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Peter Kastenmayer
INTRODUCCION
Los minerales y elementos traza son esenciales para una amplia gama de funciones
metablicas en el cuerpo humano. Las deficiencias de minerales y elementos traza
pueden producir severos daos en la salud (1). Los alimentos juegan un rol clave al
suministrar estos nutrientes para su consumo por los seres humanos. Los datos sobre el
contenido de minerales y elementos traza de los alimentos son crticos para las personas
involucradas en investigacin epidemiolgica y patrones de enfermedades, evaluacin de
la salud y estado nutricional de individuos y poblaciones y el comercio nacional e
internacional de los alimentos.
Con el fin de obtener resultados precisos y exactos, se debe controlar cuidadosamente las
siguientes etapas durante el anlisis:
- Recoleccin de la muestra
- Pretratamiento de la muestra
- Descomposicin de la muestra
- Validacin de los mtodos y datos analticos
- Anlisis instrumental
Las reglas bsicas establecidas para el anlisis traza e indicadas a continuacin deberan
ser seguidas para el procedimiento completo de anlisis. Una revisin detallada de estos
temas, se encuentra en las referencias (2) y (3):
RECOLECCION DE LA MUESTRA
El muestreo es una etapa muy crtica del proceso de anlisis debido a que los errores que
se cometen en esta etapa pueden comprometer seriamente los resultados obtenidos
posteriormente mediante mtodos analticos sofisticados. A menudo los alimentos no son
homogneos, por lo tanto, el tamao de la muestra debe escogerse cuidadosamente a fin
de obtener una muestra representativa.
Grfico 1
Control de contaminacin y prdidas
PRETRATAMIENTO DE LA MUESTRA
Homogeneizacin
La homogeneizacin hmeda en una bolsa plstica cerrada utilizando una licuadora de
laboratorio del tipo Stomacher se usa frecuentemente para homogeneizar muestras de
alimentos frescos. Una de las principales ventajas de esta tcnica consiste en el hecho
que no existe un contacto directo entre la muestra y el equipo. Esto elimina el riesgo de
contaminacin y no existe necesidad de limpiar las partes de la mquina. Una alternativa
menos costosa son los mezcladores de laboratorio con hojas de titanio o mezcladores
casetos (por ejemplo una moledora de caf). Estos son ms difciles de limpiar y aumenta
el riesgo de contaminacin con Fe, Cr y Ni si se utilizan hojas de acero inoxidable (Grfico
2).
Grfico 2
Pretratamiento de la muestra
Secado
DISOLUCION DE LA MUESTRA
Adems, los cidos fuertes son altamente corrosivos y el uso del cido perclrico requiere
de precauciones especiales de seguridad debido al riesgo de explosiones.
Grfico 3
Mtodos de descomposicin
VALIDACION DE LOS METODOS Y DE LOS DATOS ANALITICOS
Grfico 4
Metodologa de determinaciones analticas
Preparacin de estndares
Los estndares deberan prepararse en cido diluido (por ejemplo HNO3 0,5 M) utilizando
metales de alta pureza, sales estequiomtricas o soluciones calibradas de elementos
disponibles en el comercio. Tiene que verificarse la calibracin de pipetas y matraces
volumtricos usados en este proceso. Los estndares deberan almacenarse en
contenedores no contaminados y muy hermticos. La concentracin de estndares
deber revisarse despus de un almacenamiento prolongado. Para trabajar en el rango
de ppb, las soluciones estndares se preparan preferentemente en forma diaria a partir de
soluciones concentradas.
Curvas de calibracin
Una curva de calibracin se obtiene al medir una seal y de una serie de estndares con
concentraciones crecientes del analito x y se grafican estos valores en contra de las
concentraciones respectivas. Las curvas de calibracin pueden ser rectas o curvadas en
altas concentraciones. Debe tenerse cuidado en seleccionar el enfoque matemtico
correcto para definir la lnea de calibracin a travs de los puntos (por ejemplo regresin
no lineal para las lneas curvadas).
Interferencias
Debe mencionarse tambin que tanto la contaminacin con el analito como la prdida de
ste produce errores del tipo aditivo.
Grfico 5
Metodologa de determinaciones analticas
- Compatibilizacin de la matriz
- Mtodo del estndar interno
- Mtodo de la adicin de estndar
En qumica analtica los valores escogidos para kL y kQ son, por lo general, 3 y 10. Debe
mencionarse que para una concentracin DL, el promedio de la seal medida ser yB
+3SB y slo un 50% de los resultados sern considerados como detectados. Por lo tanto,
las mediciones de bajas concentraciones no son confiables. En tal situacin, es
aconsejable tratar de mineralizar una cantidad ms grande de muestra o incluir una etapa
de preconcentracin para obtener una mejor relacin seal/fondo (o blanco). Si esto no es
posible, deber seleccionarse un mtodo analtico ms adecuado para el problema
analtico.
Control de calidad
Cuando se desarrolla un nuevo mtodo analtico, tiene que revisarse la exactitud para
asegurar que se obtengan resultados confiables. Existen varias posibilidades para este
propsito. Si se encuentra disponible en el laboratorio otro mtodo analtico validado,
puede analizarse una serie de muestras por ambos mtodos y comparar los resultados
utilizando regresin lineal. Los resultados obtenidos con el nuevo mtodo se grafican en el
eje y, y aquellos obtenidos con el mtodo estndar en el eje x. El coeficiente de
correlacin y la lnea de regresin dan informacin sobre la concordancia entre los
mtodos (por ejemplo intercepto = 0, pendiente = 1, r = 1 en el caso ideal de una perfecta
concordancia).
Otro enfoque es el uso de mtodos estndares de anlisis emitidos por instituciones tales
como la Asociacin Americana de Qumicos Analticos Oficiales (AOAC).
METODOS ANALITICOS
Espectrofotometra
Fluorometra
Espectrometra de absorcin atmica, -AAS- (atomic absorption spectrometry)
Espectrometra de absorcin atmica de llama, -FAAS- (fame atomic absorption
spectrometry)
Espectrometra de absorcin atmica de horno de grafito, -GFAAS- (graphite
furnace atomic absorption spectrometry)
Espectrometra de absorcin atmica por generacin de hidruros, -HGAAS-
(hydride generation atomic absorption spectrometry)
Espectrometra de emisin atmica de plasma acoplado induc-tivamente, ICP-
AES- (inductively coupled plasma atomic emission spectrometry)
Espectrometra de masa de plasma acoplado Inductivamente, -ICP- MS-
(inductively coupled plasma mass spectrometry)
Espectrofotometra
Hace tres dcada era la tcnica ms comn para el anlisis de metales en los alimentos.
Sin embargo ha perdido importancia en aos recientes debido al desarrollo de nuevas
tcnicas tales como la espectrometra de absorcin atmica. Se basa en la relacin entre
la absorcin de la radiacin visible o ultravioleta cercana de una solucin y la
concentracin de las especies coloreadas en la solucin. El analito tiene que ser
convertido a un complejo coloreado antes del anlisis. Marczenko entrega una buena
revisin de la literatura reciente (10).
Fluorometra
Ciertos metales pueden ser transformados en complejos orgnicos asociados con iones o
quelatos fluorecentes que tienen la caracterstica de absorber luz de una longitud de onda
y en su lugar emitir luz de otra longitud de onda. La luz emitida o fluorescencia es
proporcional a la concentracin del analito. El mtodo es relati-vamente barato y es muy
sensible, varios rdenes de magnitud mejor que la espectrofotometra. Se utiliza
frecuentemente para la determinacin de elementos traza en muestras biolgicas y en
alimentos que son ms difciles de analizar con otras tcnicas como por ejemplo Se (11).
Los tomos libres producidos en un atomizador a partir de una muestra (llama u horno de
grafito calentado elctricamente) pueden absorber radiacin de su longitud de onda
especfica de resonancia generada por una fuente externa (por ejemplo un ctodo hueco
o una lmpara de descarga sin electrodos. Si la luz de esta longitud de onda especfica
pasa a travs del atomizador que contiene el vapor atmico del elemento, parte de la luz
ser absorbida, y el grado de absorcin ser proporcional a la densidad de tomos en el
paso de la luz.
La llama se utiliz exclusivamente como fuente de atomizacin en los primeros aos del
desarrollo de la AAS. La solucin de la muestra se aspira va un nebulizador dentro de la
llama de aire/acetileno o N2O/acetileno donde se evapora el solvente y los slidos
remanentes se separan en tomos. La FAAS no es muy susceptible a los efectos de la
matriz, aunque pueden encontrarse interferencias. Las interferencias fsicas pueden
ocurrir debido a cambios en la viscosidad de la solucin, lo que influye en su velocidad de
aspiracin dentro de la llama y, por lo tanto, en la cantidad de analito en la llama.
La HGAAS puede determinar elementos que forman hidruros voltiles como por ejemplo
As, Bi, Sn y Te. En esta tcnica, el analito es reducido a su hidruro voltil, transferido
mediante un chorro de gas a una clula de cuarzo caliente, descompuesto y atomizado.
La separacin del analito reduce en gran medida las interferencias de la matriz de tal
modo que pueden determinarse niveles de concentracin de .g/kg. Si el tamao de la
muestra es un problema, puede emplearse inyeccin de flujo que permite analizar
volmenes de muestra tan pequeos como 100 l. Sin embargo, el mtodo tiene sus
desventajas. Se requiere de un tratamiento especial despus de la digestin de la
muestra para generar un estado de oxidacin especfico (e.g. Se+4) para la formacin del
hidruro y ciertos metales (por ejemplo Cu, Fe) pueden interferir con la formacin del
hidruro.
El policromador sirve para separar las lneas espectrales para los diferentes elementos.
Pueden distinguirse dos tipos de instrumentos de ICP-AES:
Aunque la ICP-MS es una tcnica analtica relativamente nueva si se compara con los
mtodos ya descritos, se ha posicionado rpidamente como una de las tcnicas ms
tiles y verstiles para la determinacin de trazas en el anlisis de alimentos (14,15,16).
El desarrollo de la ICP-MS se produjo por el deseo de combinar la capacidad
multielemento y amplio rango de trabajo lineal de la ICP-EAS con los lmites de deteccin
excepcionalmente bajos de la GFAAS. En esta tcnica, se combina una fuente de ion
plasma a alta temperatura y a presin atmosfrica con un espectrmetro de masa bajo
vaco como un detector sensible. El plasma acoplado inductivamente se genera tal como
se describe anteriormente para ICP-EAS. Los iones producidos en el plasma son
maestreados en una direccin axial a travs de un orificio estrecho (aproximadamente
0,7-1,2 mm de dimetro) dentro de un interfaz bombeado diferencialmente con lentes
electroestticos y desde all extrados hacia el analizador de masa. Para la mayora de los
tipos de ICP-MS, se utiliza un cuadripolo para la separacin de masa, pero recientemente
se encuentran disponibles instrumentos de sector magntico de alta resolucin. Los iones
transmitidos son detectados por un multiplicador de electrones "fuera de eje", el cual
puede operarse en los modos analgo y/o conteo de pulso. La captura de los datos puede
hacerse en los modos de exploracin (scanning) o de pico. En el primer modo, se explora
la regin de la masa con los istopos de inters mientras que en el modo de pico slo se
miden los iones preseleccionados. La forma ms comn de introducir la muestra es la
inyeccin directa de soluciones utilizando un nebulizador neumtico y una cmara "spray".
Se dispone de una variedad de tipos diferentes de nebulizadores similares a aquellos
utilizados por la ICP-EAS. Debido a la alta temperatura del plasma, los compuestos del
analito en el aerosol son disociados eficientemente, atomizados y se forman iones con
una carga positiva. Ms de 50 elementos son ionizados a M+ en una proporcin de > 90%.
Desafortunadamente, tambin se producen picos de iones de xidos (MO+), iones
cargados doblemente e iones poliatmicos (por ejemplo ArNa+) ya sea a partir del analito,
la matriz de la muestra o del solvente. Estos picos complican el espectro y pueden causar
serias interferencias espectrales si ocurren en masas de iones con carga individual (por
ejemplo 40Ar 16O+ en 56Fe+). Ellos no pueden ser resueltos utilizando analizadores cuadripolo
pero pueden minimizarse optimizando las condiciones de funcionamiento de los
instrumentos o utilizando mtodos alternativos de introduccin de la muestra.
Adicionalmente, la eleccin del solvente puede contribuir a reducir las interferencias de
fondo. Por ejemplo, se prefiere HNO3 diluido en vez de HC1, H2SO4 y H3PO4 para la
mayora de las aplicaciones debido a que produce un espectro ms simple de fondo. Las
interferencias poliatmicas en muchos casos pueden eliminarse utilizando instrumentos
de sector magntico de alta resolucin de mayor costo, lo cual permite una resolucin de
masa hasta 8000. La ICP-MS tambin sufre de efectos de la matriz, por ejemplo la matriz
induce cambios de la intensidad de la seal inica especialmente en concentraciones de >
1 g/L de slidos disueltos. En altas concentraciones de sales, pueden observarse efectos
de la matriz tales como supresin de la ionizacin o efectos de carga espacial. Se utilizan
diversos mtodos para corregir o superar estos efectos de la matriz: dilucin de la
muestra, compatibilizacin de la matriz, uso de un estndar interno, adicin de estndar,
separacin qumica dilucin isotpica.
La forma ms comn de introduccin de la muestra en ICP-MS es la nebulizacin de la
solucin de la muestra. Durante los ltimos aos se ha desarrollado una gran variedad de
otros mtodos. Las muestras slidas pueden ser analizadas directamente, sin una
disolucin preliminar, mediante volatilizacin electro-trmica, nebulizacin termospray o
ablacin lser. Las muestras gaseosas tales como hidruros voltiles (Se, As) o
compuestos que eluyen de una cromatografa de gas o HPLC (Cr3+ / Cr6+) tambin pueden
introducirse en forma directa y eficiente dentro de ICP.
Los lmites de deteccin de los instrumentos con cuadripolo para la mayora de los
elementos son mejores que 0,1 g/L y por lo tanto, considerablemente ms bajos que
aquellos para la ICP-EAS (0,1-100 g/L). Los instrumentos de sector magntico de alta
resolucin permiten lmites de deteccin inferiores a 0,05 ng/L. Ventajas adicionales, ms
all de los excelentes lmites de deteccin, incluyen un rendimiento de muestras
extremadamente alto (>100 muestras/da) y la disponibilidad de informacin isotpica. La
principal desventaja de la ICP-MS consiste en el alto costo del instrumento y de
funcionamiento (derivado principalmente de un gran consumo de gas argn puro) y la
existencia de interferencias isobricas en el rango de masa baja (< 80 urna).
Los lmites de deteccin tpicos para las principales tcnicas espectromtricas atmicas
se muestran en el Grfico 6.
Grfico 6
Lmites de deteccin tpicos para las principales tcnicas espectromtricas
Generalmente, los mejores lmites de deteccin son alcanzados utilizando ICP-MS
o GFAAS. La FAAS y la ICP-AES tienen lmites de deteccin similares para la mayora de
los elementos con la excepcin de elementos refractantes tales como B, Al, o Zr, los
cuales generalmente se pueden analizar con una mejor sensibilidad en el plasma caliente
de ICP.
Las interferencias qumicas y espec trales no son por lo general un problema para la
FAAS pero ocurren frecuentemente en la GFAAS. La ICP-AES sufre de interferencias
espectrales especialmente cuando se analizan matrices complejas. La baja resolucin de
la ICP-MS tambin sufre de interferencia debido principalmente a los iones poliatmicos.
Esto puede evitarse al utilizar instrumentos de alta resolucin ms nuevos pero ms
costosos.
Los rangos de trabajo analtico para las tcnicas espectromtricas atmicas se muestran
en el Grfico 7.
Grfico 7
Rangos de trabajo analtico para las tcnicas espectomtricas atmicas
El rango de trabajo analtico se define como el rango de concentracin sobre el cual
pueden obtenerse resultados cuantitativos sin recalibrar el sistema. Un amplio rango de
funcionamiento ahorra el tiempo de anlisis que se emplea en calibrar y puede reducir los
errores de manipulacin de la muestra si las diluciones se mantienen a un mnimo. La
ICP-MS y la ICP-AES tienen rangos de funcionamiento de 3 rdenes de magnitud
mayores que la GFAAS y la FAAS.
Los costos tpicos del sistema para las tcnicas espectromtricas atmicas se ilustran en
Grf. 8 Los instrumentos para anlisis de elementos individuales (FAAS y GFAAS) son
generalmente menos complejos y, por lo tanto, de menor costo que aquellos instrumentos
para las tcnicas multielemento (ICP-AES y ICP-MS). El rendimiento de muestras es
siempre considerablemente mayor si se emplean los mtodos multielemento. Por lo tanto,
estas tcnicas se utilizan preferentemente en laboratorios donde tienen que hacerse un
gran nmero de anlisis de rutina. Sin embargo, los mtodos multielemento. por lo
general requieren ms conocimientos del operador que los mtodos ms simples para
elementos individuales.
Grfico 8
Sistemas tpicos de costo para los sistemas espectomtricos atmicos
Para todos los mtodos mencionados anteriormente, la automatizacin es en la actualidad
un asunto de inversin de capital. La mayora de los fabricantes ofrecen dispositivos de
automuestreo que permiten el funcionamiento automtico de los instrumentos.
REFERENCIAS
1. Reinhold, J.G., In: Trace Minerals in Foods, ed. Smith, K.T., Marcel Dekler, New
York, 1988, pp. 1-55