INGENERIA MANTENIMIENTO INDUSTRIAL

MICROSCOPIO ELECTRNICO

NOMBRES:
SAULO DONALDO GARCIA SANTES
JULIO JUAN JIMENEZ
SINAHI LANDA BAUTISTA
JULIO CESAR PEREZ ROJAS
AZAEL HERNANDEZ HERNANDEZ

PROFESOR
VICTOR MANUEL VELSQUEZ DEL MORAL

MATERIA:
ENSAYOS DESTRUCTIVOS

GRUPO:
901 B

FECHA:
10 JUNIO DEL 2017
 HISTORIA DE LA MICROSCOPA.

Un microscopio (palabra griega que significa para ver lo pequeo), es un

instrumento ptico (conjunto de una o varias lentes) que permiten ver objetos muy
pequeos o detalles estructurales imposibles de distinguir a simple vista.

En la antigedad se saba que los materiales curvos transparentes y las esferas de

cristal llenas de agua aumentaban el tamao de los objetos, sin embargo an no
contaban con los medios tecnolgicos y cientficos para comprender y hace uso de
tal fenmeno, y as poder desarrollar una tecnologa en su beneficio.

Fue hasta el siglo XVII cuando se iniciaron las primeras experiencias con piezas de
vidrio en forma de lenteja, dndoles por ello el nombre de lentes. Con stos
observaban un aumento en la imagen de los objetos, fenmeno que fue muy
apreciado por diversos comerciantes, tales como joyeros y mercaderes de tejido
con la finalidad de observar la calidad de los productos.

Fue Galileo Galilei (1564-1662) al primero a quien se le acredit el uso cientfico de

las lentes al hacer observaciones astronmicas.

Entr los aos de 1591 y 1608, el fsico holands

Zacharias Jensen construy el primer microscopio
compuesto, constituido por varias lentes que permitieron
corregir las aberraciones esfrica y cromtica.se muestra
este microscopio que consista de un lente objetivo
convexo y un ocular cncavo.Johannes Kepler (1571-
1630) dise un microscopio compuesto en que el objetivo y el ocular eran del tipo
convexo

Anthony van Leeuwenhoek (1632-1723), trabajando en un

negocio de tejidos, seinteres por el aspecto que tenan las
telas cuando las vea bajo aumento y comenz a trabajar en
el tallado de los vidrios para mejorar las imgenes que
observaba, logrando amplificar hasta 270 veces, de esta
manera pudo observar diversos tipos de materiales como:
musgos, leche, agua, abejas, etc., siendo el primero en observar (1675) los
infusorios (microorganismos
observados en aguas Estancadas).
Uno de los descubrimientos ms
importantes en la historia de
observacin biolgica y mdica se
produce en 1665, cuando el mdico
ingls, Robert Hook, utilizando un
microscopio ptico rudimentario,
report que todos los seres vivos estn
formados por unidades estructurales de
vida a las que llam celdas o clulas.
Con el desarrollando la teora de la ptica, Christian Huygens (1629-1695),
construy instrumentos mucho ms poderosos que los de Galileo, obteniendo
imgenes ms ntidas con un nuevo mtodo de pulido de lentes.
A diferencia del microscopio de Kepler que consista en una lente simple
planoconvexa, el ocular de Huygens tena dos lentes plano-convexas, una de mayor
dimetro y distancia focal o lente de campo y una segunda de menor dimetro y de
distancia focal igual a la mitad de la lente de campo, llamada lente de ojo.
 La microscopa fue perfeccionndose muy lentamente, uno
de los defectos de los primeros microscopios era que sus
lentes descomponan la luz blanca en los colores que la
constituyen. Los objetos pequeos se vean rodeados de
anillos de color (aberracin cromtica) que impedan
observar con claridad los detalles.
Alrededor de 1820 se perfeccionaron cuando Joseph
Jackson Lister, dise un microscopio acromtico capaz
de eliminar los anillos de color que limitaban la claridad de
la imagen.
Carl Zeiss y Ernst Abbe, lograron producir microscopios de gran calidad, gracias a
La aplicacin de la teora de formacin de imgenes de Abbe, diseando por
primera vez un microscopio basado en clculos matemticos y conocimientos de
ptica geomtrica. Sus microscopios presentaban problemas al tratar de observar
muestras transparentes a la luz visible, como es el caso de algunos seres vivos.

En el ao 1935, Fritz Zernike desarroll el Microscopio de

Contraste de Fase, apoyndose en la teora de que las clulas
absorben poca luz, tienen diversos espesores y diversos ndices
de refraccin en sus partes, provocando las diferencias de fase de
las ondas de luz que pasan a travs de ellas. La fase de un Haz
de luz no se ve a la vista (apenas se ve la intensidad, no la fase).
Zernike calcul la manera de hacer que las diferencias de fase se
observaran en la imagen como diferencias en la intensidad,
logrando as, visualizar detalles que no eran posibles apreciar en
un microscopio convencional.
El principio de la microscopa confocal fue dado a conocer por Minsk en 1957,
aunque los primeros microscopios basados en esta tcnica demostraron su validez
hasta 1968, gracias a los trabajos de Petran y colaboradores.
Su mayor aceptacin tuvo lugar hasta hace unos pocos aos con el desarrollo de
los lseres y equipos de cmputo. El xito de este
microscopio se debe a las ventajas que ofrece frente a
la microscopa ptica convencional: imgenes de mayor
nitidez y contraste, mayor resolucin vertical y
horizontal, posibilidad de obtener imgenes que
permiten su estudio en 3D.
La microscopa confocal es una tcnica relativamente
nueva que est logrando
Excelentes resultados en diversas ramas de la ciencia
(medicina, biologa, materiales, geologa, etc.).

El desarroll de la microscopa ptica fue un pilar fundamental del conocimiento a

principios del siglo XVII de aquello invisible a la vista del ser humano; sin embargo,
su lmite de resolucin de aproximadamente un micrmetro,
ya no fue posible mejorarlo debido al factor limitante de la
longitud de onda de la luz (450-640 nm). Fue hasta el ao de
1931 cuando se alcanz a obtener, con la ayuda de otra
generacin de microscopios, una resolucin 1000 veces
mayor que la de un microscopio ptico; a sta generacin se
le conoce como Microscopa Electrnica y fueron los fsicos
Max Knoll y Ernst Ruska en Alemania, quienes dieron a
conocer el
Microscopio
electrnico de transmisin (TEM).
Posteriormente, en el ao 1938,
Manfred Von Ardenne construy el
primer Microscopio Electrnico de
Barrido (SEM) y comercialmente
distribuido hasta 1965.
Por su capacidad de proporcionar informacin morfolgica, topogrfica, qumica,
Cristalina, elctrica y magntica de los materiales, la microscopa electrnica se ha
Convertido en herramienta indispensable en el estudio de la fsica de estado slido,
ciencia de materiales, electrnica, polmeros, metales, textiles, biologa, medicina,
etc., ya que alcanzan un poder de resolucin de hasta 0.1 nm en un TEM y 1.5 nm
en un SEM.
La diferencia principal entre microscopia electrnica y ptica es el uso de un haz
de electrones en lugar de luz para enfocar la muestra, consiguiendo aumentos de
hasta 2x106 veces.
El Microscopio de barrido por tunelaje (STM) fue desarrollado en 1981 por Gerd
Benning y Heinrich Rohrer, logrando imgenes de superficies metlicas a escala
atmica, este tipo de microscopios, surge como una excelente alternativa adicional
para los microscopios pticos, esto, debido a las capacidades de barrer o escanear
muestras de mayor tamao longitudinal (plano X-Y) con un alto poder de resolucin.
Se utilizan bsicamente para el estudio de materiales conductores y su nombre se
debe a que se utiliza el efecto tnel (Mecnica Cuntica) para generar la imagen,
adems, en los STM la punta piezoelctrica detectora y el metal a analizar estn
separados por vaco, as los electrones no tienen la suficiente energa para escapar
a travs del vaco, pero puede haber
intercambio de electrones entre
ambos metales por efecto tnel si
stos se encuentran suficientemente
prximos.
En 1985, Benning y Rohrer
desarrollaron el Microscopio de
Fuerza Atmica (AFM); que es un
instrumento mecano-ptico capaz de
detectar fuerzas del orden de los nN.
Al analizar una muestra, se registran las diferencias de altura entre el objeto de
estudio y una punta cristalina de forma piramidal acoplada a un soporte
microscpico, muy sensible al efecto de las fuerzas y de slo unos 200 m de
longitud. La fuerza atmica es detectada cuando la punta est muy prxima a la
superficie d la muestra, entonces es posible registrar la pequea flexin del soporte
mediante un haz lser reflejado en su parte posterior.
Un sistema auxiliar piezoelctrico desplaza la muestra en 3D, mientras que la punta
recorre la superficie. Todos los movimientos son controlados a travs de una
computadora, la resolucin del microscopio es alrededor de 0.2 nm, y la pantalla de
visualizacin permite distinguir detalles en la superficie de la muestra con una
amplificacin de varios millones de veces.

EL MICROSCOPIO ELECTRNICO.
Para estudiar la estructura interna de los microorganismos es esencial el uso del
Microscopio electrnico. En este microscopio se utilizan electrones en vez de rayos
de luz, y como lentes funcionan unos electroimanes. Todo el sistema opera en el
Vaco. Cuando los electrones pasan a travs de la preparacin algunos son
difractados creando entonces una imagen que se hace visible en una pantalla
sensible a los electrones. La resolucin obtenida
con el microscopio electrnico es mucho mayor
que la conseguida con el microscopio ptico.
Mientras que con estructuras ms pequeas que
pueden observarse tienen unos 02 m, con el
microscopio electrnico pueden verse fcilmente
objetos de 0001 m (= 1 nm = 10-9 m). Con el
microscopio electrnico es posible ver muchas
sustancias incluso de tamao molecular. Sin
embargo, a causa de la naturaleza de este
instrumento slo pueden examinarse objetos
muy delgados. Si se est interesado en ver estructuras internas, incluso una sola
bacteria es demasiado gruesa para ser observada directamente. Por consiguiente,
para preparar muestras para el microscopio electrnico se necesitan tcnicas
especiales de cortes ultra finos. Para seccionar las clulas primero deben ser fijadas
y deshidratadas, realizndose habitualmente esto ltimo transfiriendo las clulas a
un disolvente orgnico. Despus de la deshidratacin la muestra es incluida en
plstico y en este plstico se cortan secciones finas utilizando un ultra micrtomo,
por lo general equipado con una cuchilla de diamante. Una sola clula bacteriana,
por ejemplo, puede cortarse en cinco o seis secciones muy finas, que son
examinadas despus individualmente con el microscopio electrnico. Para obtener
suficiente contraste, las preparaciones se tratan con colorantes especiales de la
microscopia electrnica, tales como cido smico, permanganato, uranio, lantano o
plomo. Estos materiales estn compuestos por tomos de elevado peso molecular
y, por ello, dispersan bien los electrones. Las estructuras celulares teidas con uno
de esos materiales presentan un contraste muy aumentado y, por tanto, se ven
mejor.

La fina seccin es montada sobre una rejilla metlica recubierta de colodin y es

incorporada al instrumento, luego se aplica el alto vaco. Una vez es evacuada la
cmara de la muestra, se enfoca el haz electrnico y la imagen se observa en una
pequea pantalla. Se toman fotografas de las imgenes interesantes, ya que slo
en la placa fotogrfica se obtiene la resolucin ltima del microscopio electrnico.
El intenso haz electrnico causa el deterioro gradual de la muestra, de forma que
no es posible una observacin a largo plazo.
La fijacin, la inclusin y la tincin son tratamientos potencialmente perjudiciales y
pueden alterar grandemente las estructuras celulares. Por esta razn debe tenerse
gran cuidado en la interpretacin de las imgenes obtenidas con el microscopio
electrnico. Los artefactos o creaciones
artificiales son mucho ms comunes que
en la microscopia ptica. Procedimientos
que van bien con ciertos organismos
pueden fallar con otros. En general, se
utilizan mtodos diferentes para los
organismos procariticos y para los
eucariticos.
La microscopia electrnica es un arte
altamente desarrollado y con esta tcnica
somos capaces de observar estructuras celulares que no pueden verse de ninguna
otra manera. La resolucin mucho mayor que puede obtenerse justifica el cuidado,
el tiempo y el gasto que representa la preparacin de micrografas electrnicas.

Limitaciones del microscopio electrnico.

La limitada apertura no permite que la informacin detallada alcance la imagen,

limitando de este modo la resolucin.
El contraste de amplitud (que radica en la naturaleza corpuscular de los
electrones) se debe al contraste de difraccin, provocado por la prdida de
electrones del rayo. Es un contraste dominante en especmenes gruesos.
El contraste de fase (que radica en la naturaleza ondulatoria de los electrones)
se debe al contraste de interferencia provocado por los desplazamientos en las
fases relativas de las porciones del rayo. Es un contraste dominante en
especmenes finos.
Existen tambin distintas aberraciones producidas por las lentes: astigmtica,
esfrica y cromtica
El problema de la funcin de transferencia de contraste (CTF): la CTF describe
la respuesta de un sistema ptico a una imagen descompuesta en ondas
cuadrticas.

El material biolgico presenta dos problemas fundamentales: el entorno de vaco y

la transferencia de energa. Para resolverlos, se utilizan distintas tcnicas
dependiendo del tamao de la muestra:

Para muestras grandes como rganos, tejidos o clulas, se utilizan tres tcnicas:

1. La fijacin qumica o la criofijacin;

2. La inclusin en resinas (criosustitucin);
3. La rplica metlica;
 Para muestras pequeas como complejos macromoleculares se utilizan las
siguientes tcnicas:

1. La tincin negativa: los agentes de tincin ms usados son el molibdato

amnico, el fosfotungstato sdico y sales de uranio como acetato y formiato.
Todos ellos presentan las siguientes propiedades: interactan mnimamente
con la muestra y son estables en la interaccin con los electrones, son
altamente solubles en agua, presentan una alta densidad que favorece el
contraste, tienen un punto alto de fusin, tienen un tamao de grano
pequeo;
2. La rplica metlica: para construir la rplica metlica se evapora el metal
(estao), que se deposita sobre la muestra a la vez que esta, por el vaco,
se disuel

MICROSCOPIO DE TRANSMISIN (MET).

Un microscopio electrnico de transmisin (TEM, por sus siglas en ingls, o MET,

en espaol) es un microscopio que utiliza un haz de electrones para visualizar un
objeto, debido a que la potencia amplificadora de un microscopio ptico est limitada
por la longitud de onda de la luz visible. Lo caracterstico de este microscopio es el
uso de una muestra ultrafina y que la imagen se obtenga de los electrones que
atraviesan la muestra.

Los microscopios electrnicos de transmisin pueden aumentar un objeto hasta

un milln de veces.

El primer microscopio electrnico de transmisin fue desarrollado entre 1931 y 1933

por Ernst Ruska y sus colaboradores. La ptica bsica de ese primer microscopio
electrnico se mantiene hasta nuestros das; los cambios en los microscopios
modernos consisten en adicionar ms lentes para incrementar el mbito de
aumentos y darle mayor versatilidad. El primer microscopio electrnico de
transmisin comercial lo construy Siemens en 1939.

Debido a que los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la
luz visible, pueden mostrar estructuras mucho ms pequeas.
Las partes principales de un microscopio electrnico de transmisin son:

Can de electrones, que emite los electrones que chocan o atraviesan el

espcimen (dependiendo que tipo de microscopio electrnico es), creando una
imagen aumentada.
Lentes magnticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de
electrones, ya que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios
pticos no funcionan con los electrones.
Sistema de vaco es una parte muy importante del microscopio electrnico.
Debido a que los electrones pueden ser desviados por las molculas del aire, se
debe hacer un vaco casi total en el interior de un microscopio de estas
caractersticas.
Placa fotogrfica o pantalla fluorescente que se coloca detrs del objeto a
visualizar para registrar la imagen aumentada.
Sistema de registro que muestra la imagen que producen los electrones, que
suele ser un ordenador.

El microscopio electrnico de transmisin emite un haz de electrones dirigido hacia

el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son
absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de
la muestra.

De arriba abajo, el TEM consiste en una fuente de emisin, que puede ser
un filamento de tungsteno o bien una fuente de hexaboruro de lantano (LaB6). Para
el caso del tungsteno el filamento puede ser o bien en la forma de una horquilla de
pelo o bien pequeo y en forma de pa. Las fuentes de LaB 6 utilizan un
pequeo monocristal. Conectando dicho can a una fuente de alto voltaje (~120kV
para muchas aplicaciones) comenzar a emitir electrones hacia el vaco. Esta
extraccin de electrones suele reforzarse con la ayuda de un cilindro Wehnelt. Una
vez extrados, las lentes de la parte superior del TEM manipulan los haces de
electrones permitiendo su focalizacin al tamao deseado y su localizacin sobre la
muestra.

La manipulacin de los electrones se consigue mediante la combinacin de dos

efectos fsicos. La interaccin de los electrones con un campo magntico hace que
estos se muevan de acuerdo a la frmula vectorial F= (q.v) x B (siendo v y B, el
vector velocidad del electro, B el vector campo magntico y "x" el producto vectorial).
Este efecto permite que los electrones emitidos puedan ser manipulados por medio
de electroimanes. Esta tcnica permite la formacin de una lente magntica
de distancia focal variable, dependiendo de la distribucin del flujo magntico.
Adems un campo elctrico puede deflectar la trayectoria de los electrones en un
ngulo fijo. Mediante dos deflexiones seguidas pueden desplazarse lateralmente las
trayectorias de los electrones. Esta tcnica permite el desplazamiento lateral de los
haces de electrones en el TEM, siendo esta operacin especialmente importante
para el barrido de los haces en la variante STEM. De la combinacin de estos dos
efectos as como del empleo de un sistema de visualizacin (tal como
una pantalla de fsforo) se obtiene el nivel de control de los haces requerido para la
operacin del TEM.

Las lentes del TEM permiten realizar la convergencia de los haces y el control del
ngulo de la misma. Dicho control se ejerce modificando la cantidad de corriente
que fluye a travs de las lentes cuadrupolares y hexapolares y permite modificar los
aumentos del TEM. La lente cuadrupolar consiste en un conjunto de
cuatro bobinas situadas en los vrtices de un cuadrado. La lente hexapolar
simplemente incrementa el grado de simetra del campo resultante.
Tpicamente un TEM contiene tres conjuntos de lentes con muchas posibles
variantes en la configuracin de las lentes, en particular la de TEM con filtrado
energtico o EFTEM. Los conjuntos se denominan respectivamente lentes
condensadoras o condensador, lentes de
objetivo o simplemente objetivo y lentes
de proyeccin o proyector. Las lentes
condensadoras se encargan de la
formacin inicial del haz tras la emisin de
los electrones. Las lentes de objetivo
focalizan el haz sobre la muestra y
finalmente las lentes de proyeccin se
encargan de expandir el haz reflejado
hacia la pantalla de fsforo u otro
dispositivo de visualizacin tal
como pelcula. Los aumentos del TEM
vienen dados por la razn de las distancias
entre la muestra y el plano imagen del
objetivo.

Es de apreciar que la configuracin de un TEM vara significativamente segn su

implementacin. As algunos fabricantes usan configuraciones especiales de lentes,
tales como en instrumentos corregidos de aberracin esfrica, en particular en
aplicaciones de alto voltaje en TEM de emisin de campo.

El sistema de visualizacin en un TEM puede consistir en una pantalla de fsforo

para observacin directa por el operador y opcionalmente en un sistema de registro
de imgenes tales como pelcula o una retina CCD combinada con una pantalla de
fsforo. Normalmente estos sistemas de visualizacin pueden ser intercambiados a
conveniencia del operador.
Sistema de vaco.
La necesidad de esto se debe a dos razones: primero, permitir una diferencia de
voltaje entre el ctodo y tierra sin que se produzca un arco voltaico. Segundo,
reducir la frecuencia de las colisiones de los electrones con los tomos del aire a
niveles despreciables. Ya que el TEM, contrariamente a un CRT, es un sistema que
debe permitir la reposicin de componentes, la insercin de muestras y,
particularmente en modelos antiguos, el cambio de carrete de pelcula, se hace
imprescindible la posibilidad de reproducir el vaco regularmente. Por ello los TEMs
estn equipados con sistemas de bombeo completos y su sellado de vaco no es
permanente.

El sistema de visualizacin en un TEM puede consistir en una pantalla de fsforo

para observacin directa por el operador y opcionalmente en un sistema de registro
de imgenes tales como pelcula o una retina CCD combinada con una pantalla de
fsforo. Normalmente estos sistemas de visualizacin pueden ser intercambiados a
conveniencia del operador.

Procedimiento de uso

Para utilizar un microscopio electrnico de transmisin debe cortarse la muestra en

capas finas, no mayores de un par de miles de ngstroms. Los microscopios
electrnicos de transmisin pueden aumentar un objeto hasta un milln de veces.

Aplicaciones

La principal funcin del microscopio electrnico de transmisin es estudio de

los metales y minerales y el estudio de las clulas a nivel molecular. Siendo as un
papel muy importante en la industria de la metalurgia. A su vez se utiliza en
la microbiologa, para observar la estructura de los virus. Tambin es usado en la
anatoma patolgica, para diagnosticar partiendo de la ultraestructura celular.
 MICROSCOPIO ELECTRNICO DE BARRIDO (MEB)

El microscopio electrnico de barrido (MEB o SEM, por Scanning Electron

Microscope) es una tcnica de microscopa electrnica capaz de producir imgenes
de alta resolucin de la superficie de una muestra utilizando las interacciones
electrn-materia. Utiliza un haz de electrones en lugar de un haz de luz para formar
una imagen.

Apoyndose en los trabajos de Max Knoll de los aos 1930 fue Manfred von
Ardenne quien logr inventar el MEB en 1937 que consista en un haz de electrones
que barra la superficie de la muestra a analizar, que, en respuesta, reemita algunas
partculas. Estas partculas son analizadas por los diferentes sensores que hacen
que sea posible la reconstruccin de una imagen tridimensional de la superficie.

Los trabajos realizados en la dcada de 1960 en el laboratorio de Charles William

Oatley, en la Universidad de Cambridge, contribuyeron en gran medida al desarrollo
del MEB, y dieron lugar en 1965 a la comercializacin, por parte de Cambridge
Instrument Co., de los primeros microscopios de barrido.1 Hoy en da, la
microscopa electrnica de barrido se utiliza en campos que van desde la biologa a
la ciencia de los materiales, pasando por la arqueologa, y muchos fabricantes
ofrecen aparatos de serie equipados con detectores de electrones secundarios y
cuya resolucin se sita entre 0, 4 y 20 nanmetros.2

Los MEB poseen una gran profundidad de campo, que permite enfocar a la vez gran
parte de la muestra. Tambin producen imgenes de alta resolucin, de forma que
las caractersticas ms nfimas de la muestra pueden ser examinadas con gran
amplificacin. La preparacin de las muestras es relativamente fcil ya que la
mayora de los MEB slo requieren que estas sean conductoras. La muestra
generalmente se recubre con una capa de carbono o una capa delgada de un metal,
como el oro, para darle carcter conductor. Posteriormente, se barre la superficie
con electrones acelerados que viajan a travs del can. Un detector formado por
lentes basadas en electroimanes, mide la cantidad e intensidad de los electrones
que devuelve la muestra, siendo capaz de mostrar figuras en tres dimensiones
mediante imagen digital.
Antecedentes.

Los primeros instrumentos desarrollados para este propsito fueron

los microscopios pticos. Estos instrumentos consistieron, a lo largo de los aos,
desde una simple lupa hasta un microscopio compuesto. Sin embargo, an en el
mejor instrumento ptico, la resolucin est limitada a la longitud de onda de la luz
que se utilice, que en este caso es la luz violeta, cuya longitud de onda es de
aproximadamente 400 nanmetros, separacin mxima entre detalles que puede
observarse de esta manera. En trminos de amplificacin, esto quiere decir que no
podemos amplificar ms de 1000 veces.

Una salida inmediata a este lmite de resolucin consisti en utilizar

alguna radiacin de longitud de onda ms corta que la de la luz violeta. Los
candidatos inmediatos son los rayos X, que se caracterizan por una longitud de
onda del orden de 0, 15 nanmetros; desafortunadamente stos tienen la gran
desventaja de ser absorbidos rpidamente por las lentes de vidrio, y de no poder
ser desviados por las lentes magnticas (adems de las precauciones que debera
tener el operador).

Otra posibilidad que se contempl fue la de aprovechar el

comportamiento ondulatorio de los electrones acelerados por alguna diferencia de
potencial. Sea el caso, por ejemplo, de electrones acelerados en un campo de 100
000 voltios que presentan comportamiento ondulatorio con una longitud de onda de
0,0037 nm (3,7 picmetros), lo que en principio permitira tener un aparato que
resolviera detalles del mismo orden. Esto, en principio, sera suficiente para resolver
detalles atmicos, puesto que los tomos en un slido estn separados en un orden
de 0, 2 nm. Sin embargo, en la prctica, los detalles inherentes a la tcnica de
observacin o los defectos en el maquinado de las piezas polares
producen aberraciones.

Manfred von Ardenne

En 1928, Manfred von Ardenne estableci su laboratorio de investigacin

privada Forschungslaboratorium fr Elektronenphysik (en espaol, "Laboratorio de
Investigaciones para Fsica de los Electrones"),3 en Berlin-Lichterfelde, para llevar
a cabo su propia investigacin en tecnologa de radio y televisin y microscopa
electrnica. Invent el microscopio electrnico de barrido.

Funcionamiento.

En el microscopio electrnico de barrido es necesario acelerar los electrones en

un campo elctrico, para aprovechar de esta manera su comportamiento
ondulatorio, lo cual se lleva a cabo en la columna del microscopio, donde se
aceleran mediante una diferencia de potencial que puede ir desde 50 hasta 30 000
voltios. Los electrones acelerados por un voltaje pequeo se utilizan para muestras
muy sensibles, como podran ser las muestras biolgicas sin preparacin adicional
o muestras muy aislantes. Los voltajes elevados se utilizan para muestras
metlicas, ya que stas en general no sufren daos como las biolgicas y de esta
manera se aprovecha la menor longitud de onda para tener una mejor resolucin.
Los electrones acelerados salen del can, y se enfocan mediante las lentes
condensadora y objetiva, cuya funcin es reducir la imagen del filamento, de manera
que incida en la muestra un haz de electrones lo ms pequeo posible (para as
tener una mejor resolucin). Con las bobinas deflectoras se barre este fino haz de
electrones sobre la muestra, punto por punto y lnea por lnea.

Cuando el haz incide sobre la muestra, se producen muchas

interacciones entre los electrones del mismo haz y
los tomos de la muestra; puede haber, por ejemplo,
electrones que reboten como las bolas de billar. Por otra parte,
la energa que pierden los electrones al "chocar" contra la
muestra puede hacer que otros electrones salgan despedidos
(electrones secundarios), y producir rayos X, electrones
Auger, etc. El ms comn de stos es el que detecta
electrones secundarios, y es con el que se hacen la mayora de las imgenes de
microscopios de barrido.

Tambin podemos adquirir la seal de rayos X que se produce cuando se

desprenden estos mismos de la muestra, y posteriormente hacer un
anlisis espectro grfico de la composicin de la muestra.
Utilizacin

Se utilizan ampliamente en la biologa celular. Aunque permite una menor

capacidad de aumento que el microscopio electrnico de transmisin, ste permite
apreciar con mayor facilidad texturas y objetos en tres dimensiones que se hayan
pulverizado con un metal antes de su observacin. Por esta razn solamente
pueden observarse organismos muertos, y no se puede ir ms all de la textura
externa que se quiera ver. Los microscopios electrnicos slo pueden ofrecer
imgenes en blanco y negro puesto que no utilizan la luz visible.

Este instrumento permite la observacin y caracterizacin superficial de materiales

inorgnicos y orgnicos, entregando informacin morfolgica del material analizado.
A partir de l se producen distintos tipos de seal que se generan desde la muestra
y se utilizan para examinar muchas de sus caractersticas. Con l se pueden
observar los aspectos morfolgicos de zonas microscpicas de diversos materiales,
adems del procesamiento y anlisis de las imgenes obtenidas.

Los microscopios electrnicos de barrido no proporcionan naturalmente las

imgenes en 3D contrarias a microscopio de sonda de barrido. Sin embargo los
datos 3D se pueden obtener utilizando un SEM con diferentes mtodos, tales como:

Fotogrametra (2 o 3 imgenes de muestra inclinado)

Estereofotomtrica, tambin llamada "la forma con sombreado" (con 4
imgenes)
Reconstruccin inversa utilizando modelos interactivos de electrones de
material

Las aplicaciones posibles son la medicin de rugosidad, medida de la dimensin

fractal, medicin de la corrosin y la evaluacin altura de los escalones.

La tecnologa, introducida a principios de la dcada del 2000, permite mover el haz

de electrones unos pocos grados a la izquierda del eje perpendicular del mismo y
generar una imagen para inmediatamente despus generar un segundo barrido
ahora inclinado a la derecha. Capturando ambas imgenes producidas y
sobreponindolas, coloreando una azul y otra roja, producen una verdadera imagen
en 3D (tres dimensiones significa, entre otras cosas, que es posible medir en los 3
ejes X, Y y Z).
 MICROSCOPIO DE FUERZA ATMICA (MFA).
El microscopio de fuerza atmica (AFM, de sus siglas en
ingls Atomic Force Microscope) es un instrumento mecano-ptico capaz de
detectar fuerzas del orden de los nanonewtons. Al rastrear una muestra, es capaz
de registrar continuamente su topografa mediante una sonda o punta afilada de
forma piramidal o cnica. La sonda va acoplada a un listn o palanca microscpica
muy flexible de slo unos 200 m. El microscopio de fuerza atmica ha sido esencial
en el desarrollo de la nanotecnologa, para la caracterizacin y visualizacin de
muestras a dimensiones nanomtricas

Historia.
Gerd Binnig y Heinrich Rohrer fueron galardonados con el Premio Nobel de
Fsica en el ao 1986 por su trabajo en microscopa de efecto tnel (STM de sus
siglas en ingls Scanning Tunneling Microscopy). Binnig y Rohrer fueron
reconocidos por el desarrollo de la tcnica de STM, tcnica que permite formar una
imagen topogrfica en escalas que pueden ir desde cientos de micras (1x10-6 m)
hasta la escala nanomtrica (1x10-9 m), e incluso a escala atmica (1x10-10 m) sobre
la superficie de un material conductor o semiconductor mediante el barrido de una
punta sumamente aguda conductora de una corriente elctrica a una distancia de
unos pocos nanmetros. Compartieron el premio con el cientfico alemn Ernst
Ruska, el diseador del primer microscopio electrnico

Los componentes de un AFM son:

Diodo lser: Fuerza normal, Fn=A+B-(C+D), y Fuerza lateral, Fl=A+C-(B+D).

Micropalanca
Fotodiodo
Tubo piezoelctrico
Micropalancas
Histricamente las primeras palancas tenan un
tamao de varios mm y solan fabricarse con
metal, por ejemplo a partir de un hilo
de tungsteno con un extremo afilado y doblado
en ngulo recto para producir la punta. Ms
tarde se hizo necesario, para mejorar la
velocidad de barrido sin perder resolucin, que
las palancas tuvieran masas cada vez menores
y simultneamente frecuencias
de resonancia mayores. La solucin a este problema se hall en
la microfabricacin de las palancas.

Las micropalancas se producen en la actualidad

empleando mtodos de microfabricacin heredados
inicialmente de la industria microelectrnica
como litografa de superficie y grabados reactivos de
plasma de iones (RIE y DRIE siglas en ingls
de Reactive Ion Etching y Deep Reactive Ion Etching).
Las puntas suelen fabricarse a partir de deposiciones de
vapor de algn material idneo sobre la palanca ya
fabricada, en cuyo caso el resultado suele ser una punta cnica o ms comnmente,
cuando el silicio es el material de eleccin, recurriendo a tcnicas de grabado
anistropo. El grabado anistropo involucra el uso de una solucin de grabado que
excava el material slo o preferentemente en ciertas direcciones cristalogrficas. De
esta manera, es posible producir puntas piramidales limitadas por planos
cristalogrficos del material.

La fuerza de la micropalanca viene dada por el fabricante y se determina por la ley

de Hooke. En este caso, la ley de Hooke se representa por la ecuacin del resorte,
donde se relaciona la fuerza F ejercida por el resorte con la distancia
adicional x producida por alargamiento.
Sensores de flexin.
Existen actualmente distintos sistemas para medir la flexin del listn. El ms comn
en instrumentos comerciales es el llamado ptica en ste la flexin del listn se
registra mediante un haz lser que se refleja en la parte posterior de la micropalanca
para luego alcanzar un fotodetector. A este efecto, la mayor parte de las
micropalancas (listones) de AFM se fabrican actualmente con una capa de oro de
unas decenas de nm de espesor en su parte posterior para optimizar su reflectancia
al haz del lser. Sin embargo histricamente el primer sistema de deteccin usado
fue un microscopio de STM (efecto tnel). En este sistema una punta de STM era
ajustada al listn siendo la flexin de este medida a travs de la variacin en
la corriente de tnel, ya que dicha corriente es sensible a cambios subnanomtricos
en la distancia entre punta de STM y listn. La razn de que se pensara inicialmente
en este sistema es que en su origen el microscopio de AFM se concibi como
modificacin del microscopio de STM para ser usado con muestras elctricamente
aislantes ya que el microscopio de STM slo funciona con conductores.
Posteriormente se pas a sustituir este sistema de deteccin por un interfermetro
y finalmente se introdujo la palanca ptica. Ms recientemente se han incorporado
nuevos mtodos de deteccin basados en piezorresistividad o en medidas de
capacitancia. Sin embargo ninguno de estos mtodos "electrnicos" alcanza los
niveles de resolucin tanto espacial como temporal de la palanca ptica.

Por otra parte la palanca ptica presenta un problema de calibracin que afecta
especialmente a las medidas de fuerza. Este se debe a la necesidad que se da en
las medidas de fuerza de registrar de forma precisa la flexin de la palanca en su
extremo libre. Ya que el fotodiodo solamente registra el desplazamiento del punto
de lser sobre su superficie es necesario calibrar este desplazamiento con una
flexin real de la palanca para poder obtener medidas de flexin. Este procedimiento
conocido como calibracin de la sensibilidad se lleva a cabo imprimiendo una flexin
conocida al extremo de la micropalanca mientras simultneamente se registra la
seal del fotodiodo. La forma ms comn de obtener una flexin conocida es
presionar verticalmente el extremo de la palanca contra una superficie rgida,
asegurando as que el desplazamiento vertical de la palanca equivale a flexin en
su extremo.

Los mtodos interferomtricos o de efecto tnel no requieren de este procedimiento.

Unos de los aspectos ms importantes en la

resolucin de las imgenes obtenidas por AFM es la
agudeza de la punta. Las primeras utilizadas por los
precursores del AFM consistieron en pegar el
diamante sobre pedazos de papel de aluminio. Las
mejores puntas con radio de curvatura se encuentran
alrededor de los 5nm.

Existen tres tipos de influencias para formar las

imgenes:

Ensanchamiento
Compresin
Interacciones punta-muestra: En no contacto, fuerzas
electrostticas y magnticas; en casi contacto, fuerzas de van der Waals; en
contacto, capilaridad y fuerzas de contacto.
Aspecto del radio

Tipos de medidas, modos de operacin y aplicacin

El microscopio de AFM puede realizar dos tipos de medidas: imagen y fuerza.

En el modo de imagen la superficie es barrida en el plano de la superficie (X-Y)

por la punta. Durante el barrido la fuerza interatmica entre los tomos de la
punta y los tomos en la superficie muestral provoca una flexin del listn. Esta
flexin es registrada por un sensor adecuado (normalmente balanza ptica) y la
seal obtenida se introduce en un circuito o lazo de realimentacin. Este ltimo
controla un actuador piezoelctrico que determina la altura (Z) de la punta sobre
la muestra de forma que la flexin del listn se mantenga a un nivel constante
(Normalmente introducido por el operador). Representando la altura de la punta
 (Z) frente a su posicin sobre la muestra (X, Y) es posible trazar un mapa
topogrfico de la muestra Z=Z(X, Y). La fuerza interatmica se puede detectar
cuando la punta est muy prxima a la superficie de la muestra.
En medidas de fuerza la punta se hace oscilar verticalmente mientras se registra
la flexin del listn. La medida se expresa entonces representando fuerza (F)
frente a altura (Z) sobre la muestra. Las medidas de fuerza son tiles en estudios
de fuerzas de adhesin y permiten estudiar a nivel de una sola molcula
interacciones especficas entre molculas (ej: interaccin antgeno-anticuerpo,
interaccin entre hebras complementarias de ADN) o interacciones estructurales
de las biomolculas (plegado de protenas) as como caracterizar la elasticidad
de polmeros. Tambin es til en estudios de indentacin de materiales blandos
(polmeros) que permitan caracterizar propiedades elsticas de la muestra como
el mdulo de elasticidad o viscoelsticas.

En los modos dinmicos se hace vibrar la micropalanca a su frecuencia de

resonancia valindose para ello del actuador piezoelctrico. La interaccin punta-
superficie modifica la amplitud, frecuencia y fase de la resonancia, mientras el lazo
de realimentacin mantiene constante alguna de estas tres propiedades. Qu
propiedad sea sta es el criterio que determina el modo concreto de operacin:

En el Modo de no contacto o de frecuencia modulada (FM-AFM) (figura b) se

mantiene constante la frecuencia de resonancia. La principal aplicacin del FM-
AFM es levantar topografas de superficies duras a escala atmica y operando
en vaco extremo o UHV (de sus siglas en ingls Ultra High Vacuum)
En el Modo de repiqueteo (del ingls "tapping mode") o de amplitud
modulada (AM-AFM) (figura c) se mantiene constante la amplitud. Se usa
principalmente en medio lquido para obtener imgenes de muestras biolgicas
que slo son estables en soluciones acuosas.

Originalmente el uso del modo de no contacto implicaba que la punta se encontraba

siempre a distancia constante de la superficie, mientras que en el modo de
repiqueteo la punta golpeaba intermitentemente la superficie. Posteriormente se ha
demostrado que ambos modos puden ser operados tanto a distancia de la muestra
como en contacto con ella.

Modos dinmicos en lquido

En el modo dinmico en lquido existen dos formas de hacer oscilar la micropalanca:

En los modos acsticos se sita el piezoelctrico, o bien en la parte trasera de

la celda lquida, o bien bajo la muestra. En este caso, el movimiento de la
muestra induce el de la micropalanca. La principal desventaja de este modo es
que resulta en resonancias muy sucias.
En los modos electrosttico y magntico, la micropalanca se hace oscilar
mediante un campo elctrico o electrosttico. La principal desventaja de este
modo es que hay que metalizar las micropalancas.

El modo dinmico en lquido, adems de tratarse de una tcnica todava en

desarrollo, presenta fundamentalmente dos problemas:

1. Es menos sensible a las fuerzas de la interaccin punta-muestra que el modo

en aire. Esto es debido a la reduccin en agua de la constante de
amortiguamiento, lo que provoca que los cambios de la frecuencia de
resonancia se manifiesten en la amplitud con menor sensibilidad.
2. Al existir contacto entre punta y muestra, se necesitan micropalancas ms
blandas con frecuencias de resonancia ms altas.

Las aplicaciones del AFM en lquido son muy variadas: permite la resolucin de
problemas estructurales y la caracterizacin mecnica de protenas, detectar el
funcionamiento de protenas in situ (como el desplegamiento de protenas) y
manipular protenas individuales.

El sombreado
Si slo tiene que observarse el contorno de un organismo, no son necesarias
secciones finas y sobre la rejilla metlica pueden montarse
clulas enteras. Para aumentar el contraste de las clulas entras
se recurre generalmente al sombreado. Esto implica el
recubrimiento de la muestra con una fina capa de metal como, por
ejemplo, paladio, cromo u oro. El metal se deposita sobre el objeto
por un lado de forma que se crea una sombra. De esta manera el
objeto aparece con grosor y forma. El sombreado se utiliza a
menudo para observar apndices superficiales en
Las bacterias.

La tincin negativa.
Otro modo de conseguir contraste con el microscopio
electrnico es la tincin negativa. Se aplica el mismo
principio que en la tincin negativa del microscopio
ptico. Se utiliza una sustancia que no penetra la
estructura pero que dispersa los electrones. Una de las
tinciones negativas ms comnmente utilizadas en la
microscopia electrnica se realiza con cido
fosfovolfrmico (fosfotngstico).
Rplicas de carbono
Para examinar las superficies celulares pueden prepararse
rplicas de carbono evaporando sobre la superficie de las
clulas una fina capa de carbono que se adapta a los
contornos de la superficie celular y que cuando es desprendida
resulta suficientemente delgada para poder observarse
directamente al microscopio electrnico.

Criocorrosin
Otra tcnica de la microscopia electrnica recientemente desarrollada es la de
criocorrosin (freeze-etching), que evita la formacin de artefactos al eliminar la
fijacin qumica y la inclusin. La muestra que va a examinarse es congelada sin
tratamiento qumico y el bloque congelado se corta con una cuchilla de diamante,
de tal modo que quedan expuestas porciones de las superficies de las clulas. Se
hacen y se examinan entonces rplicas en carbono de
esas superficies, pudindose observar estructuras
superficiales o internas de las clulas. La mayora de las
estructuras celulares vistas en secciones ultra finas de
preparaciones fijadas qumicamente se ven tambin en
material congelado, lo que sugiere que esas estructuras no
son artefactos.

EL MICROSCOPIO ELECTRNICO EXPLORADOR (MEE).

Otro instrumento reciente para examinar las estructuras superficiales es el
microscopio electrnico explorador (scanning electron microscope). El material
que se estudia es recubierto con una pelcula fina de un metal pesado tal como el
oro. El rayo de electrones es dirigido sobre la preparacin y la va recorriendo y
explorando por todas la superficie. Los electrones dispersados por el metal pesado
activan una pantalla de observacin produciendo una imagen. Con el microscopio
electrnico explorador pueden observarse incluso muestras muy grandes, siendo
muy buena la profundidad de campo. El aumento que puede obtenerse oscila entre
uno tan bajo como x15 y uno tan alto como x100000, pero slo puede observarse
la superficie de un objeto.