UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLN

PRODUCCIN Y CONTROL DE BIOLGICOS

Reporte

Equipo:
Morales Alvarado Marco Antonio
Ramrez Almazan Julin
Garca Barrera Vanessa

Carrera: Lic. Farmacia

Grupo: 2001

Profesor:
Jonathan Paredes
Victor Hugo Valadez
Introduccin

La inmunidad es un conjunto de mecanismos de defensa frente a agentes externos

extraos. Se adquiere al nacer y va madurando y consolidndose durante los primeros
aos de vida.

La inmunologa es la ciencia biolgica que estudia todos los mecanismos fisiolgicos de

defensa de la integridad biolgica del organismo. Dichos mecanismos consisten
esencialmente en la identificacin de lo extrao y su destruccin. Tambin estudia los
factores inespecficos que coadyuvan a los anteriores en sus efectos finales.

La respuesta inmune es la actuacin integrada de un gran nmero de mecanismos

heterogneos de defensa contra sustancias y agentes extraos. En general, a las
sustancias extraas se las denomina como antgenos, y son ellos los que desencadenan en
el organismo una serie de eventos celulares que provocan la produccin de los
mecanismos de defensa.

Anticuerpos

Un anticuerpo se define como una inmunoglobulina (Ig) capaz de una combinacin

especifica con el antgeno que ha causado su produccin en un animal susceptible. Ellos
son producidos en respuesta a la invasin de molculas forneas en el cuerpo.

Los anticuerpos existen como una o ms unidades en forma de Y, compuesta por cuatro
cadenas polipeptdicas. Cada Y contiene dos copias idnticas de una cadena pesada (HC,
heavy chain), y dos copias idnticas entre s de una cadena ligera (LC, light chain),
llamadas as por sus pesos moleculares relativos que son de aproximadamente 50kDa la
cadena pesada y de cerca de 25kDa la cadena ligera.

Pueden ser divididos en cinco clases: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, basado en el nmero de
unidades Y y en el tipo de cadena pesada. Las cadenas pesadas de IgG, IgM, IgA, IgD e
IgE. La clsica forma Y de un IgG est compuesta de dos variables: brazos antgeno
especfico F(ab), los cuales son crticos para la unin del antgeno, y la cola constante Fc
que sirve como mango para la manipulacin del anticuerpo durante muchos
procedimientos inmunoqumicos. El nmero de regiones Fab en un anticuerpo,
corresponde con su subclase, y determina la valencia del anticuerpo.
Antgeno

La definicin clsica de antgeno es cualquier sustancia fornea que provoca una

respuesta inmune cuando es introducida dentro de tejidos de animales susceptibles y que
son capaces de combinar con los anticuerpos especficos formados.

Los antgenos son generalmente de alto peso molecular y comnmente son protenas o
polisacridos. Polipptidos, lpidos, cidos nucleicos y otras molculas pueden tambin
funcionar como antgenos. La respuesta inmune puede tambin ser generada contra
sustancias pequeas, llamadas haptenos, si estos esta acoplados a una protena
acarreadora, como la albmina de suero bovino (BSA) u otras matrices sintticas. Una
variedad de molculas como drogas, azucares simples, aminocidos, pequeos pptidos,
fosfolpidos o triglicridos pueden funcionar como haptenos. As, dndole suficiente
tiempo, cualquier sustancia fornea ser identificada por el sistema inmune y evocara la
produccin de un anticuerpo especfico. Sin embargo, esta respuesta inmune especfica es
altamente variable y depende mucho en parte del tamao, estructura y composicin de
los antgenos. Los antgenos que elicitan una fuerte respuesta inmune se dice que son
altamente inmunognicos. Las partes de las regiones hipervariables del anticuerpo que
contactan con el antgeno se denominan partopos y la regin de un antgeno que puede
especficamente unirse a un anticuerpo es llamado eptope. Estos son usualmente uno a
seis monosacridos o 5-8 residuos de aminocidos sobre la superficie del antgeno. Debido
a que la molcula de antgeno existe en el espacio, el eptope reconocido por un
anticuerpo puede depender de la presencia de una especfica conformacin
tridimensional del antgeno o el eptope puede corresponder a una regin de una
secuencia primaria simple, as, los eptopes son descritos como conformacionales y
lineares, respectivamente. El rango de posibles sitios de unin es enorme, ya que cada
sitio de unin tiene sus propias propiedades estructurales derivadas de enlaces
covalentes, inicos e interacciones hidroflicas e hidrofbicas. Para que exista una
eficiente interaccin entre el antgeno y el anticuerpo, el eptope debe estar fcilmente
disponible para la unin.

Si la molcula blanco es desnaturalizada, por ejemplo, por la fijacin, cambios de pH o

durante la preparacin para el gel de electrofresis, el eptope puede ser alterado y esto
puede afectar su habilidad para interactuar con un anticuerpo. Por ejemplo, algunos
anticuerpos son inefectivos en un Western blot pero muy bueno en inmunohistoqumica
debido a que en el proceso, un complejo sitio antignico puede ser mantenido en el
tejido, mientras que en el otro procedimiento la preparacin de la muestra altera la
conformacin de la protena lo suficiente para destruir el sitio antignico y as elimina el
sitio de unin con el anticuerpo. 14 Si el producto de un gene de inters esta presente en
concentraciones extremadamente bajas, una opcin puede ser el uso de la informacin de
la secuencia conocida de nucletidos para derivar el correspondiente pptido para
generar anticuerpos especficos para esa secuencia. Caractersticas de un buen antgeno
incluyen:

Areas de estabilidad estructural dentro de la molcula

Un peso molecular mnimo de 8000 a 10000 Daltons, aunque los haptenos con pesos
moleculares tan bajos como 200 Da han sido usados en presencia de protenas
acarreadoras

La habilidad de ser procesado por el sistema inmune

Regiones inmunognicas accesibles al mecanismo formado por el anticuerpo

Elementos estructurales que sean suficientemente diferentes al husped

Para pptidos antgenos, regiones que contengan por lo menos 30% de aminocidos
inmunognicos: K, R, E, D, Q, N

Para pptidos antgenos, significante hidrofobicidad o residuos cargados

Interaccin Antgeno Anticuerpo

Los antgenos y anticuerpos interactan por complementariedad espacial y no por uniones

covalentes. La asociacin especfica del antgeno y el anticuerpo es dependiente del los
puentes de hidrogeno, las interacciones hidrofbicas, fuerzas electrostticas y las fuerzas
de van der Waals; por lo general solo son efectivas en distancias cortas. Todos estos son
uniones dbiles no covalentes, aunque algunas de las asociaciones entre antgeno y
anticuerpo pueden ser bastante fuertes. Al igual que los anticuerpos, los antgenos
pueden ser multivalentes, ambos a travs de mltiples copias del mismo eptope, o a
travs de la presencia de mltiples eptopes que son reconocidos por mltiples
anticuerpos.

Las interacciones que involucran multivalencias pueden producir mayor estabilidad a los
complejos, sin embargo la multivalencia puede tambin resultar en dificultades estricas,
por lo tanto reduciendo la posibilidad de unin. Los haptenos de tamao pequeo en s
son monovalentes en lo que respecta a la reaccin con el anticuerpo. En un experimento
donde se mezcl el hapteno con el anticuerpo en una bolsa de dilisis se mostr que la
combinacin con el anticuerpo era reversible y que el complejo as formado podra
disociarse con facilidad en funcin de la fuerza de unin, a la que denominamos afinidad.

La afinidad describe la fuerza de interaccin entre anticuerpo y antgeno en un solo sitio

antignico. Dentro de cada sitio antignico, la regin variable del anticuerpo interacta a
travs de fuerzas dbiles no covalentes con el antgeno en numerosos sitios. Mientras que
el trmino afinidad describe la unin del anticuerpo a un hapteno monovalente o a un
solo determinante antignico, en la mayora de las circunstancias practicas nos
preocupamos por la interaccin con el antisuero (es decir, el suero proveniente de un
individuo inmunizado) con un antgeno multivalente. El termino empleado para expresar
esta unin es la avidez o afinidad funcional. La avidez es la fuerza con la que el Ac
multivalente se une a un Ag multivalente. Aunque depende de las afinidades individuales
de cada uno de los determinantes individuales de ese antgeno, su valor es mucho mayor
que la suma de afinidades. Pero por otro lado, hay que considerar que los Ag naturales
suelen tener ms de un tipo de determinante antignico. Cuando un antgeno de este tipo
entra en un individuo, ste produce un antisuero, que presenta varios tipos de
anticuerpos, cada uno de ellos dirigidos a un tipo diferente de determinante antignico
del Ag original.

La avidez es quiz una medida ms informativa de toda la estabilidad o la fuerza del

complejo antgeno-anticuerpo. Esto es controlado por tres factores: la afinidad
anticuerpoeptope; las valencias de ambos, antgeno y anticuerpo; y el arreglo estructural
de las partes que interactan. Cuando el anticuerpo y el antgeno pueden formar
complejos multivalentes, la fuerza de interaccin es grandemente incrementada. Estos
factores definen la especificidad del anticuerpo, que es, la probabilidad de que un
anticuerpo particular se una a un preciso eptope del antgeno. Dado que la intensidad de
la reaccin puede cuantificarse por la afinidad o la avidez, relacionaramos la especificidad
de un antisuero con su avidez relativa por los antgenos para los que estn siendo
discriminados.

Al reconocer que un antisuero puede tener una avidez relativamente mayor por un
antgeno que por otro, indicamos que el antisuero despliega una especificidad relativa
ms que absoluta; en la prctica se habla de grados de reactividad cruzada. La reactividad
cruzada se refiere a un anticuerpo o poblacin de anticuerpos unidos a eptopes sobre
otros antgenos. Esto puede ser causado por ambos, por la baja avidez o especificidad del
anticuerpo o por mltiples distintos antgenos que tienen idnticos o muy similares
eptopes. La reactividad cruzada es a veces deseable cuando uno quiere una unin general
a un grupo relacionado de antgenos o cuando se intenta clasificar especies cruzadas
cuando la secuencia del eptope del antgeno no esta muy altamente conservada en la
evolucin. Los aminocidos que forman el sitio de unin del antgeno son derivados de
ambas cadenas, la pesada y la ligera, y corresponden a los aminocidos de las regiones
hipervariables determinadas por la secuencia de la protena. Las regiones hipervariables
son conocidas como las regiones determinantes de la complementariedad o CDRs (por sus
siglas en ingles, complementarity determining regions). Los CDRs son seis, tres de cada
cadena, y estos forman loops discretos anclados y orientados por las estructuras de los
residuos de los dominios variables.

Anticuerpos Monoclonales y Policlonales

Cuando se disea un procedimiento experimental, es importante diferenciar entre

anticuerpos monoclonales y policlonales, ya que estas diferencias son el fundamento de
las ventajas y limitaciones en su uso. Muchos de los anticuerpos usados en tcnicas
inmunoqumicas son producidos por inmunizacin repetida de un adecuado animal, por
ejemplo, conejo, cabra u oveja, con una suspensin del antgeno apropiado. El suero es
tomado en el pico de produccin del anticuerpo. Concentraciones especficas de IgG de
aproximadamente 1 a 10mg/mL de suero pueden ser obtenidas con este mtodo.
Molculas dbilmente antignicas pueden requerir la adicin de un adyuvante, el cual
permite una salida mas lenta del antgeno haciendo que sea mas rpidamente atrapado
por los macrfagos. Molculas pequeas como drogas pueden ser acopladas a estructuras
ms antignicas (protenas acarreadoras) para estimular la respuesta inmune. Una
caracterstica de grandes molculas antignicas es que ellas inducen la activacin de
muchas clulas B productoras de anticuerpos en el animal inmunizado.

Esta mezcla de 18 anticuerpos policlonales resultantes puede entonces reconocer una

variedad de eptopes sobre el antgeno, el cual puede ser una caracterstica de uso
especial en algunos procedimientos experimentales. Debido a que esta mezcla de
anticuerpos policlonales reacciona con mltiples eptopes sobre la superficie del antgeno,
ellos pueden ser ms tolerantes de cambios menores en el antgeno, por ejemplo,
polimorfismo, heterogeneidad de glicosilacin o ligera desnaturalizacin, que los
anticuerpos monoclonales (homogneos). Dependiendo del antgeno que se haya usado
para crear el anticuerpo, uno puede usar anticuerpos policlonales para identificar
protenas de alta homologa con la protena inmunognica o para escoger de la protena
blanco en muestras de tejido de otras especies que el inmungeno. A lo largo de la misma
lnea, esto es especialmente importante cuando se trabaja con anticuerpos policlonales
instruirse acerca del inmungeno que ha sido usado para la produccin del anticuerpo
policlonal y el potencial para indeseables reacciones cruzadas dentro de la misma
muestra. Pptidos inmunognicos son frecuentemente usados para generar anticuerpos
policlonales que centran un nico eptope, especialmente para familias de protenas de
alta homologa.
Algunos usos de las propiedades de anticuerpos policlonales son:

Los anticuerpos policlonales frecuentemente reconocen mltiples eptopes hacindolos

ms tolerantes a pequeos cambios en la naturaleza del antgeno. Son frecuentemente la
opcin preferida para la deteccin de protenas desnaturalizadas.

Pueden ser generados en una variedad de especies, incluyendo conejos, cabras, ovejas,
asnos, gallinas y otros, dndole al usuario muchas opciones en el diseo experimenta.

Los anticuerpos policlonales son a veces usados cuando la naturaleza del antgeno en
una especie no estudiada no se conoce.

Los anticuerpos policlonales se une a mltiples eptopes y as ellos generalmente

proveen una deteccin ms robusta.

Algunos usos y propiedades de anticuerpos monoclonales son:

Debido a su especificidad, los anticuerpos monoclonales son excelentes como

anticuerpos primarios en un ensayo, o para detectar antgenos en un tejido y
frecuentemente dan significativamente menos tincin de fondo que los anticuerpos
policlonales.

Cuando se compara con los anticuerpos policlonales, la homogeneidad de los

anticuerpos monoclonales es muy alta. Si las condiciones experimentales se mantienen
constantes, los resultados provenientes de anticuerpos monoclonales son altamente
reproducibles entre experimentos.

La especificidad de los anticuerpos monoclonales los hacen extremadamente eficientes

para la unin al antgeno dentro de una mezcla de molculas relacionadas, como para el
caso de la purificacin por afinidad

Moraxella catarrhalis

es una bacteria gram negativa, aerbica, oxidasa positiva con forma de diplococos que
puede colonizar y causar infeccin del tracto respiratorio en humanos. En 1905 fue aislado
de nios con bronquitis y bronconeumona, (MH, 1905) pero al identificarse en
nasofaringe de personas sin enfermedad, se puso en duda su potencial como patgeno; la
probabilidad del contagio es mayor a travs del contacto con fluidos de pacientes
enfermos y por va area. Este microrganismo se encuentra colonizando el tracto
respiratorio en humanos y varios animales (puerco, cabra y conejo). En los ltimos veinte
aos se ha identificado como germen causal en una diversidad de procesos infecciosos
como otitis media, sinusitis, conjuntivitis, bronconeumona, tos persistente, laringitis y
queratitis. Se ha demostrado que la colonizacin por M. catarrhalis se establece a edades
muy tempranas y disminuye paulatinamente hacia la edad adulta.

Objetivo General

Produccin de anticuerpos IgG, apartir de una inoculacin de Moraxella catarrhalis

en un biolgico (conejo)

Objetivos Especficos

Reducir el costo de la prueba comn por aglutinacin utilizando como sitio de

unin del Ac una cepa de Staphylococcus aureus.
Acondicionar los productos biolgicos de forma que puedan ser administrados a un
paciente,
Optimizar el diagnstico de Moraxella catarrhalis en pacientes con etapa
Patognico subclnico, Prodrmico y Clnico.
Elaborar una prueba especfica para Moraxella catarrhalis por el mtodo de
aglutinacin.

Justificacin
Debido a la gran incidencia de pacientes con diagnsticos de enfermedades asociadas con
la bacteria, es importante la identificacin temprana de la infeccin mediante una prueba
econmica y rpida para su tratamiento oportuno.

Metodologa
Aislamiento e Identificacin de cepa

Se resembr la cepa Moraxella catarrhalis en 5 cajas Petri con agar chocolate y se

incubaron por 24 horas a 27 C. Posteriormente se realiz la identificacin mediante
Tincin de Gram y morfologa.

Inactivacin de la bacteria

La muestra de la bacteria se disolvi en 4 tubos de ensayo con solucin salina

estandarizando el preparado a 0.5 segn los estndares de turbidez McFarland y se
conservaron 2 tubos con la bacteria viva, posteriormente, los ltimos dos tubos se
llevaron a 60C en bao Mara durante 30 minutos para obtener microorganismos
atenuados.

Inmunizacin

Los microorganismos vivos se inyectaron a 3 conejos machos adultos de raza Nueva

Zelanda subcutneamente cada 2 das, y los atenuados se inyectaron por va intravenosa
cada 4 da durante un perodo de 2 semanas. Las dosis de inmunizacin se incrementaron
gradualmente de 0,5 a 2,0 mL. Se repiti el procedimiento una vez ms dos semanas
despus de la ltima inyeccin de la primera serie.

Obtencin de Anticuerpos

Los conejos se sacrificaron extrayendo la sangre.

Se realizaron varias centrifugaciones con el objetivo de separar el suero, hasta quedar
completamente libre de cualquier sedimento.
se utilizo sulfato de amonio, para precipitar las globulinas que no son solubles en agua y
para diferenciarlas de las glbulos rojos utilizando un termo agitador durante 1 hora
aproximadamente.
se prepararo una solucin buffer a pH 7 para mantener las condiciones aptas del las
protenas aisladas
realizamos una filtracin con filtro heppa.
se inactivo Staphylococcus aureus cowan I por medio de bao maria durante 45
minutos, ya que es inductor potente y consistente de IgG para que el anticuerpo quede
dentro de la capsula de mencionada bacteria y forme un complejo

Aglutinacin

*Agregamos , en el espacio positivo (+) bacteria viva, estandarizada con el

nefelmetro de mc farland 0.5 y anticuerpos IgG.

*En el segundo pozo es una prueba negativa solo agregando anticuerpos IgG.

*Tercer pozo bacteria gram positiva

*Cuarto pozo bacterias gram positiva

Cronograma

Resultados

Ilustracin 1 prueba de aglutinacin

 Ilustracin 2 aglutinacin positiva Anticuerpo-Antgeno

Anlisis de Resultados
la aglutinacin fue positiva ya que los anticuerpos son selectivos de acuerdo al antgeno
en las dems priebas todas fueron negativas tanto en los Gram (+) como en los Gram (-).
Se trata de la inmunoglobulina predominante en los fluidos internos del cuerpo, como son
la sangre, el lquido cefalorraqudeo y el lquido peritoneal (lquido presente en la cavidad
abdominal). Esta protena especializada es sintetizada por el organismo en respuesta a la
invasin de bacterias, hongos y virus. Es la inmunoglobulina ms abundante
del suero, con una concentracin de 600-1800 mg por 100 mL.1 La IgG constituye el 80 %
de las inmunoglobulinas totales. Su tiempo de vida media es de aproximadamente 25 das

La clsica forma Y de un IgG esta compuesta de dos variables: brazos antgeno especfico
F(ab), los cuales son crticos para la unin del antgeno, y la cola constante Fc que sirve
como mango para la manipulacin del anticuerpo durante muchos procedimientos
inmunoqumicos. El nmero de regiones Fab en un anticuerpo, corresponde con su
subclase, y determina la valencia del anticuerpo (el nmero de brazos con el que el
anticuerpo puede unirse al antgeno
Mientras que el entrecruzamiento de los antgenos proteicos multivalentes con el
anticuerpo

produce una precipitacin, la interrelacin entre clulas o partculas de gran tamao con
los anticuerpos dirigidos contra los antgenos de superficie conducen a una aglutinacin.
Dado que la mayora de las clulas poseen cargas elctricas, se requiere una cantidad
razonable de anticuerpos entre dos clulas antes de que se supere la repulsin mutua

Dado que los antgenos y anticuerpos se definen por sus interacciones mutuas, uno de
ellos puede utilizarse para cuantificar al otro. Si disponemos de una solucin de un
anticuerpo 20 monoclonal, podemos definir su afinidad y especificidad con considerable
confiabilidad y, si est en estado puro y en su conformacin nativa, conoceremos que la
concentracin de anticuerpos es la misma que la de la inmunoglobulina, en mg/mL u otra
unidad. Cuando se determina el contenido de anticuerpos en un antisuero, el problema es
diferente debido a que la fraccin inmunoglobulina esta compuesta de una serie enorme
de molculas en cantidades y afinidades variables.

Los sueros pueden compararse de acuerdo con su contenido de anticuerpos, ya sea por la
determinacin de cuantos anticuerpos se unen al antgeno en una dilucin fija del suero o
por la comprobacin de una dilucin seriada del suero para comprobar a que nivel una
cantidad estndar de antgeno es suficiente para dar un resultado positivo de la unin.
ste es denominado titulo de anticuerpos. Para tomar un ejemplo, un suero podra
diluirse, digamos, 10,000 veces y aun dar una prueba de aglutinacin positiva. Este titulo
de 1:10,000 permite realizar una comparacin con otro suero mucho ms dbil que solo
posea un titulo, digamos 1:100. Ntese que el ttulo de un suero dado variar de acuerdo
con la sensibilidad de la prueba, ya que se necesitan cantidades mucho ms pequeas de
anticuerpos para unirse al antgeno cuando la prueba posee una alta sensibilidad, como la
aglutinacin, que en el caso de una prueba de baja sensibilidad, como la precipitacin, la
cual requiere concentraciones altas del producto antgeno-anticuerpo. Existen diversos
mtodos basados en procedimientos distintos para visualizar la unin Ag-Ac.
Conclusin

Las opciones de tratamiento incluyen tratamiento antibitico o el abordaje mediante

tratamiento expectante. La gran mayora de los aislamiento de casos clnicos de este
organismo producen beta-lactamasas y son resistentes a penicilina. Se ha reportado
resistencia a trimetoprima, Trimetoprim-sulfametoxazol (TMP-SMZ) y tetraciclina. Es
susceptible a quinolonas, la mayora de las cefalosporinas, de 2. y 3.
generacin, eritromicina y amoxicilina-clavulanato.

es importante establecer otro mtodo de prevencin y de eliminacin de bacteria

moraxella, ya que con el consumo prolongado de antibiticos es comn que ciertos
microorganismo se conviertan inmunes, a estos tipos de medicamentos, por lo cual se
utilizan nuevos procesos como la aglutinacin para poder detectar microorganismos con
las pruebas correspondentes