BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Bakteri memiliki beberapa macam bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, dan spirilum.
Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk
basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus
dibagi menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya
dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung.
Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri
itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Mikroorganisme yang ada di alam ini
mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri
yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut
disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk
diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi
untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui
serangkaian pengecatan.
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari
bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena
adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdasarkan
adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Teknik Pewarnaan
bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan
dasar yang berlaku.

Setiap sel terdiri dari berbagai bahan kimia. Setiap sel akan menunjukkan susunan
kimiawi yang spesifik. Sebagai contoh, bakteri Gram negatif memiliki lipopolisakarida dalam
dinding selnya, Sedangkan bakteri Gram positif tidak. Sebaliknya pada banyak bakteri Gram
positif terdapat asam teikoat. Bahan kimia ini tidak ditemukan pada gram negatif. Karakteristik
utamanya adalah tebalnya lapisan peptidoglikan pada dinding sel. Akibatnya, pada saat
prosedur pewarnaan Gram, meninggalkan warna biru. Dinding sel Gram positif biasa
ditemukan pada Actinobacteria dan Firmicutes. Tidak seperti dinding sel Gram positif, dinding
sel Gram negatif memiliki lapisan peptidoglikan yang tipis. Hal ini menyebabkan lunturnya
warna biru/merah muda saat disiram etanol.
Uji biokimiawi bakteri adalah salah satu uji yang dilakukan untuk mengidentifikasi
jenis bakteri. Hal ini karena setiap jenis bakteri memiliki sifat biokimia yang berbeda. Secara
morfologis, biakan maupun sel bakteri yang berbeda dapat tampak serupa. Karena itu ciri
fisiologis atau biokimiawi merupakan kriteria yang amat penting di dalam identifikasi
spesimen yang tidak dikenal. Tanpa hasil pengamatan fisiologis yang memadai mengenai
organisme yang diperiksa maka penentuan spesiesnya tidaklah mungkin dilakukan. Manusia
tidak dapat melihat dan mengidentifikasi bakteri tanpa diadakan percobaan.
Sifat metabolisme bakteri dalam uji biokimia biasanya dilihat dari interaksi metabolit-
metabolit yang dihasilkan dengan reagen-reagen kimia. Kemampuan bakteri menggunakan
senyawa tertentu sebagai sumber karbon dan sumber energiyang dapat digunakan untuk
identifikasi.Identifikasi Bakteri dapat dilakukan dengan beberapa uji antara lain uji dalam
melakukan fermentasi, uji oksidase, produksi katalase, uji motilase dan uji oksidase.
Bakteri di alam memiliki karakteristik sifat yang berbeda-beda. Bakteri ada yang
bersifat motil, bereaksi dengan enzim katalase, bersifat oksidatif maupun fermentatif dan lain
 sebagainya. Tiap bakteri juga memiliki sifat kimiawi berbeda. Berdasar dari hal tersebut diatas,
maka diadakanlah praktikum Uji Biokimiawi Bakteri ini guna memberikan pemahaman
kepada kita tentang hal-hal yang berkaitan dengan sifat-sifat biokimiawi bakteri serta
menambah pengetahuan dan keterampilan kita dalam mengenal karakter berbagai jenis bakteri.

1.2 Rumusan Masalah.

1.2.1 Identifikasi Bakteri dengan Pewarnaan.

1. Apa saja jenis-jenis pewarnaan pada kuman ?

2. Bagaimana langkah-langkah pembuatan preparat oles dan teknik pewarnaan pada kuman ?
3. Apa perbedaan dari bakteri gram negatif dengan bakteri gram positif ?

1.2.2 Morfologi Koloni dan Uji Biokimia

1. Apa sifat morfologi yang ditunjukkan koloni kuman ?

1.3 Tujuan Praktikum

1.3.1 Identifikasi Bakteri dengan Pewarnaan.

1. Mahasiswa mengenal macam-macam pewarnaan pada kuman

2. Mahasiswa dapat melakukan langkah-langkah pembuatan preparat oles dan teknik pewarnaan
pada kuman.
3. Mahasiswa dapat mengetahui perbedaan bakteri gram negatif dan bakteri gram positif.

1.3.2 Morfologi Koloni dan Uji Biokimia.

1. Mahasiswa memahami sifat morfologi yang ditunjukkan koloni kuman.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan pewarnaan

terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas. Pada umumnya bakteri bersifat tembus cahaya,
hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang tidak mempunyai zat warna. Tujuan dari
pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri, memperluas ukuran
jazad, mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri, dan melihat reaksi jazad terhadap
pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat diketahui (Hadiutomo.
1990).
 Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884.
Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan
bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut.
Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga
pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding
sel seperti Mycoplasma sp (Waluyo, 2004).
Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan
umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam : Biakan muda). Bila
digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan penyimpanan hasil pewarnaan gram. Pada biakan
tua, banyak sel mengalami kerusakan pada dinding-dinding selnya. Kerusakan pada dinding
sel ini menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan larutan pemucat. Ini berarti
bahwa bakteri gram positif dengan dinding sel yang rusak tidak lagi dapat mempertahankan
crystal violet sehingga terlihat sebagai bakteri gram negatif. Umumnya zat warna yang
digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan negatif
dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat
pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung warna adalah ion positif maka
zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion yang mengandung warna adalah ion
negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna negatif (Hadiutomo. 1990).
Zat warna yang digunakan dalam pewarnaan bersifat basa dan asam. Pada zat warna
basa bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut disebut kromofor dan memiliki
muatan positif. Sebaliknya, pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna
mempunyai muatan negatif zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif
banyak ditemukan di dinding sel, membran sel dan sitoplasma, sewaktu proses pewarnaan
muatan positif pada zat warna basa akan berkaitan dengan muatan negatif dalam sel, sehingga
mikroorganisme lebih jelas terlihat (Dwidjoseputro.1998).

Zat warna asam yang bermuatan negatif lazimnya tidak digunakan untuk mewarnai
mikroorganisme, namun biasanya dimanfaatkan untuk mewarnai latar belakang sediaan
pewarnaan. Zat warna asam yang bermuatan negatif ini tidak dapat berkaitan dengan muatan
negatif yang terdapat pada struktur sel. Kadangkala zat warna negatif digunakan untuk
mewarnai bagian sel yang bermuatan positif, perlu diperhatikan bahwa muatan dan daya ikat
zat warna terhadap struktur sel dapat berubah bergantung pada pH sekitarnya sewaktu proses
pewarnaan (Dwidjoseputro.1998).

Prosedur pewarnaan yang menghasilkan pewarnaan mikroorganisme disebut

pewarnaan positif dalam prosedur pewarnaan ini dapat digunakan zat warna basa yang yang
bermuatan positif maupun zat warna asam yang bermuatan negatif. Sebaliknya pada pewarnaan
negatif latar belakang disekeliling mikroorganisme diwarnai untuk meningkatkan kontras
dengan mikroorganisme yang tak berwarna. Pewarnaan mencakup penyiapan mikroorganisme
dengan melakukan preparat ulas (Dwidjoseputro.1998)

Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek. Ulasan ini
kemudian difiksasi. Jumlah bakteri yang terdapat pada ulasan haruslah cukup banyak sehingga
dapat terlihat bentuk dan penataanya sewaktu diamati. Kesalahan yang sering kali dibuat adalah
menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat terutama bila suspensi tersebut berasal dari
bukan media padat. Sebaliknya pada suatu suspensi bakteri bila terlalu encer, maka akan
diperoleh kesulitan sewaktu mencari bakteri pada preparatnya (Sutedjo.1991).

Untuk pewarnaan yang mengamati morfologi sel mikroorganisme maka seringkali

setelah pembuatan preparat ulas dilakukan fiksasi diikuti oleh pewarnaan. Fiksasi dapat
 dilakukan dengan cara melewatkan preparat diatas api atau merendamnya dengan metanol.
Fiksasi digunakan untuk :
1. Mengamati bakteri oleh karena sel bakteri lebih jelas terlihat setelah diwarnai
2. Melekatkan bakteri pada glass objek
3. Mematikan bakteri

Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk
meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Lazim, prosedur pewarnaan
ini menggunakan zat warna basa seperti crystal violet, biru metilen, karbol fuchsin basa,
safranin atau hijau malakit. Kadang kala digunakan zat warna negatif untuk pewarnaan
sederhana : zat warna asam yang sering digunakan adalah nigrosin dan merah kongo. Prosedur
Pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering digunakan untuk
melihat bentuk ukuran dan penataan pada mikoorganisme bakteri pada bakteri dikenal bentu
yang bulat (coccus), batang (basil), dan spiral. Dengan pewarnaan sederhana dapat juga terlihat
penataan bakteri. Pada coccus dapat terlihat pewarnaan seperti rantai (stertococcus), buah
anggur ( staphylococcus), pasangan (diplococcus), bentuk kubus yang terdiri dari 4 atau 8
(saranae) (Lay.1994).

Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat basa, tetapi mudah
dilihat dengan pewarnaan negatif, pada metode ini mikroba dicampur dengan tinta cina atau
nigrosin, kemudian digesekkan diatas kaca objek.Zat warna tidak akan mewarnai bakteri, akan
tetapi mewarnai lingkungan sekitar bakteri. Dengan mikroskop mikroba akan terlihat tidak
berwarna dengan latar belakang hitam (Lay.1994).
Sel terdiri dari berbagai bahan kimia. Bila sel mikroba diberi perlakuan kimiawi, maka
sel ini memperlihatkan susunan kimiawi yang spesifik. Sifat kimiawi pada susunan sel bakteri,
mencakup kepada :
1. Membran Sel Prokariotik
Pada beberapa bakteri, membran mengelilingi sitoplasma tanpa menunjukkan adanya lipatan.
Membran pada bakteri lain mengalami pelipatan ke dalam yang disebut mesosom. Pada bakteri
fotosintetik, klorofil tidak terdapat dalam suatu kloroplas, melainkan terdapat dalam membran
yang sangat berlipat-lipat di dalam sel, yang disebut membran tilakoid. Sistem fotosintetik pada
bakteri disamping menggunakan klorofil, juga karotenoid. Keduanya mengandung sistem
transport elektron yangmenghasilkan ATP pada proses fotosintesis.
2. Dinding Sel
Dinding sel bakteri bersifat agak elastis dan tidak bersifat permeable terhadap garam dan
senyawa tertentu dengan berat molekul rendah. Secara normal konsentrasi garam dan gula yang
menentukan tekanan osmotik di dalam sel lebih tinggi daripada di luar sel. Apabila tekanan
osmose di luar sel naik, air sel akan mengalir keluar, protoplasma mengalami pengkerutan, dan
membran akan terlepas dari dinding sel. Proses ini disebut denganplasmolisis. Dinding sel
bakteri gram positif: Dinding sel bakteri gram positif terdiri 40 lapis rangka dasar murein,
meliputi 30-70 % berat kering dinding sel bakteri. Senyawa lain penyusun dinding sel gram
positif adalah polisakarida yang terikat secara kovalen, dan asam teikoat yang sangat spesifik.
Dinding sel bakteri gram negatif: Dinding sel bakteri gram negatif hanya terdiri atas satu lapis
rangka dasar murein, dan hanya meliputi + 10% dari berat kering dinding sel. Murein hanya
mengandung diaminopemelat, dan tidak mengandung lisin. Di luar rangka murein tersebut
terdapat sejumlah besar lipoprotein, lipopolisakarida, dan lipida jenis lain. Senyawa-senyawa
ini merupakan 80 % penyusun dinding sel. Asam teikoat tidak terdapat dalam dinding sel ini.
3. Flagel dan Pili
Flagel merupakan salah satu alat gerak bakteri. Letak flagel dapat polar, bipolar, peritrik,
maupun politrik. Flagel mengakibatkan bakteri dapat bergerak berputar. Penyusun flagel
adalah sub unit protein yang disebut flagelin, yang mempunyai berat molekul rendah. Ukuran
flagel berdiameter 12-18 nm dan panjangnya lebih dari 20 nm. Pada beberapa bakteri,
permukaan selnya dikelilingi oleh puluhan sampai ratusan pili, dengan panjang 12 nm. Pili
disebut juga sebagai fimbrae. Sex-pili berperan pada konjugasi sel. Pada bakteri Escherichia
coli strain K-12 hanya dijumpai 2 buah pili.
5. Kapsul dan Lendir
Beberapa bakteri mengakumulasi senyawa-senyawa yang kaya akan air, sehingga membentuk
suatu lapisan di permukaan luar selnya yang disebut sebagai kapsul atau selubung berlendir.
Fungsinya untuk kehidupan bakteri tidak begitu esensial, namun menyebabkan timbulnya sifat
virulen terhadap inangnya. Keberadaan kapsul mudah diketahui dengan metode pengecatan
negatif menggunakan tinta cina atau nigrosin. Kapsul akan tampak transparan diantara latar
belakang yang gelap. Pada umumnya penyusun utama kapsul adalah polisakarida yang terdiri
atas glukosa, gula amino, rhamnosa, serta asam organik seperti asam piruvat dan asam asetat.
Ada pula yang mengandung peptida, seperti kapsul pada bakteri Bacillus sp. Lendir merupakan
kapsul yang lebih encer. Adakalanya kapsul bakteri dapat dipisahkan dengan metode
penggojokan kemudian diekstrak untuk menghasilkan lendir.
Selain melalui struktur sel, kita juga dapat mengidentifikasi bakteri berdasarkan sifat
kimiawi melalui proses pewarnaan. Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang
salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif.
Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya
dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai
dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan
basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika
warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah
methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Sedangkan anionnya pada umumnya adalah
Cl-, SO4 -, CH3COO-, COOHCOO. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat
bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah
bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor
seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna
penutup. Pada bakteri gram positif menunjukkan warna biru ungu dan bakteri gram negatif
berwarna merah.
Sekali sitoplasma terwarnai, maka sel-sel organisme seperti mikobakteri menahan zat
warna tersebut dengan erat, artinya tidak terpucatkan sekalipun oleh zat yang bersifat keras
seperti asam alkohol (yaitu 3% HCL dalam etanol 95%). Alkohol asam ini merupakan pemucat
yang sangat intensif dan jangan dikelirukan dengan alkohol-aseton yang banyak digunakan
dalam prosedur pewarnaan Gram. Kondisi pewarnaan ini, organisme yang dapat menahan zat
warna itu dikatakan tahan asam dan tampak merah. Bakteri biasa yang dindingnya tidak
bersifat terlampau lipoidal, pewarna karbol fuksin yang mewarnai sel dapat dengan mudah
dipucatkan oleh alkohol-asam dan karenanya dikatakan tak tahan asam. Tercucinya karbol
fuksin dapat diperagakan oleh terserapnya pewarna tandingan biru metilen oleh sel, sehingga
bakteri tersebut tampak biru (Hadioetomo, 1993).

Berikut adalah pengujian yang dapat dilakukan kepada bakteri :

1. Uji Biokimia

a. Uji oksidasi fermentasi

Uji oksidatif- fermantatif digunakan untuk menguji metabolisme bakterioksidatif atau
fermentatif. Proses oksidasi terjadi didalam tabung oleh organismeaerob dan proses fermentasi
oleh organisme anaerob. Proses fermentasi glukosa akan diubah menjadi glukosa G-Phospat
yang kemudian dirombak menjadi asam piruvat dan oksidase akan merubah glukosa menjadi
asam piruvat

b. Uji motilitas
Motilitas bakteri adalah suatu gerakan bakteri yang disebabkan adanya gerak aktif dan
pasif. Gerak aktif adalah gerakan bakteri yang disebabkan karena bakteri memiliki
flagel. Gerak pasif disebabkan karena faktor dari luar (gerak brown). Gerak brown adalah suatu
gerakan yang dapat menggetarkan partikel-partikel secara acak atau terarah karena terus-
menerus terkena pukulan molekul-molekul kecil yang tak terlihat yang terdapat dalam
cairan.Motilitas dapat diamati dengan baik pada biakan yang masih baru. Pada biakan yang
sudah lama,bakteri sudah mati, sehingga sangat sukar untuk mendapatkan sel yang motil, selain
itu produksi asam dan produk yang bersifat racun dapat menyebabkan hilangnya motalitas sel
bakteri pada biakan (Volk, 1988).

Menurut Taringan (1988) beberapa bakteri dapat melakukan gerakan meluncur yang
sangat mulus yang hanya terjadi kalau persentuhan dengan benda padat. Kebanyakan bakteri
yang motil dapat mendekati atau menjauhi berbagai senyawa kimia yang disebut kemotaksis.

c. Uji katalase
Uji katalase digunakan untuk mengetahui aktivitas katalase pada bakteri yang diuji.
Kebanyakan bakteri memproduksi enzim katalase yang dapat memecah H2O2 menjadi H2O
dan O2. Enzim katalase diduga penting untuk pertumbuhan aerobik karena H2O2yang dibentuk
dengan pertolongan berbagai enzim pernafasan bersifat racun terhadap sel mikroba.
 2. Hidrogen peroksida dan paraffin

Hidrogen peroksida dengan rumus kimia H2O2 ditemukan oleh Louis Jacques Thenard
di tahun 1818. Senyawa ini merupakan bahan kimia anorganik yang memiliki sifat oksidator
kuat. Bahan baku pembuatan hidrogen peroksida adalah gas hidrogen (H2) dan gas oksigen
(O2). Teknologi yang banyak digunakan di dalam industri hidrogen peroksida
adalah auto oksidasi Anthraquinone. H2O2 tidak berwarna, berbau khas agak keasaman, dan
larut dengan baik dalam air. Dalam kondisi normal (kondisi ambient), hidrogen peroksida
sangat stabil dengan laju dekomposisi kira-kira kurang dari 1% per tahun.
Mayoritas pengunaan hidrogen peroksida adalah dengan memanfaatkan dan merekayasa
reaksi dekomposisinya, yang intinya menghasilkan oksigen. Pada tahap produksi hidrogen
peroksida, bahan stabilizer kimia biasanya ditambahkan dengan maksud untuk menghambat
laju dekomposisinya. Termasuk dekomposisi yang terjadi selama produk hidrogen peroksida
dalam penyimpanan. Selain menghasilkan oksigen, reaksi dekomposisi hidrogen peroksida
juga menghasilkan air (H2O) dan panas. Reaksi dekomposisi eksotermis yang terjadi adalah
sebagai berikut:

H2O2 ----> H2O + 1/2O2 + 23.45 kcal/mol

Faktor-faktor yang mempengaruhi reaksi dekomposisi hidrogen peroksida adalah:

o Bahan organik tertentu, seperti alkohol dan bensin
o Katalis, seperti Pd, Fe, Cu, Ni, Cr, Pb, Mn
o Temperatur, laju reaksi dekomposisi hidrogen peroksida naik sebesar 2.2 x setiap kenaikan
10oC (dalam range temperatur 20-100oC)
o Permukaan container yang tidak rata (active surface)
o Padatan yang tersuspensi, seperti partikel debu atau pengotor lainnya
o Makin tinggi pH (makin basa) laju dekomposisi semakin tinggi
o Radiasi, terutama radiasi dari sinar dengan panjang gelombang yang pendek
Hidrogen peroksida bisa digunakan sebagai zat pengelantang atau bleaching agent pada
industri pulp, kertas, dan tekstil. Senyawa ini juga biasa dipakai pada proses pengolahan limbah
cair, industri kimia, pembuatan deterjen, makanan dan minuman, medis, serta industri
elektronika (pembuatan PCB).
Parafin, merupakan hidrokarbon jenuh dengan rantai terbuka dan merupakan senyawa
alkana. Parafin adalah campuran senyawa hidrokarbon alkana yang mengandung 21-50 atom
karbon. Ketika pemisahan residu minyak bumi, jumlah atom karbon pada lilin parafin berkisar
40-50 atom. Komposisi dari setiap anggota senyawa alkana tersebut menyesuaikan dengan
rumus CnH2n+2, yang mana n adalah jumlah atom karbon dalam molekul. Di antara anggota
dari senyawa yaitu metana (CH4); etana (C2H6); propana, (C3H8); dan butana, (C4H10).

Seluruh anggota senyawa alkana adalah anreaktif; yaitu, mereka tidak bereaksi siap pada
temperatur biasa dengan seberapa bahan reaksi seperti asam, alkali, atau pembuat proses
oksidasi. Pertama, empat anggota senyawa memasang gas pada temperatur dan tekanan biasa;
anggota intermediate (setara) adalah mencairkan; dan anggota lebih berat adalah semipadat
atau padat. Petroleum mengandung sekumpulan variasi hidrokarbon dan beberapa produk
petroleum seperti bensin, minyak tanah, minyak bakar berat, minyak pelumas, vaselin, dan
parafin berisi terutama dari campuran hidrokarbon parafin, yang terbentang dari anggota cair
yang lebih ringan ke anggota yang padat. Parafin adalah suatu campuran dari hidrokarbon yang
dipenuhi massa molekular yang tinggi, diproduksi selama penyulingan dari minyak/petroleum.

Bakteri memiliki sifat-sifat yang berbeda satu sama lain, berikut ini akan dijelaskan sifat-sifat
dari bakteri :

1. Bakteri Fototrofik
Bakteri ini dicirikan memiliki Bacterioklorofil, sehingga dapat melakukan fotosintesis.
Bentuk : bulat, batang, vibrio atau spiral. Gram negative. Reproduksinya dg pembelahan biner.
Bergerak dengan flagella atau non motil. Habitat lingkungan aquatic.

2. Bakteri Luncur
Kelompok ini diwakili oleh beberapa tipe yang tidak umum. Myxobacteriales
(miksobacter) menghasilkan apa yang disebut tubuh buah terdiri dari lendir dan sel. Sel
individu dapat meluncur pada permukaan padat tetapi tidak punya flagella. Contoh lain
Cytophagales, memperlihatkan gerakan meluncur.Bentuk: batang, bola atau filament. Gram
negative. Sel-sel dapat terbenam dalam lendir. Habitat: tanah, sisa bahan tumbuhan membusuk,
lingkungan aquatic.

3. Bakteri Berselongsong
Sel terbungkus dalam selongsong yang terbuat dari deposit senyawa, senyawa besi dan
mangan yang tak larut. Bentuk: batang atau seperti filament. Gram negative. Bergerak dengan
flagella atau non motil.Beberapa membentuk pelekap /dasar penghisap untuk menempelkan
diri pada permukaan. Habitat lingkungan aquatic dan lumpur.

4. Bakteri Kuncup dan atau Berapendiks

Sel dengan prosteka atau pelekap. Reproduksi dengan berkuncup atau membelah.
Bentuk sel: bola, oval, batang dengan ujung meruncing, beberapa menunjukkan pertumbuhan
sepertii hifa. Motil karena flagella kutub atau non motil. Habitat: tanah dan lingkungan aquatic.

5. Spiroket
Sel langsing lentur berpilin (dinding tak kaku). Banyak spesies gram negative.
Perbanyakan dengan Pembelahan melintang. Motil karena rotasi cepat sepanjang sumbu
panjang spiralnya ataupun karena lenturan sel-selnya, gerak obeng. Habitat: Saprofit: tanah,
lingk. Aquatic sedang yang parasit hidup di jaringan atau organ vascular pada tubuh termasuk
daerah genital dan system saraf pusat pada manusia dan hewan. Contoh:Treponema
pallidum penyebab penyakit sifilis.

6. Bakteri Spiral dan Lengkung

Bentuk batang berpilin( coma) beberapa dengan satu atau lebih putaran
lengkap (dinding sel kaku). Gram negative. Motil karena ada flagella. Habitat: saprofit di
lingkungan aquatic, dan yang parasit hidup di organ reproduktif, saluran pencernaan dan mulut
hewan termasuk manusia. Contoh: Campylobacter fetus

7. Bakteri Batang dan Kokus Aerobik Gram Negatif

Sel bentuk batang, lonjong, bola, dimensi khas untuk bakteri yaitu 0,5-1,0 m. Motil
karena berflagela, atau nonmotil. Gram negative. Aerobic. Ciri-ciri metabolic khusus pada
berbagai spesies; beberapa dapat menambat nitrogen dari udara; beberapa dapat mengoksidasi
senyawa-senyawa berkarbon satu, misalnya metan atau methanol; beberapa dapat
menghancurkan berbagai macam senyawa. Habitat: Saprofit di tanah dan lingkungan aquatic,
air asin, sedangkan yang parasit bersifat pathogen pada hewan dan manusia,
contoh: Brucella dapat menyebabkan keguguran pada hewan dan dapat menginfeksi
manusia. Francisella tularensis penyebab penyakit tularemia (demam kelinci) dapat menular
ke manusia melalui luka iris atau tergores.

8. Bakteri Batang anaerobik fakultatif gram negatif

 Sel batang pendek ( 0,5-1,0 x 1,0-3,0 m). Motil: selnya peritrikus (E. coli) dan
nonmotil. Anaerobic fakultatif. Gram negative. Habitat: Saprofit di lingkungan aquatic, tanah,
makanan, parasit bersifat pathogen terutama di saluran pencernaan makanan dan terbawa
keluar melalui faeses dan atau urine. Contoh: Escherichia coli, shigella spp., Salmonella spp.,
Yersinia pestis, Vibrio cholera

9. Bakteri gram negatif anaerobik

Sel bentuk batang lurus atau lengkung, kadang memperlihatkan sifat pleomorfik ( adanya
berbagai bentuk dalam spsies yang sama). Motil selnya peritriks atau monotrik, dan beberapa
spesies nonmotil. Ciri biokimiawi banyak sekali produk yang dihasilkan dari fermentasi
glukosa. Anaerob obligat. Habitat: rongga alamiah pada manusia dan hewan, dan saluran
pencernaan serangga. Contoh: Bacteriodes, Fusobacterium

10. Bakteri Kokus dan Kokobasillus gram negatif

Sel kokus berpasangan (diplokokus) dan dalam massa, beberapa kokobasil (batang
pendek) terdapat tunggal atau berpasangan. Nonmotil, Gram negative. Aerobic.
Ciri biokimiawi berkemampuan terbatas untuk merombak berbagai senyawa (kh, protein dll).
Habitat di selaput lendir manusia dan hewan, kadang bersifat pathogen. Contoh: Neisseria
gonorhoeae, N. meningitidis, Moraxella .

11. Bakteri Kokus anaerobik gram negatif

Penetapan kelompok ini berdasarkan ciri-ciri biokimiawi biakan. Sel ada yang sangat
kecil (0,3-0,5m) sampai sel bulat yang besar (2,5m) berpasangan (dlm massa) atau rantai.
Nonmotil. Anaerobic. Ciri biokimiawi merombak kh dan as. Lemak. Habitat dianggap parasit
di saluran pernafasan dan pencernaan manusia dan hewan, tapi tidak pathogen.
Contoh: Veillonella, Megasphaera.

12. Bakteri gram negatif kemolitotrofik

Kelompok ini berkemampuan untuk menghasilkan energy dari oksidasi zat-zat kimia
anorganik (kemolitotrofik). Morfologi sel beragam: bulat, batang, spiral, membrane berlapis
banyak pada beberapa spesies, bakteri pengoksidasi belerang dapat menyimpan butir-butir
belerang. Motil karena berflagela atau nonmotil. Gram negative, habitat: tanah, limbah ,
lingkungan aquatic, lingkungan alamiah yang banyak mengandung belerang, besi atau mangan,
misalnya air tambang asam dan sumber air panas belerang. Contoh:Nitrobacter, Nitrococcus,
Nitrosobolus dan Thiospira.

13. Bakteri penghasil metan

Ciri kelompok ini kemampuannya menghasilkan metan, yaitu gas yang dibentuk dalam
keadaan anaerobic. Morfologi sel: bola, batang dan spiral. Motil karena flagella kutub atau
nonmotil. Gram negative atau gram positif. Anaerobic. Beberapa spesies termofilik. Habitat:
saluran gastrointestinal pada binatang, endapan pada lingkungan aquatic dan limbah.
Contoh: Methanobacterium thermoauto-trophicus, M. ruminantium, Methanospirillum,
Methanosacina barkeri.

14. Bakteri Kokus gram positif

Kelompok ini banyak spesies patogenik penting bagi manusia dan hewan. Sel bentuk
kokus tunggal, berpasangan dalam rantai, paket atau gerombol. Nonmotil. Gram
positif. Anaerobic fakultatif atau mikroaerofilik. Heterotrofik dengan persyaratan nutrient
luas. Habitat: tanah, air tawar, kulit dan selaput lender pada binatang berdarahpanas termasuk
manusia. Contoh: Sarcina, Streptococcus, Leuconostoc, Staphylococcus.

15. Bakteri Batang dan Kokus pembentuk endospora

Ciri pembeda kelompok ini adalah kemampuannya membentuk endospora. Kebanyakan
spesies berbentuk batang, ada yang bulat dalam bentuk paket. Beberapa bersifat aerobic (genus
Bacillus) dan yang lain anaerobic (genus Clostridium). Motil krn flagel atau
nonmotil. Aerobik, anaerobic fakultatif, anaerobic atau mikroaerofilik. Habitat: tanah, air,
lingkungan aquatic, saluran pencernaan (termasuk manusia. Contoh:Clostridium, Bacillus,
Sporosarcina.

16. Bakteri gram negatif berbentuk batang tak membentuk endospora

Kelompok ini hampir semua adalah Lactobacillus. Bentuk sel batang tunggal atau rantai.
Nonmotil. Gram positif. Anaerobic atau anaerobic fakultatif. Ciri metabolic: asam laktat
merupakan produk akhir fermentasi. Habitat: produk persusuan, daging dan butiran (Grain),
air, limbah, serta produk fermentasi, rongga mulut, vagina, serta saluran pencernaan makanan
hewan (termasuk manusia).

17. Aktinomisetes & organisme sekerabat

 Ciri pemersatu ialah pleomorfisme sel-selnya dan kecenderungan membentuk filament
bercabang. Bentuk batang tak beraturan , filament. Nonmotil. Gram positif. Aerobic, anaerobic
fakultatif atau anaerobic. Habitat: tanah, lingkungan aquatic, air, dan hewan (termasuk
manusia). Contoh: Corynebacterium diphtheria, Mycobacterium tubercolosis, Actinomyces
israelli (penyebab peny. Aktinomikosis dsb Peny. Lumpy jaw/kaki gajah)

18. Riketsia
Morfologi sel: batang pendek, atau lonjong, kadang pleomorfik, ukuran lebar 0,3-0,7
m; panjang 1,0-2,0 m, beberapa membentuk tubuh kokoid yang berkembang menjadi tubuh
buah. Gram negative. Nonmotil. Parasit obligat intraseluser pada arthopoda penghisap darah
spt: caplak, kutu dan tungau. Habitat: serangga pembawa, burung, dan mammalia termasuk
manusia. Contoh: Chlamydia penyebab penyakit trakoma, limfogranuloma venereum,
uretritis, psitakosis, ornitosis. Riketsia penyebab demam tipus, demam bercak, Rocky
mountain, tifus scrub dan demam Q.

19. Mikoplasma
Ciri khususnya adalah tidak adanya dinding sel sejati, terdapat membrane sel berlapis
tiga tidak mengandung satuan structural asam muramat dan asam diaminopimelat yang
memberikan kekakuan pada dinding sel. Sehingga sangat pleomorfik. Biasanya nonmotil.
Gram negative. Anaerobic fakultatif. Habitat: selaput lendir saluran pernafasan dan saluran alat
kelamin bawah. Contoh Mycoplasma pneumonia.

BAB III
METODE KERJA

3.1 Alat-Alat Laboratorium

1. Alat-alat gelas atau kaca

a. Tabung reaksi
b. Erlenmeyer
c. Gelas ukur
d. Pipet
e. Cawan petri
f. Kaca Objek
2. Alat-alat berbahan porselen
3. Alat-alat berbahan silika
4. Alat-alat dari logam
5. Alat-alat dari plastik atau karet
6. Alat-alat instrumen
a. Neraca analitik
b. pH meter
c. Mikroskop
d. Alat-alat sterilisasi
Autoclave
Oven
f. Automatic Colony Counter
g. Inkubator
h. Laminar Air Flow Cabinet
7. Bahan-bahan :
a. Isopropil alkohol 95 %
b. Inokulum bakteri
c. Zat warna biru metilen
d. Zat warna karbol fuksin
e. Kristal ungu
f. Larutan iodium gram
g. Etanol 95 %
h. Pewarna safranin
i. Medium nutrien cair
j. Larutan H2O2
.

3.2 Metode kerja

3.2.1 Indentifikasi Bakteri dengan Pewarnaan

1. Pembuatan Preparat Oles

Bersihkan kaca objek sehingga bebas dari lemak dan kotoran

Teteskan beberapa tetes isopropil alkohol 95 % pada kedua permukaan kaca objek dan
keringkan dengan lap kertas.

Buatlah lingkaran ditengah-tengah permukaan bawah kaca objek. Hal ini untuk membantu
meletakkan olesan mikroba dengan tepat.

Ambil inokulum bakteri dan sebarkan olesan tersebut hingga merata.

Biarkan olesan tersebut kering udara hingga betul-betul kering.

Lakukan fiksasi panas dengan melayangkan kaca objek di atas panas api.

2. Pewarnaan Sederhana

Siapkan preparat olesan bakteri B. subtilis dan E. coli yang telah difiksasi panas
dimanadibuat 2 preparat untuk tiap bakteri.

Letakkan kaca objek di atas bak pewarnaan dan genangi olesan tersebut dengan zat warnabiru
metilen untuk preparat pertama dan zat warna karbol fuksin untuk preparat kedua.

Biarkan terwarnai biru metilen selama 1-2 menit atau selama 15-30 detik untuk
pewarnaandengan karbol fuksin.

Peganglah kaca objek dengan penjepit dan miringkan kemudian bilas dengan air hinggazat
warna hilang atau sedikit sekali.

Keringkan air pada permukaan preparat dengan kertas serap.

Amati morfologi spesien pada masing-masing preparat di bawah mikroskop.

3. Pewarnaan Gram

Buat preparat oles dari bakteri E. coli dan S. aureus.

Beri kristal ungu selama 1 menit.

Buang kelebihan kristal ungu dengan memiringkan kaca objek di atas bak pewarna

Bilas dengan air menggunakan botol pijit.

Tiriskan kaca objek dan kembalikan ke atas rak pada bak pewarna.

Cuci dengan etanol 95% setetes demi setetes selama 30 detik atau sampai zat ungu kristal
tidak tampak lagi mengalir dari kaca objek.

Beri larutan iodium gram selama 2 menit.

Buang kelebihan iodium dengan memiringkan kaca objek.

Bilas dengan air memakai botol pijit.

Beri safranin selama 30 detik.

Buang kelebihan safranin lalu bilas dengan air.

Tiriskan kaca objek dan serap kelebihan air dengan menekankan kertas serap diatasnya.

Amati di bawah mikroskop.

Cuci dengan sir lalu tiriskan.

Beri safranin selama 30 detik.

 Buang kelebihan safranin lalu bilas dengan air.

Tiriskan kaca objek dan serap kelebihan air dengan menekankan kertas serap diatasnya.

Amati di bawah mikroskop.

3.2.2 Morfologi Koloni dan Uji Biokimia

1. Sifat Morfologi Bakteri.

Gunakan preparat hasil pewarnaan gram untuk bakteri E. coli dan S. aureus.

Perhatikan gambaran mikroskopik morfologi kedua bakteri meliputi bentuk, ukuran, tekstur,
dan warna koloni.

2. Sifat Biokimia Bakteri

Menggunakan medium nutrien cair dalam tabung smith

Inokulasikan B. subtilis dan E. coli dalam tabung smith masing-masing sebanyak 2

tabung dan 1 tabung kontrol.

Inkubasikan pada suhu 37. selama 48 jam.

Pada tiap tabung tambahkan 1 ml H2O2 30% menggunakan pipet.

Biarkan lartan H2O2 mengalir sendiri dan biarkan selama 1 jam

Amati gas yang terdapat pada tabung yang tertutup.

Menggunakan medium nutrien agar miring

Inokulasikan B. subtilis dan E. coli dalam tabung smith masing-masing sebanyak 2

tabung dan 1 tabung kontrol.

Inkubasikan pada suhu 37. selama 48 jam.

 Pada tiap tabung tambahkan 2-3 ml H2O2 3% menggunakan pipet.

Biarkan larutan H2O2 mengalir sendiri dan biarkan selama 1 jam.

Amati gas yang terdapat pada tabung yang tertutup.

BAB IV
HASIL PENGAMATAN

a. Pewarnaan GramBakteri St. aureus

Gambar diatas menunjukan gambar hasil pewarnaan gram bakteri St. aureus dibawah
perbesaran mikroskop. Terlihat dari gambar warna keunguan yang menandakan bahwa
 bakteri St. aureus termasuk ke dalam golongan bakteri gram positif, dengan
morfologibentuk coccus (bundar).

b. PewarnaanGram Bakteri B. subtilus

Gambar diatas menunjukan gambar hasil pewarnaan gram bakteri B. subtilus dibawah
perbesaran mikroskop. Terlihat dari gambar warna keunguan yang menandakan bahwa
bakteri B. subtilus termasuk ke dalam golongan bakteri gram positif, dengan
morfologi bentuk basil yang memanjang dan besar.

c. Pewarnaan Gram Bakteri E. coli

Gambar diatas menunjukan gambar hasil pewarnaan gram bakteri E.coli dibawah perbesaran
mikroskop. Terlihat dari gambar warna merah yang menandakan bahwa
bakteri E.coli termasuk ke dalam golongan bakteri gram negatif, dengan morfologibentuk
basil yang memanjang kurus dan kecil-kecil.

d. Pewarnaan Sederhana Bakteri St. aureus

Gambar diatas menunjukan gambar hasil pewarnaan sederhana bakteri St. aureusdibawah
perbesaran mikroskop. Terlihat dari gambar, warna ungu yang ditunjukkan untuk membantu
melihat morfologi koloni maupun morfologi tunggal dari bakteri St. aureusberbentuk coccus.

BAB V
PEMBAHASAN

5.1 Identifikasi Bakteri dengan Pewarnaan.

5.1.1 Jenis-jenis pewarnaan pada kuman.

Pewarnaan yang dilakukan pada kuman banyak ragam dan jenisnya. Selama ini dikenal lima
macam proses pewarnaan, yaitu sebagai berikut :
1. Pewarnaan negative

- Bakteri tidak diwarnai, tapi mewarnai latar belakang.

- Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarnai, seperti spirochaeta.
Cara pewarnaan negatif :

Sediaan hapus teteskan emersi lihat dimikroskop

 Metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam
gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini
berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak
mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya
penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan
lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina.

2. Pewarnaan sederhana
- Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin)
- Tujuan hanya untuk melihat bentuk sel
Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Berbagai macam
tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan
menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam
zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana
karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang
digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya
bermuatan positif).

3. Pewarnaan Tahan Asam

Pewarnaan ini dilakukan pada bakteri tahan asam dalam proses warna akibat Alkohol-asam,
dan penggunaan pembalik warna pada tahap akhir dari proses sehingga menghasilkan warna
merah.

4. Pewarnaan structural / khusus

- Untuk mewarnai struktur khusus/tertentu dari bakteri kapsul, spora, flagel dll

a. Pewarnaan kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai
pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air
dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang. Yang
berwana biru gelap.

b. Pewarnaan spora
 Dinding spora relative tidak permeable, namun zat warna bias menembusnya dengan cara
memanaskan preparat.

c. Pewarnaan flagel
Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak stabil,
sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.

d. Pewarnaan nucleoid
Pewarnaan nucleoid menggunakan pewarna fuelgen yang khusus untuk DNA.

5. Pewarnaan diferensial
- Menggunakan lebih dari satu macam zat warna
- Tujuan untuk membedakan antar bakteri
- Contoh: Pewarnaan Gram, Pewarnaan Bakteri Tahan Asam
Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop,
memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri
seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada
bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya.

5.1.2 Langkah-langkah Pembuatan Preparat Oles dan Teknik Pewarnaan Pada Kuman.

Teknik pewarnaan kuman yang kami lakukan pada praktikum ini adalah teknik pewarnaan
sederhana dan teknik pewarnaan gram. Untuk teknik pewarnaan sederhana bertujuan untuk
melihat morfologi dari bakteri, baik itu bentuk koloninya maupun bentuk individunya.
Langkah pertama yang harus dilakukan adalah menyiapkan preparat olesan dari bakteri.
Preparat yang akan diolesi bakteri ini di fiksasi dulu sebanyak 3 kali dengan api untuk
menghilangkan kuman dan lemak di preparat baru kemudian di lap dengan tissue. Bakteri yang
digunakan adalah bakteri B. subtilis, E. coli, dan St. Aureus. Bakteri-bakteri ini dioleskan pada
bagian oval preparat, yang sebelumnya sudah ditandai dengan sepidol, penandaan bagian oval
ini untuk membantu meletakkan olesan mikroba dengan tepat. Sebelum preparat dioleskan
bakteri, preparat diolesi terlebih dahulu dengan NaCl steril, tujuannya karena NaCl steril
merupakan garam fisiologi dari bakteri.
 Langkah selanjutnya adalah menggenangi olesan bakteri pada preparat tersebut dengan zat
warnakristal violet atau biru metilenselama 1-2 menit. Kemudian preparat dimiringkan dan
dibilas dengan air hinggazat warna hilang atau sedikit sekali. Selanjutnya adalah keringkan air
pada permukaan preparat dengan kertas serap lalu amati morfologi bakteri pada masing-masing
preparat di bawah mikroskop.
Selain teknik pewarnaan sederhana, kami juga melakukan teknik pewarnaan gram, teknik
ini bertujuan untuk mengidentifikasi suatu bakteri apakah dia termasuk ke dalam bakteri gram
negatif atau bakteri gram positif. Langkah-langkah dalam pewarnaan ini hampir sama dengan
langkah pada pewarnaan sederhana yakni membuat preparat oles dari ketiga bakteri diatas.
Bedanya adalah pada beberapa reagen yang ditambahkan. Pertama, bakteri pada preparat
ditetesi kristal violet selama 1 menit. Lalu kelebihan kristal violetdibuang dengan memiringkan
kaca objek dan bilas dengan air mengalir secara perlahan. Preparat ditiriskan, lalu diberi larutan
iodium gram selama 2 menit, kelebihan iodium dibuang dengan memiringkan kaca objek lalu
dibilas dengan air seperti kristal violet. Langkah selanjutnya adalah preparat dicuci dengan
etanol 95% setetes demi setetes selama 30 detik atau sampai zat ungu kristal tidak tampak lagi
mengalir dari preparat, setelah dirasa warna menghilang cuci perlahan lalu tiriskan. Terakhir
adalah dengan menambahkan pewarna safranin selama 30 detik pada preparat, kemudian
kelebihan safranin dibuang dan dibilas dengan air. Preparat yang masih basah ditiriskan dan
diserap dengan menekankan kertas serap disekitarnya.Amati preparat olesan bakteri yang
sudah diwarnai tersebut di bawah mikroskop.

Jadi, dapat disimpulkan bahwa bahan-bahan pereaksi yang digunakan dalam pewarnaan gram
adalah :
Zat warna utama (violet kristal)
Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna
utama.
Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan
untuk melunturkan zat warna utama.
Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel
yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.

5.1.3 Perbedaan dari bakteri gram negatif dengan bakteri gram positif.
 Seperti yang kita ketahui bakteri dibagi menjadi bakteri gram negatif dan bakteri gram positif,
pembagian atas keduanya didasarkan pada beberapa perbedaan, berikut perbedaan bakteri gram
negatif dan bakteri gram positif :

Ciri-ciri bakteri gram negative :

- Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10-45mm, berlapis tiga atau multi layer

- Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat dalam
lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit dan tidak mengandung asam laktat.

- Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.

- Tidak resisten terhadap gangguan fisik

Ciri-ciri bakteri gram positif :

- Struktur dindingnya tebal

- Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal

- Bersifat lebih rentan terhadap senyawa penisilin

- Komposisi yang dibutuhkan lebih rumit

- Lebih resisten terhadap gangguan fisik.

Perbedaan relatif sifat bakteri gram positif dan gram negatif.

Sifat Bakteri gram Bakteri gram negatif(-)

positif (+)
Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah Kandungan lipid tinggi
(1-4%)
Ketahanan terhadap Lebih sensitif Lebih tahan
penisilin
Penghambatan oleh Lebih dihambat Kurang dihambat
pewarna basa (VK)
Kebutuhan nutrisi Kebanyakan spesies Relatif sederhana
relatif kompleks
 Ketahanaa terhadap Lebih tahan Kurang tahan
perlakuan fisik

Berdasarkan hasil pengamatan dibawah mikroskop, untuk bakteri yang termasuk gram
positif akan terlihat berwarna ungu, dimana warna ungu ini sendiri merupaka warna dari kristal
violet yang sebelumnya diteteskan, warna ini melekat dengan kuat karena peptidoglikan dari
bakteri gram positif tebal. Sedangkan untuk bakteri gram negatif akan terlihat warna merah,
dimana warna merah ini merupakan warna dari pewarna safranin yang diteteskan terakhir kali,
warna ini melekat dan warna ungu sama sekali tidak terlihat karena peptidoglikan dari bakteri
gram negatif relatif tipis sehingga ia tidak mampu mempertahankan warna ungu layaknya
bakteri gram positif.

5.2 Morfologi Koloni dan Uji Biokimia.

5.2.1 Mahasiswa memahami sifat morfologi yang ditunjukkan koloni kuman.

Ada empat cara yang dilakukan untuk mengetahui hasil dari identifikasi morfologi koloni bakteri yaitu
sebagai berikut:

1) Metode piringan goresan dan metode piringan tuangan

Untuk memelihara bakteri dalam lempengan (di dalam petridis) sampel bakteri diambil dengan ujung kawat
yang bengkok. Ujung yang bengkok ini kemudiaan digesekkan dengan gerakan ke kanan dan ke kiri sampai
meliputi seluruh permukaan agar-agar. Dengan demikian akan diperoleh koloni-koloni yang mengggerombol dan
koloni-koloni yang memencil. Yang terakhir inilah yang menunjukkan sifat-sifat yang harus diperhatikan. Sifat-
sifat koloni pada agar-agar lempengan mengenai bentuk, permukaan, dan tepi. Bentuk koloni dilukiskan sebagai
titik,-titik, bulat, berbenang, tak teratur, serupa akar, serupa kumparan. Permukaan koloni dapat datar, timbul
mendatar, timbul melengkung, timbul mencembung, timbul membukit, timbul berkawah. Tepi koloni ada yang
utuh, ada yang berombak, ada yang berbelah-belah, ada yang bergerigI, ada yang berbenang-benang, ada yang
keriting.

2) Metode tusukan agar tegak

Metode ini dapat diperoleh dengan menusukkan ujung kawat yang membawakan bakteri, lurus ke dalam
medium melalui tengah-tangah medium. Bakteri yang aerob akan tampak tumbuh dekat permukaan
medium. Sifat-sifat koloni tusukan dalam gelatin. Ada bakteri yang dapat mengencerkan gelatin, ada juga bakteri
yang tidak mampu mengencerkan gelatin. Bentuk koloni serupa pedang, tasbih, bertonjol-tonjol, berjonjot, serupa
 batang, serupa kawah, mangkuk, corong, pundit-pundi (Jutono, 1980). Koloni juga dibedakan berdasarkan moril
tidaknya. Bakteri dikatakan motil apabila bakteri menyebar ke sekitar tusukan, sedangkan bakteri dikatakan
nonmotil bila pertumbuhannya hanya pada bekas tusukan.

3) Metode agar miring goresan

Untuk membuat piaraan disitu maka ujung kawat yang berisi bakteri digesekkan satu kali dari ujung bawah
ke ujung atas sehingga garis itu merupakan diameter memanjang dari permukaan medium. Sifat khusus pada agar
miring berkisar pada bentuk dan tepi koloni, dan sifat-sifat itu dinyatakan dengan kata-kata seperti : berupa
pedang, serupa duri, serupa tasbih, titik-titik, batang, dan akar.

4) Metode medium cair

Inolukasi juga dapat dilakukan degan metode adukan. Bakteri yang digunakan untuk membuaat piaaraaan adukan
dapat diperoleh dari piaraan dalam medium cair, atau dari suatu koloni pada medium padat. Biakan diambil
dengan kawat ose kemudian diadukkan dalam medium cair tersebut. Sifat koloni yang kelihatan akan berbeda-
beda. Permukaan medium ini dapat memprlihatkan adanya serabut, cincin, langit-langit, atau selaput.

Menurut Pradhika (2008), koloni bakteri memiliki ciri-ciri yang berbeda, tergantung jenisnya dan
mediumnya. Ciri-ciri tersebut adalah :

a. Pertumbuhan pada petridis.

Ukuran; pinpoint/punctiform (titik)
- Small (kecil)
- Moderate (sedang)
- Large (besar)

Pigmentasi : mikroorganisme kromogenik sering memproduksi pigmen intraseluler, beberapa jenis lain
memproduksi pigmen ekstraseluler yang dapat terlarut dalam media.

Karakteristik optik : diamati berdasarkan jumlah cahaya yang melewati koloni.

- Opaque (tidak dapat ditembus cahaya)
- Translucent (dapat ditembus cahaya sebagian)
- Transparant (bening)

Bentuk :
- Circular
- Irregular
- Spindle
- Filamentous
 - Rhizoid

Elevasi :
- Flat
- Raised
- Convex
- Umbonate

Permukaan :
- Halus mengkilap
- Kasar
- Berkerut
- Kering seperti bubuk

Margins :
- Entire
- Lobate
- Undulate
- Serrate
- Felamentous
- Curled

b. Pertumbuhan pada Agar Miring

Ciri-ciri koloni diperoleh dengan menggoreskan jarum inokulum tegak dan lurus pada medium.

c. Pertumbuhan pada Agar Tegak

Cara penanaman adalah dengan menusukkan jarum inokulum needle ke dalam media agar tegak.

d. Pertumbuhan pada Media Cair

BAB VI
PENUTUP

6.1 Kesimpulan
1. Jenis-jenis pewarnaan pada kuman ada banyak macamnya, diantaranya pewarnaan negatif,
pewarnaan sederhana, pewarnaan tahan asam, pewarnaan structural / khusus, dan pewarnaan
diferensial.
2. Sebelum melakukan pewarnaan bakteri, kita harus membuat preparat oles bakteri. sebelum
preparat diolesi bakteri harus dilakukan fiksasi dulu.
3. Teknik pewarnaan sederhana adalah teknik pewarnaan yang bertujuan untuk melihat bentuk
tunggal dan berkoloni dari suatu bakteri, sedangkan teknik pewarnaan gram bertujuan untuk
mengidentifikasi bakteri termasuk dalam gram positif atau negatif.
4. Bahan pereaksi yang digunakan dalam pewarnaan gram adalah pewarna violet kristal, lalu
iodium/lugol, kemudian alkohol dan yang terakhir adalah pewarna safranin
5. Perbedaan antara bakteri gram positif dengan gram negatif setelah dilakukan pewarnaan gram
adalah: bakteri gram positif memberikan warna ungu, sedangkan gram negatif memberikan
warna merah dibawah mikroskop.
6. Morfologi yang ditunjukkan koloni kuman dapat diidentifikasi dengan metode piringan
goresan, metode piringan tuangan, metode tusukan agar tegak, metode agar miring goresan,
metode medium cair

6.2 Saran

Berhatil-hatilah bekerja dengan mikroorganisme sseperti bakteri karena bisa

saja bakteri tersebut bersifat patogen. Gunakan selalu sarung tangan dan masker untuk
menghindari kontak kulit langsung dengan bakteri. Kemudian setelah pekerjaan selesai jangan
lupa untuk mencuci tangan dengan sabun lalu dengan antiseptik untu meminimalisir jumlah
kuman yang menempel di tangan kita.
 DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan.

Hadioetomo, Ratna Siri.1990.Mikrobiologi dalam Praktek. Jakarta: Gramedia.

Lay, Bibiana.1994.Analisis Mikroba di Laboratorium.Jakarta : Rajawali

Sutedjo, Mul Mulyani.1991. Mikrobiologi Tanah.Jakarta : Rineka Cipta

Volk, W. A. dan Wheeler, M. F. 1993. Mikrobiologi Dasar Edisi Kelima. Jakarta: Erlangga.

Waluyo,Lud.2004.Mikrobiologi Umum. Malang: UMM Press.