - Erlenmeyer y beakers de 150ml
- Cloroformo : Alcohol isoamlico (24:1) - Gasa estril ( 4 sobres)
- Etanol fri isopropanol fro - Varilla de vidrio delgados (4)
- Soluciones A , B , C y L - Centrfuga
- Solucin de bases nitrogenadas (0,05M) - Espectrofotmetro
 - Solucin de L (lisis) - 4 Pipeta pasteur (plstico graduada)
- Gradilla , plumn marcador. Papel toalla
- Tubos 13x100 (4). Papel milimetrado
-Tubos 16x100 (6)

4. PROCEDIMIENTO

4.1 Espectro de Absorcin de Bases Nitrogenadas: Adenina, Citosina y Guanina

Muestra B 1 2 3 4

Adenina ---- 0,2 ---- ----

Citosina ---- ----- 0,2 ----

Guanina ---- ---- ---- 0,2
Uracilo ----- ----- ----- ---- ---
Agua destilada 3,0 2,8 2,8 2,8

Registrar absorbancias de cada una de las muestras en el rango de 235- 280nm. Graficar
(papel milimetrado) el espectro de absorcin de cada base, determinar su mximo de
absorcin; y hallar el margen de error considerando sus tericos.

4.2. Extraccin del DNA de Gonadas de Argopecten

1- Colocar en un mortero 0,8 -1 g. de tejido gonadal e incorporar 5 ml de solucin A ,

homogenizar la muestra y centrifugar a 2000 rpm/5min.

2- El precipitado resuspenderlo en 10 ml de solucin A y adicionar 0,5 ml de SDS, agitar

durante 10 min Adicionar 2,5 ml de solucin B; continuar con la agitacin durante 10min.
3- Colocar sobre esta mezcla 13ml de cloroformo alcohol isoamlico (24:1), tapar el
recipiente y agitar durante 30min retirando la tapa cada cierto tiempo para eliminar los
vapores del solvente. Centrifugar a 6000 rpm/20min.

4- Separar la fase acuosa superior con ayuda de una pipeta (aprox. 6ml) y colocarla en un
beaker, adicionar 2 volmenes de etanol fro e introducir la varilla de vidrio realizando
con ella movimientos circulares para permitir la adhesin de fibras de DNA a la varilla.

5- Colocar las fibras en un tubo de 16x150 conteniendo solucin C (5mL) para su

resuspensin.

6- Dejar el tubo a temperatura ambiente (rotulado y tapado) para su evaluacin en la

siguiente prctica.

4.3 Extraccin del DNA de Pisum sativum

1- Homogeneizar en el mortero 8g de la muestra congelada en 25 ml de solucin L

( sol. de lsis , No ms de 5 minutos).

2- Trasvasar el homogenizado a un beaker e incubarlo a 58C por 15 min para lisar al

mximo las membranas y liberar al DNA.

3- Colocar el beaker en fri por 10 min .

4- Filtrar la solucin utilizando gasa estril

 5- Precipitar el DNA de la solucin recuperada empleando 2 volmenes de etanol
isopropanol fro para ello la incorporacin del alcohol debe realizarse en forma lenta por
las paredes del beaker. En la fase superior estar el alcohol y en la interfase con la
solucin acuosa se observar el DNA en forma de filamentos los que sern recuperados
con ayuda de una bagueta delgada girando en sentido horario.

6- La muestra presente en la bagueta transferirla a un tubo 16x150mm conteniendo

solucin C (5mL) para su resuspensin.

7- Dejar el tubo a temperatura ambiente (rotulado y tapado) para su evaluacin en la

siguiente prctica.

5. PROBLEMAS:
1- En el DNA de ciertas clulas bacterianas, el 13% de los nuclesidos son adenosina. Cules son los
porcentajes de los otros nuclesidos?

2- El DNA del bacterifago M13 tiene la siguiente composicin de bases: 23% A, 36% T, 21% G,
20% C. Qu puede deducir del DNA de este fago?

3- Calcular la longitud de un duplex de DNA cuyo peso molecular es de 3x10 7. Cul es el volumen
ocupado por una molcula de ese DNA. Cuantas vueltas helicoidales contiene ese DNA.

4- El peso molecular del DNA del bacteriofago T4 de doble cadena es 1.3x108 a) cuantos
aminocidos puede ser codificado por DNA de T4 b) Cuantas protenas diferentes de peso molecular
55,000 puede ser codificado por DNA T4.

5- La longitud total del DNA de una clula humana haploide es de 3.3 109 pares de bases (pb).
a) Asumiendo que todo se encontrase en forma de doble hlice de tipo B, calcular cul sera su
longitud en metros
b) si aumentsemos el tamao de la molcula de DNA, de modo que en lugar de unos 2nm de
dimetro, fuese de 5mm (como un cable elctrico), Cul sera la longitud de ese cable,
completamente extendido Qu distancia habra entre los pares de bases en la escala aumentada?
Cul sera la longitud de un gen de 1000 pares de nucletidos?

Prof. Edith Rodrguez