IDENTIFICACIN DE HIDROXIAPATITA Y

GLUCOSAMINOCANOS EN ESCAMAS ELASMOIDEAS DE

CARASSIUS AURATUS AURATUS
Gmez Citlali1
1 Facultadde Estudios Superiores Iztacala. Universidad Nacional Autnoma de
Mxico. Biologa. 2 semestre. Tlalnepantla de Baz, Estado de Mxico.

RESUMEN

Se trabajaron con 30 especimenes de la especie Carassius auratus auratus, se

tomaron los datos morfomtricos y se les realizo el anlisis alomtrico. Asimismo,
las variables morfolgicas y mersticas fueron procesadas por medio del mtodo
de regresin potencial. Posteriormente los especimenes fueron teidos utilizaron
Rojo de Alizarina S y Azul de Alciano. Se obtuvieron las escama y se pudo
determinar que todas las escamas eran elasmoideas y cicloidea, pero en algunas
se pudieron identificar series de dentculos sobre la superficie de la lmina sea
de la escama, los elementos muestran facilmente teidos con Rojo de Alizarina, la
cual es n indicativo que hay una gran clasificacin

Palabras clave:Carassius auratus auratus, Doble tincin, Rojo de Alizarina, Escama

elasmoiea, Denticulo drmico.

INTRODUCCIN

a) Carassius auratus auratus

La especie Carassius auratus auratus originario de Asia oriental se ha convertido

en un pez domestico muy comn en todo el mundo. Obteniendose por seleccin
una variedad adaptada a diferentes regiones, debido a esto el nmero de estudios
sobre morfologa, taxonoma y biometra de Carassius auratus auratus
incrementaron. Las caractersticas mersticas y morfomtricas son encontradas
entre individuos que pertenecen a distintas entidades especficas que usualmente
han sido utilizadas para la diferenciacin de especies, pero se ha reportado que
pueden ser muy variantes. Incluso la diversidad que se puede encontrar en una
sola especie, ya que el esqueleto drmico es particularmente diverso, eso abarca
odontides, dientes y denticulos drmicos, huesos drmicos craneales, placas
drmicas postcraneales y escudos, espinas y rayos de aletas, escamas
elasmoides y ganoides, y los elementos que incluyen los canales de la lnea lateral
o neuromastos (Jean, 2003).

b) Escamas elasmoides

En peces adultos la epidermis est compuesta de varias regiones; el estrato

superficial est compuesto de una sola capa de clulas, la cual provee el color
ornamental externo, con un patrn especfico de cada especie, superficialmente
est cubierta por una abundante cantidad de glicosaminoglicanos los cuales
protegen del roce y del ataque de bacterias, hongos y parsitos. Esta capa externa
no es renovada peridicamente y cada clula es reemplazada individualmente
cuando muere. El estrato intermedio est compuesto de una capa variable de
clulas que incluye clulas glandulares unicelulares productoras de
glicosaminoglicanos, otras productoras de sustancias de alerta y otras productoras
de repelentes txicos. En este estrato podemos encontrar adems clulas
indiferenciadas que sirven de reserva y se dividen cuando es necesario (Manuel
Meruane y Mariana Rojas, 2012).

Los glucosaminoglucanos (GAG) son cadenas de polisacridos constituidas por la

repeticin de unidades de disacridos. Todos ellos, excluyendo el cido
hialurnico, estn unidos covalentemente a protenas, constituyendo los llamados
proteoglucano. Los proteoglucanos son un tipo particular de glucoprotenas, y
antes conocidas como mucoprotenas. Los proteoglucanos son los constituyentes
principales del tejido conectivo (Grases,1995).

La formacin de la escama elasmoidea es la ms comn en la mayora de peces

telesteos, se presenta en lneas horizontales y verticales formando un patrn
regular, se forma sin necesidad de un elemento inicial cartilaginoso. Se desarrollan
en cavidades dentro de la dermis, cada escama consta de 3 capas; primero se
desarrolla la capa externa compuesta por una red de fibras colgenas y tejido
mineralizado, luego se forma la capa basal compuesta de un tejido parcialmente
mineralizado llamado elasmodina y finalmente se forma la capa lmite compuesta
de fibras hipermineralizadas, la mineralizacin de una escama puede observarse
mediante la tcnica de tincin con Rojo de Alizarina (Manuel Meruane y Mariana
Rojas, 2012).

Las escamas de la mayora de los peces telesteos pertenecen al tipo elasmoide,

se cree que las escamas elamoides derivan de los tejidos dentales superficiales
que cubran el tejido de las escamas en peces osteoictros ancestrales, por que las
escamas presentan una unin ectodrmico-drmica (Ibaez, 2009). Las escamas
de los peces se han utilizado para diversos propsitos: siendo los uso ms
frecuentes la edad (Bagenal, 1974) y para interpretar la biodiversidad, presente y
pasada (Shackleton, 1987) y en estudios comparativos y filogentico (Lippitch,
1992; Roerts, 1993).

Otra aplicacin que ha recibido poca atencin es el uso de la forma de la escama

de pece para la morfometra geomtrica (Ibaz, 2008), este estudio se ha
demostrado la efectividad de la escama elasmoide para diferenciar a las especies
y las poblaciones de peces basado en una escama tomada de la regin lateral de
cada pez, por ser la posicin en el cuerpo del pez de la cual las escama se toman
para estudios de envejecimiento (Ibaz, 2009).

Tiiu Mrs y colaboradores en 2015, describen y comparan las morfologas de los

osculos de Pleuronectes platessa Linnaeus, Platichthys flesus trachurus
(Linnaeus) (Pleuronectidae) y Scophthalmus maximus (Linnaeus)
(Scophthalmidae). Las escamas cicloide, los tubrculos y segmentos de la lnea
lateral y las placas articulares giratorias difieren entre las tres especies estudiadas.
Debido a las caractersticas y desarrollo del patrn de las espinas de las escamas,
han sido separadas en un nuevo subtipo, las escalas ctenoides sobrecrescentes
pertenecientes a un tipo general de escalas ctenoides. Se describen dos tipos
diferentes de tubrculos, ctenoides y circuloide, respectivamente para la platija y el
rodaballo. Aunque los osculos difieren en muchos detalles, no estn tan
modificados como los tubrculos circuloides del rodaballo.

c) Tincin del tejido seo

El mtodo original de tincin de esqueleto y cartlago fue de Schltze en 1897,

posteriormente se modific por investigadores, como Mall (1906), Dawson (1926),
Lipman (1935), Cumley, Crow y Griffen (1939), Gamble (1945) y True (1947).
Aunque los pasos empleados incluyen la fijacin en formalina o alcohol, blanqueo
con perxido de hidrgeno, maceracin en hidrxido de potasio, tincin con rojo
alizarina S, y limpieza en concentraciones graduadas de glicerina, algunos
autores han omitido pasos. Tambin se ha encontrado posible omitir la fijacin y
blanqueo para transferir los especmenes directamente de la solucin de tincin a
glicerina sin diluir en las etapas intermedias.

Salaramoli Jamileh y sus colaboradores, en 2015 present un protocolo

modificado para realizar todos los estudios esquelticos en animales de
laboratorio, los aspectos ms importantes fueron la fijacin por etanol, la
maceracin con hidrxido de potasio en muestras de embriones y neonafos, sin
embargo en adultos se fij por formol neutralizado, seguida de etanol y
maceracin de las muestras de tripsina e hidrxido de potasio en etapas
separadas. La cantidad de colorante utilizado para el cartlago y hueso fue
diferente en animales con diferentes edades, por lo tanto los procedimientos de
tincin sea difieren entre embriones y adultos.

La hidroxiapatita es un compuesto cristalino formado por tres molculas de fosfato

del calcio y de una molcula de hidrxido de calcio, haciendo a la hidroxiapatita
un excelente material bioactivo, la cual tiene una gran cantidad de aplicaciones
como la separacin y la purificacin de protenas e implantes de hueso. El
concentrado de la hidroxiapatita es la matriz de calcio de la protena en el hueso
sin procesar, esta sustancia natural contiene el 14% la protena de colgeno y 4%
de otras protenas y aminocidos pequeos (hidroxiprolina, glicina, y cido
glutmico). El calcio abarca entre el 30% de la matriz de la hidroxiapatita y junto a
minerales como zinc, potasio, silicio, manganeso y fierro formando un conjunto
biodisponible activo de calcio.

Marta Elena Londoo y colaboradores, en 2006 realizaron un seguimiento a las

propiedades cristaloqumicas de muestras de hidroxiapatita sinttica tratadas a
diferentes temperaturas, las que se sometieron a solucin fisiolgica de Ringer
durante periodos de 5 y de 30 das. La medicin de la conductividad y el anlisis
de las muestras, permitieron mostrar la gran dependencia de la cristalinidad con el
tratamiento trmico. La muestra ms cristalina se obtuvo a una temperatura de
1050 C. La mayor solubilidad se present en las muestras ms cristalinas;
evidenciando la presencia de dos mecanismos que compiten cuando las muestras
se someten a solucin Ringer: la disolucin y la precipitacin.

Martnez Valencia y colaboradores, en 2008 presentaron un estudio acerca de la

sntesis qumica de hidroxiapatita y del efecto de diferentes rutas de sntesis en las
caractersticas estructurales, morfologa y tamao de partcula. Los resultados
muestran la obtencin de la fase pura de HA en las diferentes rutas de sntesis
seguidas. Los polvos nanocristalinos en todos los casos (Dc < 40 nm), se
presentan como aglomerados submicromtricos con diferentes morfologas, as
como composicin homognea y muy cercana a la estequiomtrica.

Misra en 1992 realiz la interaccin de alizarina roja S (cido 3,4-dihidroxi-9,10-

dioxo-2-antracenosulfnico, sal sdica) con hidroxiapatita, la cual fue estudiada en
una solucin acuosa. Esta interaccin se design como un proceso de adsorcin,
porque elimin la mayor parte del colorante de la solucin acuosa por debajo de
una cierta concentracin. Sin embargo, ya que el anlisis de fsforo en la solucin
mostr un aumento lineal con la cantidad consumida en edad antigua, mientras
que la cantidad de calcio en la solucin, disminuyen los efectos superficiales, la
proporcin del colorante los iones fosfato liberados en la solucin se vuelven
constantes, e iguales a la relacin Ca/P en la apatita.

Hernando Paul y colaboradores en , utilizaron alizarina roja S y la microscopa de

luz ordinaria para detectar fosfato clcico microcristalino o no cristalino, las sales
que se utilizaron en preparaciones de gotas de sinovial fluidos, demostr ser til
en la deteccin de apatita, grumos de cristal y pequeos pirofosfatos de calcio
dihidratados (CPPD) perdidos por la luz polarizada. La tincin fue positiva en el
100% de los fluidos sinoviales de los sujetos demostraron tener apatita o CPPD
Deposicin. Los cristales de apatita y CPPD encontrados en los mismos fluidos.
En adicin, algunos fluidos sinoviales de pacientes con osteoartritis, dilisis por
insuficiencia renal, artritis reumatoide y gota tambin exhibi tincin positiva. La
correlacin de tincin positiva de alizarina roja S con evidencia radiolgica de
osteoartritis sugiere que los cristales de apatita podran relacionados con la
degeneracin del cartlago articular en enfermedades reumticas.

Ponomareva y colaboradores, en 2007 prepararon muestras de hidroxiapatita en

sistemas nitrato de calcio-diamonio hidrgeno Hidrxido de fosfato-amonio-
orgnico con la adicin de alizarina roja S. La participacin de grupos sulfo e
hidroxi de los compuestos orgnicos en la formacin de cristales de hidroxiapatita
se confirm mediante anlisis de fase de rayos X, espectroscopia de infrarrojos,
microscopa electrnica y anlisis elemental.

Frazier y colaboradores en 2008 hicieron la cuantificacin de glicosaminoglicanos:

Una comparacin de HPLC, Carbazol y Alcian, los glicosaminoglicanos (GAG) son
polisacridos lineales que se encuentran en la matriz extracelular y biolgicos
fluidos de animales donde interactan con cientos de protenas y desempean una
variedad de papeles crticos. Muchas funciones biolgicas pueden ser
monitoreadas directamente por su impacto en la cantidad de GAG. As, simple,
sensibles y robustos GAG mtodos de cuantificacin son necesarios para el
desarrollo de biomarcadores. Sistemticamente compararon tres ensayos de
cuantificacin de GAG disponibles que incluan un ensayo basado en HPLC, un
ensayo Alcian Blue simplificado y un ensayo de carbazol miniaturizado. Los
ensayos de carbazol y Alcian Blue fueron reproducibles y simples de realizar en
general laboratorio, pero tena limitaciones importantes: El ensayo de carbazol no
pudo detectar KS y sobrestim GAGs que fueron contaminado con sales o disuelto
en PBS. El ensayo Alcian Blue detect slo aquellos GAGs que fueron sulfatados.
A diferencia de, mientras que el mtodo de HPLC tardaba mucho tiempo, era un
ensayo robusto y sensible que no slo detect todos los GAG sino que tambin
cuantificaron glucosamina-GAGs y galactosamina-GAG simultneamente. El
ensayo de HPLC no se vio afectado por sal o nivel de sulfatacin de GAG y
produjo valores reproducibles para todos los tipos de GAG probados. Estos
resultados sugieren que un ensayo automatizado de HPLC sera generalmente til
para la medicin rutinaria de un panel de biomarcadores basados en GAG
mientras que el ensayo de carbazol y los ensayos Azul de Alciano podran resultar
valiosos para propsitos ms especficos.

Se utiliza comnmente el azul de alciano para la tincin de partes cartilaginosas y

la alizarina roja como indicador de color para las partes seas. El objetivo de este
estudio es contribuir a un mejor conocimiento de biometra de Carassius auratus
auratus, mediante referencias morfomtricas y mersticas, de hidroxiapatita.

MTODO

Se obtuvieron 30 ejemplares de la especie Carassius auratus auratus del mercado

de peces de Mixuca, D.F. Mxico. Los ejemplares se congelaron
aproximadamente por 15min., despus se dividieron en grupos de 5 con 6 peces
cada uno y se colocaron en contenedores de plastico respectivamente con formol.

Obtencin de medidas morfomtricas y mersticas

Se obtuvieron las medidas morfomtricas y meristicas de cada uno de los

individuos con ayuda de un vernier.

Nomenclatura Carcter
Medidas morfomtricas
TL Total length
SL Standard length
BH Body height
HL Head length
POD Preorbital distance
EHD Eye horizontal diameter
IOT Interorbital thickness
PDD Pre-dorsal fin distance
PAD Pre-anal distance
PPD Pre-pectoral distance
PPED Pre-pelvic distance
BLDF Base length of dorsal fin
BLAF Base length of anal fin
LPF Length of pectoral fin
LPEF Length of pelvic fin
CPH Caudal peduncle height
DDA Distance between dorsal and anal fin
DDC Distance between dorsal and caudal fin
DCA Distance between caudal and anal fin
LTSA Length of the third spine of the anal fin
LFSD Length of the first spine of the dorsal fin
DFR Dorsal fin rays
DFS Dorsal fin spines

Medidas mersticas
AFR Anal fin rays
AFS Anal fin spines
VFS Ventral fin spines
VFR Ventral fin rays
SLL Number of superior lateral line scales
ILL Number of inferior lateral line scales
GRUL Number of gill rakers on the upper limb of the first
gill arch on the left side

Obteniendo los siguientes resltados:

No. De pez TL SL BH HL POD EHD IOT PDD PAD PPD PPED BLDF BLAF LPF LPEF CPH DDA DDC DCA LTSA LFSD DFS
1 58.22 39.92 21.24 13.9 3.97 5.15 10.08 20.39 28.87 13.77 23.66 14.17 3.98 9.31 17.35 5.79 23.17 4.05 2.15 3.64 2.37 14.59
2 60.66 44.1 24.56 17.08 4.74 4.37 8.79 23.01 29.09 17.02 24.12 10.39 4.12 9.14 19.21 7.89 24.12 4.45 1.05 4.01 1.74 10.34
3 62.36 40.86 21.91 15.95 3.72 4.37 8.26 23.12 26.39 16.13 24.54 7.33 3.24 11.27 17.81 7.05 25.08 9 2.3 4.01 3.11 9.38
4 66.44 43.57 23.91 14.66 5.01 5.26 5.94 22.98 30.51 17.12 27.83 16.32 2.83 13.08 20.39 7.26 23.95 5.49 3.3 4.01 4.05 12.55
5 70.29 41.04 24.46 15.95 4.01 7.2 9.51 25.04 25.04 14.33 26.71 14.73 3.24 13.5 10.67 9.59 22.97 3.42 4.1 4.01 3.03 12.31
6 62.62 37.03 26.88 15.45 5.34 3.69 7.67 21.98 24.06 15.64 30.09 11.83 2.83 13.1 14.94 7.27 21.32 2.75 2.2 5.15 3.4 12.66
7 65.32 44.97 19.65 18.09 3.23 4 10.95 18.26 38.32 17.75 26.24 16.39 5.26 12.47 12.68 6.13 24.25 7.46 2.38 2.56 2.61 12.51
8 81.91 45.75 19.15 15.3 4.18 3.91 11.13 22.29 39.87 16.66 26.29 18.31 7.17 17.39 11.56 8.87 31.96 5.85 3.49 5.83 3.18 14.11
9 68.88 41.43 23.63 14.81 3.25 4.65 10.06 19.8 36.16 13.64 27.58 20.34 20.82 15.15 18.01 7.81 34.5 5.08 2.55 6.73 4.13 15.6
10 61.02 38.19 25.75 15.97 4.59 4.15 11.05 20.65 37.26 15.6 25.46 14.6 14.55 11.86 10.85 7.68 27.82 6.34 2.07 3 3.87 14.16
11 64.04 35.4 21.14 18.26 4.23 5.44 9.87 19.64 28.32 18.08 26.49 16.3 12.64 11.66 13.09 7.69 32.65 4.77 2.38 3.97 5.44 17.48
12 63.77 40.44 21.93 12.78 3.38 2.81 9.44 18.6 34.43 14.81 23.23 18.11 16.53 9.51 11.06 6.54 28.29 7.24 3.01 5.26 4.38 13.21
13 62.71 39.74 21.63 14.82 3.54 4.17 7.72 20.3 34.81 14.87 23.68 14.26 4.63 12.2 11.02 7.06 20.67 5.04 1.04 6.35 3.49 10.74
14 67.61 46.87 20.98 14.72 4.2 3.53 8.24 22.23 37.52 16.19 24.35 13.58 3.94 10.55 10.12 7.33 18.71 3.45 4.28 7.61 5.19 12.97
15 52.7 31.4 17.59 12.76 3.59 4.55 6.38 19.07 26.79 13.09 21.36 11.04 3.76 9.43 10.78 5.56 15.76 2.38 2.76 8.01 3.19 7.99
16 58.22 38.73 18.12 14.35 3.74 3.42 6.38 18.73 33.38 15.21 20.22 12.61 6.09 11.29 9.87 6.56 19.54 3.23 2.32 5.66 4.25 13.61
17 66.62 36.98 19.52 14.21 3.97 4.89 7.93 21.78 23.85 15.09 23.66 15.61 4.48 13.65 12.21 6.56 20.59 7.25 4.26 4.92 5.75 14.92
18 58.41 34.72 17.39 12.53 2.55 3.68 7.58 17.94 17.72 12.08 22.29 12.97 3.25 10.95 12.97 7.16 17.75 2.84 2.09 6.87 3.06 11.94
19 59.42 36.21 17.66 15.3 3.92 4.54 9.74 19.47 31.12 15.2 21.58 13.47 4.5 12.5 9.72 5.56 18.06 5.49 3.03 7.36 3.03 10.92
20 58 34.5 19.23 14.87 3.75 4.67 9.46 18.5 31.85 14.36 22.13 12.46 3.63 9.55 12.77 6.39 19.85 4.91 3.65 8.67 4.13 11.78
21 67.39 39.72 18.52 16.1 5.1 3.39 10.16 17.94 33.3 15.8 24.5 10.08 4.83 14.11 13.93 8 18.64 8.21 4.83 10.19 2.17 14.4
22 74.36 40.79 23.23 14.77 4.83 5.65 11.14 19.68 35.14 17.2 25.73 13.44 4.27 13.74 10.92 5.52 18.63 4.61 5.46 10.84 3.74 15.92
23 60.06 35.56 18.78 15.5 3.52 4.88 8.69 19.78 28.01 16 21.66 13.01 4.03 12.3 12.55 5.12 18.89 3.84 4.4 10.89 3.15 11.68
24 57.14 35.34 19.51 17.55 3.15 5.02 11.64 19.86 33.14 16.71 23.44 16.99 4.89 11.54 6.34 6.12 20.3 3.73 3.47 8.07 3.42 13.06
25 72.54 44.78 22.73 19.43 5.62 4.65 11.71 24.15 37.41 19.6 26.26 15.42 4.26 11.99 9.35 8.03 22.97 5.23 5.1 10.37 3.86 14.1
26 71.35 38.94 18.83 16.24 3.66 4.61 10.17 21.26 34.53 15.71 24.52 16.85 4.08 15.34 11.89 7.63 21.36 4.56 4.14 8.77 3.68 15.54
27 62.38 33.45 20.31 15.45 4.51 4.25 10.26 19.78 30.51 15.19 23.22 15.67 3.72 12.67 14.19 6.34 21.23 3.41 3.94 10.19 3.58 16.03
28 60.93 34.3 14.56 13.62 3.34 4.21 8.21 16.37 28.64 13.63 19.51 13.57 2.88 10.98 7.27 4.81 14.77 5.22 2.81 11.25 2.94 12.34
29 52.41 28.79 18.79 14.85 4.32 2.66 9.55 17.29 29.74 14.07 21.77 14.57 3.84 13.65 11.67 6.77 18.65 4.09 3.62 11.5 3.72 14.17
30 61.56 38.97 20.64 17.35 3.85 4.66 10.52 21.04 33.99 17.1 23.87 16.05 7.11 12.45 12.42 6.62 21.38 3.87 2.55 8.22 2.88 13.75

Tabla 1. Caractersticas morfomtricas utilizadas para el anlisis de Carassius auratus auratus.

Tincin de esqueleto y cartilago

Para la tincin de esqueleto y cartilago se crearon 5 grupos cada uno con 6

individos, se comenzo introduciendo los grupos en formol y despus se
enjuagaron en agua.

Luego de enjuagar, los grupos pasaron cambios sucesivos de alcohol de forma

ascendiente con concentraciones de 40%, 60%, 80%, 90% y 100%. Terminando la
secuencia de alcohol los grupos se se cambiaron al primer colorante, al azul de
alcian, pasando aproximadamente 24 horas, se cambiaron a otros sucesivo
cambio de alcohol de forma decreciente con concentraciones de 100%, 90%, 80%,
60%, 40% y al finalizar se enjuagaron con agua.
Luego se aplico el segundo colorante, la Alizarina roja durante aproximaamente 48
horas, despus se cambiaron a hidroxido de sodio (NaOH) y se enjuagaron en
agua. Finalizando el enjuague los grupos pasaron a otros sucesivos cambios de
glicerina de forma ascendiente con concentraciones de 40%, 60%, 80% y 100%
respectivamente.

Identificacin de hidroxiapatita

Se recolectaron las escamas de cada uno de los grupos en diferentes

portaobjetos, despus pormedio de microscopia se observaron cada una de las
escamas y se tomaron fotografas.

RESULTADOS

DISCUSION

LITERATURA CITADA