RESUMO PROVA 1

Otimizao de parmetros cromatogrficos para uma boa separao
O objetivo principal de uma anlise por CG obter picos estreitos e bem
separados em um tempo relativamente rpido. Tal objetivo s pode ser
alcanado atravs de uma avaliao correta dos parmetros que
determinam a utilizao otimizada
das capacidades da coluna. Tais parmetros so, em resumo, os seguintes:
a) Parmetros relacionados a velocidade de migrao dos solutos:
Coeficiente de partio - K
A relao segundo a qual uma substncia se reparte entre a fase mvel e a
fase estacionria dada pelo coeficiente de partio.
Tempo de reteno tr
Corresponde ao tempo total que a molcula necessita para migrar atravs
da coluna desde a injeo at o detector
Quanto maior a seletividade, maior a separao entre dois componentes. A
seletividade pode ser variada trocando a fase mvel, composio da fase
estacionria e/ou temperatura da coluna.
b) Eficincia da coluna e alargamento da banda
A eficincia de uma coluna medida em termos de altura equivalente a um
prato terico (H) e o nmero de pratos tericos (N). Um prato corresponde a
uma etapa de equilbrio da substncia entre a fase estacionria e a fase
mvel; portanto, quanto maior o nmero de pratos, maior ser a eficincia
(picos mais estreitos). Durante o percurso na coluna, a zona inicialmente
ocupada pela substncia vai-se alargando gradualmente. Este fato
traduzido no registrador (diferencial) pela obteno de uma curva do tipo
gaussiano, que traduz a distribuio da populao molecular que emerge da
coluna durante um intervalo de tempo definido pela base da curva. A relao
entre a largura do pico e o tempo de reteno, ambos medidos em unidades
de tempo, definem a altura equivalente a um prato terico.

Velocidade linear mdia de migrao

Fator capacidade k: k' descreve o quanto o soluto

N = nmero de pratos tericos H = altura equivalente a um prato
retido em relao ao metano em uma determinada
terico H=L/N
coluna. k pode ser variado trocando a temperatura
Uma maior eficincia atribuda a colunas com menor dimetro interno, a
da coluna e/ou fase estacionria.
partculas da fase estacionria com tamanho pequeno e uniforme e, no caso
de fase estacionria lquida, a uma menor espessura e viscosidade do filme.
Seletividade Indica quanto uma coluna mais seletiva para um
Maiores massas moleculares do gs de arraste tambm aumentam a
componente em relao ao outro. Sua principal utilidade fornecer uma
eficincia da coluna.
medida de como a coluna ir separar os dois componentes.

Variveis cinticas que afetam a largura da banda (alteram a eficincia)

O alargamento da banda uma conseqncia da velocidade finita na qual muitos processos de transferncia de massa ocorrem durante a migrao da
espcie atravs da coluna. Algumas dessas velocidades so controladas pelo ajuste dos parmetros experimentais, permitindo uma melhor separao. O
efeito dessas variveis sobre a eficincia da coluna, medida pela altura do prato H, esto relacionadas na equao de van Deemter:
Resoluo da coluna (separao)
Resoluo (Rs) a medida quantitativa para avaliar a capacidade de separao da coluna em relao a dois analitos,
considerando a distncia relativa entre bandas cromatogrfica vizinhas e suas respectivas larguras. Rs calculada como o
dobro da razo da diferena dos tr de duas substncias adjacentes no cromatograma pela soma da largura de seus picos:
Para anlises quantitativas, valores de resoluo considerados bons so aqueles superiores a 1,5. Para anlises
qualitativas resolues superiores a 1,0 j so consideradas boas. A natureza da coluna, a velocidade do gs de arraste e
as temperaturas empregadas no sistema de CG so fatores que afetam a resoluo
Tcnicas de otimizao
- diminuir o tamanho da partcula de empacotamento; o dimetro da coluna; a temperatura da coluna; a espessura do filme lquido; otimizar a velocidade de
fluxo da fase mvel.; aumentar o comprimento da coluna (aumenta N).
- Aumenta a temperatura -> mais rpido -> piora a separao
- Diminuiu a temperatura -> melhor separao
Quando k, N e assimetria do pico mudam porque ocorreu degradao da coluna.
Aspectos tericos
ndice do Kovats
Parmetro til porque impossvel reproduzir tempos de reteno em dois laboratrios diferentes.
Gs de arraste
A escolha do gs de arrastre depende do tipo de detector que utilizado e dos componentes a
determinar. Os gases de arrastre para cromatgrafos devem ser de alta pureza e quimicamente
inertes, por exemplo, hlio (He), argnio (Ar), nitrognio (N2) e hidrognio (H2). O sistema de gs
arrastre pode conter um filtro molecular para a remoo de gua e outras impurezas
Injeo direta com seringa - As amostras gasosas e lquidas podem ser injetadas com uma seringa.
Na forma mais simples a amostra injetada primeiro em uma cmara aquecida, onde se evapora
antes de ser transferida para a coluna. Quando so utilizadas colunas empacotadas, a primeira parte
da coluna, em geral, serve como cmara de injeo, aquecida separadamente a uma temperatura
adequada. A amostra lquida injetada diretamente na coluna com uma seringa. Deixa-se ento que
o solvente se evapore para produzir a concentrao dos componentes da amostra. Se a amostra for
gasosa, a concentrao efetuada por meio do mtodo criognico.
Injeo com vlvula de amostragem/ loop - A injeo com vlvulas de amostragem e Loop muitas
vezes utilizada no controle de processos, onde as amostras gasosas ou lquidas fluem
continuamente atravs de uma espiral. A espiral de amostra enche em posio off-line com uma
seringa ou uma bomba automtica. Portanto, o loop conectado em srie com a coluna e a amostra
transferida fase mvel. s vezes necessrio concentrar a amostra.
A eficincia da coluna requer que a amostra tenha um tamanho adequado e seja introduzida na forma de vapor. Injees lentas e/ou injeo de grandes
volumes de amostra resultam em picos alargados com pobre resoluo. O mtodo mais comum de injeo envolve o uso de uma microsseringa para a injeo
do lquido ou amostras gasosas atravs de um septo de silicone para dentro do injetor. Neste caso, o sistema de injeo da amostra possui um divisor de fluxo,
o qual pode ser utilizado aberto (split) ou fechado (splitless).
Quando o divisor est fechado, todo o volume injetado
carregado para dentro da coluna pela fase mvel. Esse um
mtodo de concentrao da amostra, e portanto deve ser
adotado para amostras diludas. Para amostras concentradas,
o divisor de fluxo utilizado aberto.
Variveis para uma injeo sem divisor de fluxo (splitless)
Relao entre solvente x Temperatura ideal da coluna
para o efeito do solvente
Trabalhar com solvente de ponto de ebulio prximo ao
ponto de ebulio da amostra. Utilizar a temperatura do injetor
com aproximadamente 20oC abaixo do ponto de ebulio do
solvente, para evitar discriminao. Desta maneira, o solvente
no evapora primeiro deixando a amostra para trs, evitando perdas de amostras mais pesadas na abertura do divisor de fluxo.
Discriminao em injetores com divisor de fluxo
Principais causas: - Vaporizao seletiva de componentes da amostra na agulha da seringa; Variaes na razo de diviso ocasionadas por variaes na
viscosidade do gs e pela condensao do solvente na entrada da coluna; Vaporizao incompleta e vaporizao lenta da coluna; Velocidade de difuso
diferentes para molculas de tamanhos variados; Ponto terminal da agulha muito prximo da entrada da coluna no momento da injeo.
Discriminao em injees sem divisor de fluxo
Principais causas: - Vaporizao seletiva de componentes da amostra na agulha da
seringa; Perodo com o divisor fechado e a transferncia de amostra para a coluna;
Adsoro no encamisamento (liner) do injetor; Tempo de residncia longo da amostra na
cmara de vaporizao pode provocar degradaes de molculas termossensveis.
Discriminao em injees na coluna
Principais causas: A frio
- Perda de material na parte externa da agulha e para a cmara do injetor, ocasionada
por fluxo reverso (em funo do volume de amostra, dimetro interno do capilar, dimetro
externo da agulha, gradiente de temperatura e comprimento da agulha).
A quente:- Idem (com mais probabilidade de ocorrer devido a vaporizao mais eficiente
da amostra); Vaporizao seletiva de componentes da amostra na agulha da seringa.
Colunas
Cromatografia gasosa: colunas empacotada e coluna tubular
aberta (coluna capilar). A temperatura tima da coluna
depende do ponto de ebulio da amostra e do grau de
separao requerido. Grosseiramente, uma temperatura igual
ou ligeiramente acima do ponto de ebulio mdio de uma
amostra resulta em um razovel tempo de eluio. Em geral,
resolues timas esto associadas com temperaturas
mnimas, o custo deste abaixamento de temperatura,
contudo, o aumento no tempo de eluio e portanto no
tempo requerido para a anlise completa.
Colunas empacotadas
So fabricadas com vidro, metal (ao inoxidvel, cobre,
alumnio) ou tubos de teflon. Esses tubos so densamente
empacotados com um material uniforme e finamente dividido,
ou com um suporte slido (inerte, terras diatomceas)
recoberto por uma fina camada de fase estacionria lquida.
Coluna tubular aberta ou coluna capilar
So fabricadas em ao inoxidvel, vidro, teflon ou slica
fundida revestida com um plstico de poliimida.
- Coluna capilar de parede recoberta as paredes dos tubos
capilares so recobertas com uma fina camada da fase
estacionria;
- Coluna capilar de suporte recoberto o interior da
superfcie do capilar recoberto com um filme delgado de fase estacionria lquida sobre um suporte, tal como terra diatomcea.
Detectores
A funo de um detector produzir uma resposta que seja proporcional
quantidade ou concentrao do composto que o atravessa sob a forma de um
sinal que pode ser medido. Como no possvel dispor de um detector
universal que responda a todos os tipos de analitos, necessrio escolher
entre os detectores existentes aquele que melhor se adapta ao fim desejado.
Caractersticas do detector ideal
- Sensibilidade adequada; Boa estabilidade e reprodutibilidade (preciso);
Intervalo de temperatura desde a temperatura ambiente at no mnimo 4000C;
Tempo de resposta rpido, independente da velocidade de fluxo; Alta
viabilidade e facilidade no uso; No destruir a amostra. No existe um detector
ideal.Em geral, um detector no identifica o que eludo pela coluna, ele
mostra que somente que alguma coisa est saindo.
Anlise qualitativa
Um cromatograma fornece somente uma informao qualitativa simples sobre
cada espcie na amostra - o tempo de reteno ou a posio na fase
estacionria depois de um certo tempo de eluio. Contudo, para a
identificao espectroscpica ser possvel, necessrio uma separao cromatogrfica preliminar. A CG amplamente utilizada para o controle da pureza de
compostos orgnicos. Os contaminantes, quando presentes, aparecem como picos adicionais; a rea sob esses picos d uma estimativa da extenso da
contaminao. A tcnica tambm utilizada para avaliar a eficincia de processos
de purificao.
A CG permite confirmar a presena ou ausncia de um suposto componente em
uma mistura que contm um nmero de espcies conhecidas. Neste caso, a adio
da substncia na mistura ou aumenta a rea do pico correspondente a substncia
presente, ou surge um novo pico quando a substncia est ausente. Esta evidncia
confirmada se diferentes colunas em diferentes temperaturas exibem o mesmo
efeito.
Anlise quantitativa
A tcnica cromatogrfia vem sendo amplamente utilizada porque rpida,
relativamente simples e de baixo custo, e encontra muitas aplicaes como
instrumento de separao. O sinal obtido no detector tem sido usado para a anlise
quantitativa, onde a altura ou a rea do pico analito comparado com um ou mais
padres. Sob condies controladas cuidadosamente, possvel obter 1% de
exatido.
Anlise baseada na altura do pico
A altura do pico medida desde a base at o mximo do pico. importante lembrar
que a altura do pico inversamente proporcional a largura do pico. As variveis que
podem ser rigorosamente controladas so a temperatura da coluna, velocidade de
fluxo do eluente e velocidade de injeo da amostra.
Mtodo da normalizao da rea
Consiste em outro mtodo para evitar as incertezas associadas com a injeo da
amostra. necessrio a eluio completa de todos os componentes da amostra.
Nesse mtodo, as reas de todos os picos eludos so computados. Para a
correo dessas reas para diferenas na resposta do detector para diferentes tipos
de compostos, a concentrao do analito encontrada pela razo rea/rea total de todos os picos. A rea de cada pico medida e corrigida para a resposta
do detector para diferentes eluatos. A correo envolve a diviso da rea do pico por um fator de correo empiricamente determinado (fator resposta do
detector). A concentrao do analito encontrada a partir da razo entre a sua rea corrigida e a rea total corrigida de todos os picos.
Qual a relao entre a altura do prato terico e a eficincia da coluna? Assim, nmero de pratos (N) e altura do prato terico (H)) so termos usados como
medidas quantitativas da eficincia da coluna cromatogrfica. Mais pratos = uma melhor separao.
Qual a relao entre o tamanho das partculas da fase estacionria com a altura do prato terico? O tamanho da partcula tem relao direta com a
eficincia da coluna na CLAE. Quanto menores as partculas do recheio da coluna, maior a presso da coluna no sistema. Da mesma forma, quanto menores
as partculas do recheio da coluna, mais finos sero os picos e melhor ser a separao.
Resumidamente, qual a regra bsica para selecionar a fase mvel e a fase estacionria? Fase estacionria: fase fixa onde a substncia que est sendo
separada ou identificada fixa-se na superfcie de outro material. Por exemplo, um papel de filtro. Fase mvel: nesta fase as substncias que queremos isolar
so arrastadas por um solvente fluido, que pode ser lquido ou gasoso. Por exemplo, vapor do lcool Etlico.
Que caractersticas devem apresentar as amostras separadas por cromatografia gasosa? As amostras separadas por CG devem ser volteis, estveis
termicamente na temperatura de trabalho e apresentar baixo peso molecular. A cromatografia gasosa apresenta dificuldade em analisar substncias no
volteis, que se decompem em altas temperaturas ou possuem elevado peso molecular.
Que caractersticas devem apresentar as amostras separadas por HPLC? A amostra deve ser solvel na fase mvel, sendo ela lquida (inica ou
covalente) ou slida (inica ou covalente).
Quais as limitaes que a cromatografia gasosa e HPLC apresentam? Enquanto a CG mais rpida e 10x mais eficiente que o HPLC, ela pobre em
capacidade preparativa e possui menor sensibilidade (10^-12 g DIC/DCE). O HPLC possui boa capacidade preparativa e sensibilidade igual a 10^-9 g (UV) e
10^-15 g (coulomtrico).
Quais so os principais componentes de um equipamento de HPLC? Reservatrio da Fase Mvel, bomba, injetor, pr-coluna, coluna, detector e
computador.
Qual o grau de pureza da fase mvel usada na tcnica de HPLC? O grau de pureza deve ser maior que 99,9%.
Por que necessrio filtrar e desgaseificar o eluente? As fases mveis, principalmente as polares, tem tendncia a dissolver oxignio e outros gases.
Quando estes gases so liberados, dentro do equipamento, formam bolhas que podem afetar o funcionamento do detector e a eficincia da coluna. Desta
forma necessrio remover os gases dissolvidos na fase mvel. Muitos equipamentos de HPLC j trazem a soluo deste problema desgaseificando a fase
mvel em um compartimento especfico, antes que ela entre na bomba.
Qual a diferena entre as separaes cromatogrficas com bombeamento isocrtico e de gradiente? No bombeamento isocrtico a composio da fase
mvel permanece constante, e capaz de separar um nmero limitado de picos. Enquanto que no bombeamento gradiente a composio da fase mvel varia
durante a anlise. Aplica-se esse sistema quando a polaridade dos compostos muito diferente e quando se separa amostras complexas.
Por que o detector de UV o mais usado em HPLC? Esses detectores apresentam como principal atrativo o fato de se poder escolher diferentes
comprimentos de onda. Permitem a anlise de amostras complexas que absorvem em diferentes comprimentos de onda; assim como permitem a obteno do
espectro completo de um pico cromatogrfico eludo da coluna
Qual a diferena entre cromatografia em fase normal e fase reversa? Na fase normal a fase estacionria mais polar que a fase mvel, enquanto que na
fase reversa a fase estacionria menos polar que a fase mvel.
A tcnica de HPLC s trabalha com cromatografia em fase normal? No. O HPLC em fase normal utiliza as fases estacionrias quimicamente ligadas que
consistem em uma fase imvel apolar e uma fase mvel de polaridade moderada.
O que so as fases estacionrias quimicamente ligadas? As fases estacionrias quimicamente ligadas so as fases mais importantes da cromatografia
lquida. Obtidas pela reao dos grupos silanis da slica com compostos contendo grupos polares (Fase Normal) ou apolares (Fase Reversa).
Como regra em CLAE, a maioria das separaes realizada igualando-se a polaridade do analito com aquela da fase estacionria e uma fase mvel
de polaridade consideravelmente diferente empregada. Esse procedimento mais bem sucedido que outro no qual as polaridades do analito e
fase mvel so igualadas, sendo diferentes daquela fase estacionria. Explique como este segundo procedimento altera o tempo de reteno e a
resoluo, no permitindo sua aplicao prtica. Quando o analito e a fase mvel se unem atravs da polaridade, a separao na coluna mais difcil alm
de mais demorada. A fase estacionria no consegue prender o analito sem prender a fase mvel tambm.
Para qual o tipo de soluto deve ser selecionado a separao por: 1) cromatografia de excluso molecular 2) cromatografia de partio
1) O fracionamento baseado no tamanho das molculas
2) Para espcies polares, mas no inicas. A transferncia de massa mais rpida para menores espessuras de fase lquida. O primeiro a sair da coluna o
soluto apolar, nesse caso.
O que cromatografia? A cromatografia uma tcnica para analisar, identificar ou separar os componentes de uma mistura. definida como a
separao de dois ou mais compostos diferentes por distribuio entre fases, uma das quais estacionria (fixa) e a outra, mvel. Essa tcnica baseia-se
no princpio da adsoro seletiva. Em todas as separaes cromatogrficas, a amostra transportada por uma fase mvel, que pode ser um gs, um
lquido ou um fluido supercrtico. Essa fase mvel , ento, forada a passar atravs de uma fase estacionria imiscvel fixa, colocada em uma coluna ou
sobre uma superfcie slida. As duas fases so escolhidas de modo que os componentes da amostra distribuam-se entre as fases mvel e estacionria em
graus variados. Os componentes que so retidos mais fortemente na fase estacionria movem-se mais lentamente no fluxo da fase mvel. Ao contrrio, os
componentes que interagem mais fracamente com a fase estacionria movem-se mais rapidamente. Como consequncia dessas velocidades de migrao
diferentes, os componentes da amostra so separados em bandas ou zonas discretas, que podem ser analisadas quantitativa ou qualitativamente
Descreva fase mvel e estacionria:.Fase mvel a fase responsvel por arrastar os componentes das amostras de acordo com seu grau de afinidade.
J a fase estacionria comporta-se como um suporte para a fase mvel que deve ser de polaridade diferente desta.
Para que utilizada a cromatografia? A cromatografia um mtodo de separao que encontra aplicao em todos os ramos da cincia. Esta tcnica
pode ser utilizada para a identificao ou purificao de compostos e para a separao decomponentes de uma mistura.
Qual o princpio da cromatografia gasosa? Como a mesma classificada segundo a fase estacionria? Na cromatografia gasosa, os componentes
de uma amostra vaporizada so separados em consequncia de sua partio entre uma fase mvel gasosa e uma fase estacionria lquida ou slida
contida dentro da coluna. Ao realizar uma separao por cromatografia gasosa, a amostra vaporizada e injetada na cabea da coluna cromatogrfica. A
eluio feita por um fluxo de fase mvel gasosa inerte.Dois tipos de cromatografia gasosa so encontrados: a cromatografia gs-lquido e cromatografia
gs-slido. No primeiro caso, a fase mvel um gs enquanto a fase estacionria um lquido retido, na superfcie de um slido inerte, por adsoro ou
ligao qumica. No segundo caso, a fase mvel tambm um gs e a fase estacionria um slido que retm os analitos por adsoro fsica.
Cite as vantagens e desvantagens dos seguintes detectores: (a)Detector por condutividade trmica Vantagem: grande aplicabilidade geral, ampla
faixa linear de resposta, simplicidade e no destri a amostra. Desvantagem: baixa sensibilidade. (b)Detector por ionizao em chama Vantagem: alta
sensibilidade ampla faixa linear de resposta, baixo rudo, fcil utilizao, resistncia, resposta altamente dependente da vazo. Desvantagem: destri a
amostra. (c)Detector por captura de eltrons Vantagem: alta sensibilidade, seletividade para compostos que contm halognio e muitos outros.
Desvantagem: faixa linear estreita. (d)Detector terminico Vantagem: alta sensibilidade para compostos que contenham fsforo e nitrognio, boa faixa
linear. Desvantagem: destri o analito, no aplicvel a muitos analitos. (e)Detector por fotoionizao Vantagem: faixa linear alta e detector mais
sensvel para hidrocarbonetos aromticos e compostos organossulfurados ou organofosforados. Desvantagem: compostos com potenciais de ionizao
mais elevados no so detectados.
Descreva as caractersticas dos seguintes mtodos de separao em cromatografia lquida. (a)Adsoro ou lquido-slida: processo baseado em
interaes eletrostticas, dipolares (Van DerWaals) ou ligaes de hidrognio que ocorrem entre grupos ativos presentes na superfcie da fase estacionria
slida e a fase mvel. (b)Partio: a fase estacionria um segundo lquido que imiscvel com o lquido da fase mvel. Quando a fase estacionria um
lquido, espalhado na superfcie de um suporte slido e inerte ou nas paredes de um tubo, o processo interfacial, ocorrendo por absoro ou partio,
que se baseia nas diferentes solubilidades dos componentes da amostra na fase estacionria. (c)Troca inica: a fase estacionria constituda de uma
matriz onde so adicionados grupos funcionais ionizveis. A fase mvel geralmente uma soluo inica com propriedades tamponantes escolhidas de
forma a ser compatvel com o tipo de trocador usado. (d)Excluso de tamanho: baseia-se em um processo puramente mecnico. A fase estacionria
uma matriz de composio inerte, com textura, superfcie e distribuio de tamanho dos poros controlados. Os componentes presentes na fase mvel
podem ser separados pela diferena de tamanho das partculas no qual partculas menores conseguem penetrar nos poros da fase estacionria enquanto
as partculas maiores no.
Quais as misturas que podem ser separadas por cromatografia gasosa? Podem ser separadas por cromatografia gasosa as misturas cujos
constituintes sejam termicamente estveis e volteis e que dissolva, pelo menos parcialmente, no gs da fase mvel.
Qual o princpio da cromatografia em papel? A cromatografia em papel uma tcnica de partio lquido-lquido, estando um deles fixado a um
suporte slido. Baseia-se na diferena de solubilidade das substncias em questo entre as duas fases imiscveis, sendo geralmente a gua um dos
lquidos. O solvente saturado em gua e a partio se d devido presena de gua em celulose (papel filtro). Na cromatografia em papel, uma amostra
lquida flui por uma tira de papel adsorvente vertical. A organizao molecular que compe as cadeias de celulose do papel polar.
Como pode ser manipulado o fator de separao na: (a)Cromatografia gasosa: O fator de separao pode ser manipulado na cromatografia gasosa
atravs de variaes: na temperatura, nos tamanhos das partculas, nas composies das fases mveis e estacionrias. (b)Cromatografia lquida: O fator
de separao pode ser manipulado na cromatografia lquida atravs de variaes: na presso, nos tamanhos das partculas, nas composies das fases
mveis e estacionrias.
Como realizada a confirmao da identidade (anlise qualitativa) de compostos quando a anlise emprega CLAE ? Cromatografia Lquida de Alta
Eficincia a confirmao da identidade de um composto feita atravs da comparao entre os tempos de reteno das substncias e dos padres, ou
seja, compostos iguais apresentam o mesmo tempo de reteno.
Quais espcies podem ser separadas por Cromatografia Lquida de Alta Eficincia, mas no podem ser separadas por Cromatografia Gasosa?
Substncias no-volteis ou termicamente frgeis podem ser separadas por Cromatografia Lquida de Alta Eficincia e no por Cromatografia Gasosa.
Discuta por que a combinao da cromatografia gasosa com a espectrometria de massas to vantajosa: A combinao da cromatografia gasosa com
a espectrometria de massas, por ser uma tcnica hifenizada, pode ser usada para a identificao de misturas complexas, com tempos de reteno prximos.