Degradacin inducida de RNA total: revisin de un nuevo mtodo

molecular de evaluacin de integridad de RNA.

Ivn Felipe Vidal Martnez

Estudiante de Maestra en Bioqumica,
Universidad Nacional de Colombia.

Resumen. Mtodos de determinacin de expresin gnica tales como: microarreglos, RT-qPCR y

Northern Blot requieren de material biolgico de calidad. Uno de estos materiales primarios es el RNA
cuya calidad se define como la pureza y la integridad. Se ha demostrado que la integridad las muestras de
RNA tiene una influencia directa en el resultado de los experimentos de expresin gnica y puede
comprometer fuertemente la precisin de cualquier perfil de RNA. En la bsqueda de nuevos mtodos o
modificaciones de mtodos de evaluacin de la integridad del RNA que sean ms prcticos, accesibles y
sensibles, se realiz la revisin de un nuevo mtodo de evaluacin de la integridad, llamado amplicones
diferenciales-. Este mtodo en capaz de discriminar la degradacin producida en mRNA de la producida
en RNA total, es sensible a la degradacin extensiva y sus pruebas concuerdan con estudios previos de
evaluaciones de degradacin.

Palabras clave: Integridad, RNA, electroforesis capilar, RT-qPCR, amplicones diferenciales.

1. Introduccin.

El uso de la PCR con transcriptasa inversa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) para el anlisis de la
expresin de genes se ha intensificado en los ltimos aos debido a que es el mtodo por eleccin cuando
se trata de cuantificar cidos nucleicos. La cuantificacin de los niveles de expresin de RNA sirve como
indicador principal del estado fisiolgico de una clula o tejido. La pureza y la integridad de las muestras
de RNA se ha demostrado que tienen una influencia directa en el resultado de los experimentos de
expresin gnica y puede comprometer fuertemente la precisin de cualquier perfil de RNA (Benedikt
Kirchner, 2014), es por esta razn que la necesidad de aislar RNA total de alta calidad a partir de una
amplia variedad de muestras de tejidos clnicos y/o experimentales adquiere mayor importancia. La pureza
y la integridad del RNA son elementos crticos para el xito general de los anlisis basados en RNA. La
evaluacin de la integridad del RNA puede realizarse por diversos mtodos: Los mtodos convencionales
a menudo no son lo suficientemente sensibles, no son especficos para el RNA de cadena simple y estn
abiertos a interferencias de los contaminantes presentes en la muestra (Imbeaud, 2005). Un mtodo
molecular ms reciente emplea la longitud del amplicn para evaluar la integridad del mRNA. Se basa en
el uso de ensayos qPCR de parejas que producen amplicones de diferentes longitudes del mismo target. En
el mRNA intacto los Cqs de los amplicones cortos y largos son virtualmente los mismos, mientras que
para el RNA fragmentado el Cq del amplicn ms largo se incrementa con respecto al de los ms cortos.
En este documento se hace una revisin de un nuevo mtodo de evaluacin de integridad de RNA llamado
-amplicones diferenciales- con el fin de determinar sus ventajas para su posible uso. Este mtodo evala el
enfoque de la medicin de amplicones diferenciales,

Amp = CqAmplicon1 CqAmplicon2,

y la relacin de amplicones,

Amplicon1/Amplicon2 = 2Amp
como indicador de integridad de RNA. Tambin presentan un nuevo marcador de RNA que es
prcticamente resistente a RNasas y se encuentran en la mayora de las clulas eucariotas. Este nuevo
marcador Endgeno RNasa Resistente (ERR) puede combinarse con un marcador de mARN, tal como un
gen de referencia, que tiene una sensibilidad normal a las RNasas, para evaluar la degradacin fsica y
qumica del mRNA, entre otros (Bjrkman, 2016).

2. Materiales y Mtodos.

En este documento se revis una nueva metodologa de evaluacin de la integridad de RNA: amplicones
diferenciales (modificacin del mtodo de evaluacin de integridad de RNA por RT-qPCR). La revisin
se realiz mediante el anlisis de correspondencia de resultados obtenidos en antecedentes similares con el
mtodo modificado, corroborando ventajas y desventajas del mismo.

2.1 Mtodo modificado.

2.1.1 Amplicones diferenciales. Bjrkman y colaboradores desarrollaron en 2016 un nuevo mtodo para
evaluar la integridad del RNA, la amplificacin diferencial (Amp) de un marcador Endgeno Resistente
RNasa (ERR: COI, COX1, MTCO1) respecto a un gen de referencia, opcionalmente combinado con la
medicin de dos amplicones de diferentes longitudes. Ellos validaron la aproximacin de Amp por la
medicin de la degradacin de mRNA de material biolgico no protegido expuesto al aire a temperatura
ambiente, bajo condiciones con RNasas activas, exposicin al calor, luz UV y formalina.

2.1.2 Degradacin de RNA por RNAsa I y ribonucleasas. La degradacin de RNA de clulas HeLa
lisadas mediante adicin de RNasa I se realiz de acuerdo al protocolo descrito (Bjrkman, 2016). En
resumen, clulas HeLa fueron lisadas, re-suspendidas, y repartidas en dos grupos de seis alcuotas (40 L)
mezcladas con diferentes concentraciones de RNasa I (0,005 0,125 U/L) y buffer Tris-HCl. Las
alcuotas fueron incubadas por 30 segundos a temperatura ambiente y la reaccin detenida por adicin de
-mercaptoetanol e inmediatamente sometida a separacin en columna y extraccin de RNA total con kit
comercial. La integridad del RNA se evalu utilizando electroforesis en gel automatizada (Sistema
Experion, Bio-Rad, Inc.). Se sintetiz cDNA a partir de diluciones del RNA extrado usando kit comercial
en un sistema qPCR Mx3005P (Agilent Technologies, Inc.). Todos los cDNA se analizaron utilizando
ensayos validados de qPCR dirigidos a marcador humano ERR y gliceraldehdo-3-fosfato deshidrogenasa
(GAPDH). Esta y todas las qPCR se realizaron con kit comercial que contena SYBR Green.
La degradacin por ribonucleasas se realiz con el fin de estudiar el efecto en tejidos, para esto utilizaron
dos hgados de ratn congelados. Un hgado se seccion en seis cortes de tamaos similares en presencia
de hielo. El otro hgado se tritur en polvo fino en presencia de hielo seco utilizando un mortero. Los
cortes de hgado y el polvo se expusieron a temperatura ambiente (cortes: 0, 10, 20, 40, 60, 120 min,
polvo: 0, 1, 5, 10, 20, 40, 60, 90, 120 min) se homogenizaron y se extrajo RNA con kit comercial. Como
antes, la integridad del RNA se estim mediante sistema Experion. Se sintetiz cDNA a partir de
diluciones del RNA extrado usando kit comercial en un sistema qPCR Mx3005P. Todos los cDNA se
analizaron utilizando ensayos validados de qPCR dirigidos a marcador ERR de ratn, ciclofilina A
(PPIA), GAPDH y protena de activacin de tirosina 3/triptfano 5-monooxigenasa (YWHAZ) todas los
anteriores de ratn.

2.1.3 Daos trmico, radiactivo y qumico. La degradacin de RNA mediante estos tratamientos se
realiz de acuerdo al protocolo descrito (Bjrkman, 2016). En resumen, dos alcuotas (100 L) de RNA
humano purificado fueron expuestas a luz ultravioleta (UV) (alcuota 1) o calor de 95 C (alcuota 2)
durante 60 min. Se retiraron fracciones de 10 L de cada alcuota a 0 (antes de la exposicin), 1, 10, 20,
40 y 60 min. La integridad del RNA se evalu con sistema Experion. Se sintetiz cDNA a partir de cada
fraccin (UV o tratado trmicamente) usando kit comercial en sistema de qPCRCFP96 Bio- Rad, Inc.
Todos los cDNA se analizaron utilizando ensayos validados de qPCR dirigidos a marcador humano ERR,
beta-2-microglobulina humana (B2M) y rRNA 18S humano (18S), produciendo amplicones de mltiples
longitudes de para cada blanco.
Para la degradacin qumica se emple RNA total de hgado de rata, el cual se degrad en 17 L de
solucin de formalina (10%), tamponado a pH neutro a temperatura ambiente durante 0, 1, 10 , 20, 40, 60,
120 y 240 min. Se elimin la formalina mediante purificacin de RNA usando kit comercial. El RNA se
eluy con 20 L de agua libre de RNasa y se transcribi de forma inversa utilizando un kit comercial en
instrumento ViiATM 7 (Life Technologies, Inc.). El cADN de todas las muestras y controles se analiz
usando ensayos de validados qPCR dirigidos a beta-2-microglobulina de rata (B2 M), rRNA de rata 18S
(18S) y marcador (ERR) produciendo amplicones de mltiples longitudes de para cada blanco.

2.2 Estudios previos.

2.2.1 Degradacin enzimtica y radioactiva de RNA de la lnea celular HeLa S3. Con el fin de ampliar
las opciones para bio-bancos y laboratorios analticos que prueban la integridad del RNA, en 2015
Kofanova y colaboradores realizaron la comparacin entre dos mtodos de referencia en electroforesis
capilar. Se utilizaron muestras de RNA degradadas por calor, RNasa o luz UV. Tambin se evalu la
correlacin entre la medicin de la integridad del RNA degradado bioqumicamente y la integridad del
mRNA correspondiente, evaluada por RT-qPCR. La degradacin de RNA mediante estos tratamientos se
realiz de acuerdo al protocolo descrito (Olga Kofanova, 2015). En resumen, el RNA aislado de la lnea
celular HeLa S3 se someti a degradacin inducida por tres mtodos: calor (75 C), RNasa III e
irradiacin UV. La integridad del RNA se evalu en trminos de RIN (RNA Integrity Number)/RIS (RNA
Integrity Score) utilizando el Agilent Bioanalyzer 2100 y el sistema QIAxcel Advanced (Qiagen), o en
trminos de RT-qPCR para dos genes housekeeping. Las clulas HeLa S3 fueron cultivadas en medio
RPMI-20 con suero bovino fetal al 10% (FBS), lisadas y homogenizadas, el RNA total se extrajo
utilizando un kit comercial. La degradacin enzimtica de RNA se realiz mediante la adicin de 0,2
unidades de RNasa III manganeso dependiente ShortCut (la cual fue diseada para producir pequeas
secuencias de RNA de interferencia de 18-25 nt de longitud de doble cadena), buffer de reaccin, MnCl2 a
37C durante 0.5, 1.5, 3, 5 y 7 min. Las reacciones se detuvieron con EDTA 5 mM. La degradacin con
radiacin UV-C se realiz con muestras de RNA diluidas (RIN 10) a 320 ng/L, se prepararon 10 alcuotas
de 30 g en frascos Eppendorf de 1,5 mL. Las alcuotas fueron expuestas desde la parte superior a
diferentes tiempos de exposicin de radiacin UV-C en un horno UV (70 J/cm, 254 nm) a temperatura
ambiente dejando los viales abiertos (0, 50, 80, 120, 140, 155, 170, 185, 200 y 220 min). Cada una de las
diez fracciones se dividi posteriormente en cuatro alcuotas, que se volvieron a exponer durante un
tiempo diferente (0, 30, 60 o 120 min) a temperatura ambiente. Tambin se evaluaron cuatro alcuotas
adicionales que contenan un estndar interno de control de calidad (IBBL). Para la RT-qPCR se
analizaron 12 muestras de RNA degradadas por RNasa III y 20 muestras degradadas por irradiacin UV.
Se probaron dos genes housekeeping: -actina (ACTB, alta expresin) e hipoxantina fosforribosil-
transferasa 1 (HPRT1, baja expresin). La RT-qPCR se llev a cabo utilizando kit comercial con SYBR
Green.

2.2.2 Caracterizacin de la degradacin post mortem de RNA en hgado de ratn. Sampaio-Silva y

colaboradores en 2013 caracterizaron la degradacin del RNA en diferentes tejidos post mortem con el fin
de desarrollar un modelo matemtico que pueda ser utilizado como mtodo coadyuvante para una
determinacin de intervalo post mortem (IPM) ms preciso. Para este propsito, se realiz un anlisis
cintico de once horas del RNA total extrado de los tejidos viscerales y musculares de ratones. El perfil
de degradacin del RNA total y los niveles de expresin de varios genes de referencia se analizaron por
RT-qPCR. La caracterizaron de la degradacin del RNA se realiz de acuerdo al protocolo descrito
(Fernanda Sampaio-Silva, 2013). Brevemente, se colectaron el hgado de cinco ratones Balb/c, cada uno,
fue cortado en 12 pedazos (5-20 mg) correspondientes con un punto de tiempo y almacenados a 21 C en
condiciones de esterilidad controlada por 11 horas post mortem. El aislamiento de RNA total se realiz
mediante kit comercial (tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo), homogenizacin mecnica, digestin
con DNasa y se re-suspensin con agua ultrapura. La integridad del RNA de cada muestra se evalu
mediante el sistema ExperionTM (Bio-Rad Laboratories, USA). Se realiz la retrotranscripcin a cDNA de
todas las muestras de RNA utilizando kit comercial en sistema Mastercycler (EppendorfH). Todas las
muestras de cDNA se almacenaron hasta el anlisis RT-qPCR. Se evalu la expresin de cinco genes de
referencia estables comnmente utilizados (Actb, Gapdh, Hprt, Cyp2E1 y Ppia). Tambin se incluy la
protena ribosomal S29 (RPS29) como gen de referencia.

2.2.3 Anlisis de la degradacin trmica de RNA de tejido heptico humano. Gingrich y colaboradores
en 2008 analizaron cmo la degradacin del RNA afecta la capacidad de detectar confiablemente
diferencias en la expresin gnica utilizando qPCR y anlisis de microarreglos. El anlisis se realiz de
acuerdo al protocolo descrito (Jeff Gingrich, 2017). En resumen, se obtuvieron muestras de RNA (1
mg/mL) de tejido heptico humano (control) y de la lnea celular HEPG2 de carcinoma heptico humano.
Estas muestras se diluyeron a 0,1 mg/mL en buffer TE y se incubaron a 90 C entre 5 (controles) a 7 horas
(lnea de carcinoma). Se tomaron alcuotas en varios momentos durante la incubacin y se evalu el grado
de degradacin del RNA con el sistema ExperionTMBio-Rad. El RNA se retrotranscribi en cDNA usando
kit comercial. El cDNA se amplific con kit comercial que contena SYBR Green primers para rRNA
18S, -actina, -tubulina, hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT) o Gliceraldehdo-3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH) usando un sistema qPCR iCycleriQ.

2.2.4 Evaluacin de la degradacin qumica de RNA en tejidos de bazo e hgado de rata. von Ahlfen y
colaboradores en 2007 presentan una evaluacin sistemtica de los parmetros ms relevantes para la
integridad y uso del RNA obtenido de muestras de fijadas como FFPE (formalin-fixed paraffin-
embedded), incluyendo el tiempo y las condiciones de almacenamiento, el tiempo de fijacin y el tamao
de la muestra. El anlisis se realiz de acuerdo al protocolo descrito (von Ahlfen S, 2007). Brevemente, se
tomaron muestras de tejido de hgado de ratas Wistar adultas, se fijaron inmediatamente en solucin
neutra de buffer de formalina al 10% durante la noche (20-24 h) a temperatura ambiente, posteriormente
deshidratadas y embebidas en parafina durante 2-3 horas a 60C. Para el aislamiento de RNA se utiliz un
kit comercial para FFPE, se evalu la integridad mediante sistema 2100 BioAnalyser, Agilent
Technolologies. Para los ensayos de RT-PCR se disearon primers para generar amplicones de diferentes
longitudes de mRNA de HPRT y RPL4de rata. Se realiz la RT-PCR en un solo paso utilizando un kit
comercial, los productos se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa.

3. Resultados y discusin.

3.1 Degradacin por RNasas y radiacin UV.

La integridad del RNA obtenido a partir del lisado de clulas HeLa sometidas a tratamiento con RNAsa I
en el ensayo del mtodo modificado fue monitoreada a travs de electroforesis capilar mediante el sistema
Experion (medido como RQI) y RT-qPCR midiendo el gen de referencia GAPDH y la estabilidad del
marcador ERR (Fig. 1a). Como se esperaba, el aumento en la concentracin de RNasa I produjo una
disminucin del RQI en el RNA evaluado (casi dos unidades). Tambin se observ un aumento en el valor
de Cq para la amplificacin del gen GAPDH (de 14 a 17 aprox.), mientras que el valor de Cq para el
marcador ERR permaneci casi invariable. Esta diferencia en el ciclo de inicio de amplificacin conforme
se aument la concentracin de RNAsa I, sugiere que el material de partida para GADPH fue afectado por
la accin de la enzima, la cual produjo fragmentacin del mRNA, posterior retro-transcripcin limitada y
bajo emparejamiento con los primers utilizados para la amplificacin del gen de referencia. Por otra parte,
el marcador ERR mostr valores similares de Cq gracias a que no se vio afectado por la RNasa I. Este
marcador, al hacer parte del sistema de sntesis de DNA mitocondrial (mtDNA), posee una secuencia de
RNA mitocondrial mensajero (mt-mRNA) que no se degrada por efecto de la RNasa I, como s lo podran
hacer otras enzimas mitocondriales: Suv3 helicasa y PNPasa (Roman J. Szczesny, 2012). El efecto de la
RNasa I fue comparado midiendo los niveles del gen de referencia con el del marcador ERR como:

AmpERR: AmpERR = CqRG CqERR,

El cual fue normalizado a la cantidad de mRNA inicial como:

AmpERR(RNasa) = AmpERR([RNase]) AmpERR ([RNase] = 0),

El cual se contrasta frente a RQI y [RNasa I] (Fig. 1b). De esta comparacin se observa que la
disminucin de RQI desde aproximadamente 9,5 hasta 7,3 equivale a un aumento de AmpERR de 3 ciclos,
reflejando una degradacin de casi 66% del mRNA de GAPDH. Por lo tanto, el aumento de Cq de
GAPDH con el tiempo refleja la degradacin de mRNA.

Fig. 1. Cq y RQI contrastados frente a [RNasa I] (A). AmpERR(RNasa) = AmpERR([RNase]) AmpERR ([RNase] = 0) y
RQI contrastado frente a [RNasa I] (B).

Con respecto al mtodo antecedente, la degradacin de RNA por accin de la RNasa III fue evaluada a
travs del sistema de electroforesis capilar Agilent y RT-qPCR (Fig. 2). En estos ensayos puede
observarse una tendencia similar a la advertida en el mtodo modificado. Inicialmente las mediciones de
la integridad de RNA frente a los tiempos de exposicin a RNasa III muestra que los valores de RIN (los
cuales son equivalentes a RIQ (Olga Kofanova, 2015) se encuentran dentro del rango de los valores
observados en el mtodo modificado, aprox. entre 7 y 10 para un tiempo entre 0 y 1 minuto, esto
desconoce (por lo menos hasta antes del primer minuto) la concentracin mxima de enzima utilizada en
cada ensayo: 0,12 U/L en el ensayo modificado y 0,2 U en el mtodo antecedente. Con respecto a la gran
correlacin inversa observada entre Ct del gen de referencia ACTB de alta expresin versus RIN
(89,6%), se observa que es congruente con los hallazgos del mtodo modificado, ya que podemos inferir
la misma tendencia de aumento de Ct a la vez que se tiene un RIN bajo y viceversa, esto sugiere que la
disminucin del RIN desde aproximadamente 10 hasta 3, equivale a un aumento de casi 2,3 ciclos de Ct,
pero a diferencia del mtodo modificado, no podemos concluir que esto refleje una degradacin de mRNA
de ACTB, sino del RNA total (superior al 100%).
Fig. 2. Mediciones de la integridad del RNA en funcin de la RNasa III (n = 6 para cada punto de tiempo). Cada smbolo en el
grfico corresponde a una muestra diferente (Izquierda). Correlacin entre RIN y valores de Ct para el gen control de alta
expresin ACTB en 12 muestras de ARN degradado por RNase III (Derecha).

La degradacin de RNA humano inducida por radiacin UV no mostr ningn efecto sobre RQI durante
la exposicin por 60 min (Fig. 3), lo que sugiere que qued intacto. Cuando se compar el efecto de la
radiacin mediante Amp qPCR, monitoreando las longitudes de cDNA producido mediante amplicones
cortos (S~100 pb), medios (M, 100-200 pb) y largos (L, 300 bp) comparando las cantidades producidas
por pareja. En este ensayo y para los dems que utilizaron medicin con amplicones de diferentes
longitudes, los autores definieron Amp como:

AmpX-Y = CqX - CqY

(Donde X es L = amplicon largo o M = medio y Y es M = amplicon medio o S = corto), y

AmpX/Y = AmpX-Y (t = 0) - AmpX-Y (t).

Se midieron AmpX-Y para las tres combinaciones de longitudes de amplicn (L-S, L-M, M-S) para el gen
de referencia B2-M. De estas mediciones, se encontraron tendencias diferentes a las observadas en los
anteriores ensayos. La degradacin se monitoreo para los genes de referencia B2M (Fig. 3), 18S y el
marcador ERR. La degradacin del RNA a travs de radiacin UV no mostr cambios significativos de
RQI, pero s con RT-qPCR, en el que se mostr un dao severo del RNA total relacionado con el nmero
de ciclos de AmpX-Y, es decir la tardanza en iniciar la amplificacin o bajo rendimiento de la misma. Se
realizaron confirmaciones de la degradacin mediante el sistema Agilent y electroforesis en gel, adems se
increment el tiempo de exposicin (120 minutos) y la intensidad de la radiacin, estos ajustes no fueron
suficientes para estimar la variacin en el dao. Estos acontecimientos sugieren que la robustez del
sistema de electroforesis debe ser revisada para este tipo de tratamiento de almacenamiento.

Con respecto al mtodo antecedente, la degradacin de RNA por radiacin UV-C fue evaluada a travs del
sistema de electroforesis capilar Agilent y RT-qPCR (Fig. 4). En estos ensayos observ una tendencia
ligeramente diferente a la obtenida en el mtodo modificado. Las mediciones de la integridad de RNA
frente a los tiempos de radiacin UV-C muestran que los valores de RIN disminuyen tan solo despus de
150 minutos, lo que concuerda con los datos obtenidos en el mtodo modificado (en el cual inclusive
despus de 120 minutos de radiacin no fue posible observar variacin apreciable a baja intensidad),
posteriormente y gracias a una aparente mayor intensidad de la radiacin (70J/cm), los valores de RIN
descienden entre 2 y 4. Por otra parte, al igual que con el mtodo modificado, en este ensayo se corrobora
que la radiacin UV induce dao al RNA y que interfiere con su cuantificacin por RT-qPCR. Esto es
apreciable al observar la gran correlacin inversa entre Ct del gen de referencia ACTB de alta
expresin versus RIN (93,1%), la cual sugiere que el aumento de Ct es inversamente proporcional a la
disminucin de RIN.

Fig. 3. RNA humano purificado expuesto a la radiacin UV. RQI contrastado contra AmpERR para B2M (A). El tiempo de
exposicin representado frente a AmpERR para B2M (D).

Fig. 4. Mediciones de la integridad del RNA en funcin del tiempo de exposicin a radiacin UV C (n = 6 para cada punto de
tiempo). Cada smbolo en el grfico corresponde a una muestra diferente (Izquierda). Correlacin entre RIN y valores de Ct para
el gen control de alta expresin ACTB en 12 muestras de ARN degradado por radiacin UV C (Derecha).

3.2 Degradacin por ribonucleasas a temperatura ambiente.

Al igual que la degradacin por RNasa, la exposicin prolongada de muestras a la temperatura ambiente,
permite obtener una degradacin consistente del RNA. La Fig. 5 muestra que el RNA extrado del tejido
heptico en polvo sometido a temperatura ambiente se degrada casi un 70% en menos de 60 minutos.
Posteriormente se estabiliza a un RQI entre 3 y 4. Esto sugiere que la mayor parte de la degradacin
ocurre antes de 60 minutos y el remanente es poco o nada.
Fig. 5. Cq y RQI representados grficamente frente al tiempo a temperatura ambiente para tejido en polvo (A). AmpERR(t) =
AmpERR(t = 0) - AmpERR(t) y RQI representado en funcin del tiempo a temperatura ambiente para tejido en polvo (C).

En contraste a los valores de RQI, la RT-qPCR para tres genes referentes muestra degradacin progresiva
hasta los 120 minutos. Los Cq de los genes de referencia se incrementan sugiriendo degradacin de su
mRNA. Como antes, se observ el mismo comportamiento del marcador ERR. La comparacin mediante
AmpERR(t) = AmpERR(t = 0) - AmpERR(t) con RQI, muestra que mientras AmpERR aumenta durante
el transcurso del ensayo, RQI se degrada durante los primeros 60 minutos aproximadamente un 60%,
AmpERR (PPIA-ERR) aumenta 8 ciclos, lo cual corresponde a una diferencia de 256 veces (= 28). Por lo
tanto, la sensibilidad de AmpERR es suficiente para detectar una prdida de 99,7% (= 1 - 1/256) de la
cantidad de las transcripciones iniciales post muestreo (Bjrkman, 2016).

La evaluacin de la integridad del RNA post mortem efectuada en el artculo antecedente (Fig. 6),
confirma mediante correlacin inversa entre el tiempo y RQI, la degradacin del RNA, de modo que a
mayor paso del tiempo, menor integridad del RNA, esto debido a mltiples factores que inducen la
degradacin del mismo, entre ellos la accin de las ribonucleasas (Olga Kofanova, 2015). El anlisis
cintico durante un perodo de once horas no mostr diferencias significativas en los niveles de RQI
durante las primeras 2 horas post mortem, pero dista mucho de las observaciones del mtodo modificado,
en el cual en la primera hora ya ha sufrido una degradacin cercana al 60%, mientras en este ensayo
permanece por debajo del 20% dentro de la primera hora.

Fig. 6. Evaluacin del perfil de degradacin del RNA total recuperado de las muestras de tejido de hgado. En diferentes periodos
de tiempo post mortem (0-11 h) por electroforesis de RNA. Para cada tejido, el indicador de calidad de RNA (RQI) se representa
frente al intervalo post mortem (L-escala de RNA de una sola hebra) (C). Se muestran correlacin de Pearson (r) y valor p
(derecha).
3.3 Degradacin trmica.

Es ampliamente reconocido que el RNA es degradado por calor, por lo que los autores esperaban que el
marcador ERR, el cual mostr resistencia a la degradacin por RNasas, fuera sensible al calor, como lo
muestra la Fig. 7. Esto se esperaba, ya que el tratamiento trmico ignora la naturaleza qumica del RNA,
de esto se desprende que los valores de AmpERRX-Y sean progresivos y elevados, sugiriendo alta
degradacin de mtRNA y mt-mRNA de ERR.

Fig.7. RQI trazado frente AmpERR para el marcador ERR (B). Tiempo de incubacin trazada contra AmpERR para el
marcador ERR (E).

Los resultados del ensayo antecedente con respecto a este tipo de degradacin muestran la misma
tendencia observada en el mtodo modificado. La Fig. 8 muestra los electroferogramas de la muestra de
tejido de hgado humano sometida a una temperatura de 90 C e intacta.

Fig. 8. Electroferogramas de la degradacin trmica de RNA (Izquierda). Degradacin trmica de RNA impacto en RT-qPCR
(Derecha).

La identificacin inequvoca de los dos picos correspondientes a 28S y 18S confirman la integridad del
RNA, mientras que despus de 1 hora de incubacin se divisa la deformacin del pico 28S,
correspondiente con la perdida de integridad. De igual forma la evaluacin de la expresin de genes
referentes por RT-qPCR confirma los valores de RQI obtenidos en el mtodo modificado (cercanos a 2),
adems se corrobora el aumento de los valores de Ct conforme se da la perdida de integridad de RNA,
siendo para este caso el gen de mayor integridad, el 18Sy HPRT el de menor.
3.4 Degradacin qumica.

La degradacin qumica del RNA inducida por formalina tanto para el gen de referencia B2M como para
el marcador ERR permiti observar patrones similares (Fig. 9). En ambos casos se aprecia un descenso
aproximado de 80% en la integridad de RNA. En contraste, AmpX-Y para B2M fue mayor que el del
marcador ERR, esto sugiere que el mRNA de B2M estuvo ms expuesto al fijador por hacer parte del
citosol o membranas, mientras que el mt-mRNA de ERR no, por hacer parte de mitocondrias. AmpX-Y
de ERR solo se increment despus de 240 min, tiempo en el que la formalina pudo haber fijado las
mitocondrias.

Fig. 9. RQI y AmpX-Y para B2-M (A) y marcador ERR (B) en funcin del tiempo expuesto a formalina.

Resultados similares son observados en el ensayo antecedente con respecto a este tipo de degradacin. La
Fig. 10 exhibe en su orden: electroferograma y RT-PCR de un paso de las muestras de tejido de ratones
fijadas y cortadas dentro de los 3 das siguientes a la incorporacin en parafina (T0). El electroferograma
muestra las seales tpicas de RNA intacto, 18S y 28S rRNA, indicando poca o ninguna degradacin
despus de la fijacin con FFPE. Esto es contrario a lo encontrado en el mtodo modificado, ya que la
variacin de RQI en ste ltimo corresponde a casi un 80% de degradacin de RNA. Esto sugiere que tal
efecto lo provoca la inclusin en parafina. El gel de agarosa realizado para constatar el RT-PCR de un
paso, muestra la amplificacin el gen HPRT de rata, produciendo amplicones de diferentes longitudes
entre 100 a 1100 nucletidos. Lo que sugiere poca o ninguna degradacin de RNA, que comparado con
das posteriores, no se logran obtener amplicones (1100 nt).

4. Conclusin.

El mtodo modificado de evaluacin de la integridad de RNA mediante amplicones diferenciales tiene

potencial para discriminar entre integridad de rRNA, mRNA y RNA total, la alta sensibilidad, practicidad,
el bajo requerimiento de reactivos o insumos extra (no requiere extracciones adicionales) y la alta
autonoma de optimizacin, lo hacen una herramienta que vale la pena probar en la evaluacin de la
integridad de RNA.

Las pruebas efectuadas para evaluar la integridad del RNA despus de ser sometido a degradacin
concuerdan con hallazgos de estudios anteriores y los aventaja en que se facilita la identificacin de
transcriptos de mRNA que puedan presentar degradacin.
Fig. 10. Integridad del RNA aislado de las muestras frescas de FFPE. RT-PCR con RNA de muestras de FFPE frescas.

5. Referencias.

Benedikt Kirchner, V. P. (2014). mRNA and microRNA Purity and Integrity: The Key to Success in Expression
Profiling. En Quantitative Real-Time PCR: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology (pg. 11). New
York: Springer Science+Business Media .

Bjrkman, J. D. (2016). Differential amplicons (DAmp)a new molecular method to assess RNA integrity.
Biomolecular Detection and Quantification, 8.

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